1.本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种鉴别蚂蟥及其制品的特异性引物及鉴别方法。


背景技术：

2.2015年版《中国药典》规定水蛭为水蛭科动物蚂蟥、水蛭或柳叶蚂蟥的干燥全体的炮制加工品。现代中医学认为水蛭属活血化瘀药下属分类的活血调经药，可以抑制血小板的释放、降低血脂、抑制成纤维细胞增殖；用于防治血栓疾病、控制癌症细胞转移与增值等。水蛭的功效与其抗凝血作用密切相关，其中最重要的、疗效最好的抗凝血活性物质是水蛭素(hirudin)，它是迄今为止世界上最有效和最安全的天然凝血酶抑制剂，具有极高的药用价值。
3.随着近年来水蛭的中药制剂的不断开发，水蛭的市场需求增加，导致中药水蛭的资源极度紧缺，目前市场上蚂蟥较为普遍，蚂蟥属于水蛭的其中一种品种。然而，蚂蟥的生产缺乏行业规范，来源混乱，存在着严重的蚂蟥与其他基源的水蛭混淆用药问题，由于蚂蟥与其他基源的水蛭在药理作用上存有差别，以及混伪品、掺伪品在药材市场的流通，严重影响了临床用药的安全与疗效。为了临床用药安全、准确和有效，针对外形相近的蚂蟥与其他基源的水蛭建立一种有效准确的鉴定方法成为已经成为迫在眉睫的需求。
4.目前，蚂蟥的鉴别准确性存疑，可控性差；此外，经过炮制加工后的蚂蟥粉类制品在鉴别时无法直接对干粉进行鉴别，操作复杂。


技术实现要素：

5.为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鉴别蚂蟥及其制品的特异性引物，本发明所述的特异性引物对特异性良好，可有效将蚂蟥与其他基源的水蛭和其常见伪品进行区分，快速、简便，提高了检测效率和准确度。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的目的一是：公开了一种鉴别蚂蟥及其制品的特异性引物，由引物kta-f和引物kta-r组成，所述引物kta-f和引物kta-r均为单链dna分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1(5
′
tttgcttacttctttcacta3
′
)和序列2(5
′
acacccttcgtatcaagt3
′
)。
7.本发明的目的二是：公开了上述所述特异性引物在鉴别蚂蟥及其制品中的应用，所述应用包括：(1)结合上述所述的引物检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有对应的水蛭品种——蚂蟥；(2)结合上述所述的引物检测或辅助检测待测样品是否为或候选为对应的水蛭品种——蚂蟥。
8.本发明的目的三是：公开了一种鉴别蚂蟥及其制品的方法，主要步骤包括：(1)提取待测样品的总dna；
(2)以提取的dna为模板，配制pcr反应体系，设置扩增程序，采用权利要求1所述的特异性引物进行pcr扩增；(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像的结果对蚂蟥及其制品进行特异性鉴别。
9.优选的，步骤2中所述的pcr反应体系为：总体积为20μl时，2
×
taq pcr mix(预混试剂，包含dna聚合酶、dntps、mgcl2、反应缓冲液)10μl、0.25umol/l的引物kta-f 0.4μl、0.25umol/l的引物kta-r 0.4μl、dna模板2μl、无菌双蒸水补齐20μl。
10.优选的，步骤2中所述的扩增程序为：95℃预变性4min，95℃30s、50℃30s、72℃30s循环35次，72℃延伸5min，4℃保温。
11.优选的，步骤3中所述根据凝胶成像的结果对蚂蟥及其制品进行特异性鉴别，包括：(1)当在相应的位置上观察到单一明亮条带，则鉴定待测样品中含有或候选含有对应的水蛭品种——蚂蟥；当未观察到单一明亮条带，则鉴定待测样品中不含有或候选不含有对应的水蛭品种——蚂蟥；(2)当在相应的位置上观察到单一明亮条带，则鉴定待测样品为对应的水蛭品种——蚂蟥；当未观察到单一明亮条带，则鉴定待测样品不是对应的水蛭品种——蚂蟥。
12.有益效果与现有技术相比，本发明的有益效果是：首先，本发明公开了一对新的引物，所述引物特异性良好，可以用于快速、准确的鉴别水蛭品种真伪，可有效将蚂蟥和其基源的水蛭及其常见伪品进行区分，快速、简便，提高了检测效率和准确度。所述引物都是针对目标物种响应而不对其它品种产生非特异性反应。
13.其次，本发明还公开了一种鉴别蚂蟥及其制品的方法，所述的鉴别方法应用的是特异性pcr鉴别方法，特异性pcr鉴别方法基于snp位点差异，设计特异性引物，对蚂蟥和其他基源的水蛭及其常见伪品进行鉴别，该方法专属性强，结果准确，耐用性好，可以快速鉴别蚂蟥和其他基源的水蛭及其常见伪品。其次，本发明所述的鉴别方法还能够直接检测蚂蟥粉，操作简单、方便，实现了对蚂蟥粉的快速检测。
附图说明
14.图1：dna提取过程试剂盒的检测结果图；图2：taq酶的检测结果图；图3：不同引物考察结果图；图4：不同循环次数的考察结果图；图5：不同退火温度及延伸时间的考察结果图；图6：不同dna模板量的考察结果图；图7：普通taq酶的考察结果图；图8：高保真taq酶的考察结果图；图9：蚂蟥药材重复性考察结果图；图10：蚂蟥粉末重复性考察结果图
图11：蚂蟥粉末检出限结果图12：蚂蟥粉末验证结果图13：样品凝胶电泳图谱一；图14：样品凝胶电泳图谱二；图15：样品凝胶电泳图谱三。
具体实施方式
15.以下，将详细地描述本发明。在进行描述之前，应当理解的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义，而应当在允许发明人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上，根据与本发明的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此，这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的的优选实例，并非意图限制本发明的范围，从而应当理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以由其获得其他等价方式或改进方式。
16.以下实施例仅是作为本发明的实施方案的例子列举，并不对本发明构成任何限制，本领域技术人员可以理解在不偏离本发明的实质和构思的范围内的修改均落入本发明的保护范围。除非特别说明，以下实施例中使用的试剂和仪器均为市售可得产品。实施例
17.一种鉴别蚂蟥及其制品的方法：1.样品收集共收集各地水蛭药材20批，蚂蝗粉10批。经鉴定20批水蛭药材中蚂蟥7批，日本医蛭4批，其余批次为水蛭伪品。样品信息见表1。
18.表1.样品收集情况
本发明所述蚂蟥为水蛭科动物蚂蟥whitmania pigra whitman的干燥全体的炮制加工品。
19.炮制加工方法：(1)蚂蟥蚂蟥洗净，切断，干燥。取净蚂蟥段，用黄酒拌匀，闷润。将麦麸皮撒入热锅中，待冒烟时，倒入酒润蚂蟥丝，拌炒至表面呈黄色，有特殊气味逸出时，迅速取出，筛去焦麦麸，放凉。每100kg蚂蟥丝，用黄酒10kg、麦麸皮10kg。
20.(2)蚂蟥粉取净蚂蟥，除去杂质，洗净，干燥，置超微粉碎机中，粉碎成超微粉。
21.2.仪器与试剂试药分析天平(sartorius cp225d)，纯水仪，离心机(eppendorf)，迷你离心机
(minstar)，恒温混匀仪(瑞诚仪器有限公司，ts100)，ab梯度pcr仪(abi公司proflex)，凝胶成像系统(vilber公司quantumst5)，电泳仪(bio-rad公司bio-rad basice powerpac basic)，tissue dna kit(omega动物基因组dna提取试剂盒d3396-02)，dneasy blood&tissue kit(凯杰动物基因组dna提取试剂盒69504)，无水乙醇(分析纯)，引物(上海生工生物工程有限公司合成)，蚂蟥(中检院，批号：121061-201305)，琼脂糖(111860，biowest)，gelred(41003，biotium)。
22.3.特异性pcr检测方法的建立3-1.dna的提取(1)试剂盒的选择为保证dna提取效率，同时采用omega动物基因组dna提取试剂盒和凯杰动物基因组dna提取试剂盒提取供试品dna，采用动物通用引物coi扩增。
23.模板dna提取：取供试品(编号：sz-01、kt-01、kt-02、szwp-01、szwp-02、kt-03)约30～60mg，每份样品平行取样2份，分别用omega动物基因组dna提取试剂盒和凯杰动物基因组dna提取试剂盒提取，得模板dna溶液，置-20℃保存。
24.对照药材模板dna提取：取对照药材粉末约30mg，同供试品模板dna制备方法制成对照药材模板dna溶液。
25.(2)pcr扩增及电泳pcr反应在200μl离心管中进行，反应总体积为20μl，反应体系包括2
×
taq pcr mix 10μl，动物通用引物coi(0.25μmol/l)0.4μl，灭菌双蒸水8.2μl，dna模板1μl。将离心管置pcr仪中，反应参数：95℃预变性4min，循环反应35次(95℃30s，50℃30s，72℃1min)，72℃延伸7min，4℃保温。pcr扩增反应结束后，取pcr扩增产物4μl，于gelred染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，120v电压下电泳15min，电泳结束后，取凝胶片置凝胶成像仪上检视。
26.结果两种试剂盒均能提出模板dna，dna浓度并无显著差异，为节约试验成本，选用omega动物基因组dna提取试剂盒。结果见图1。
27.3-2.taq酶的考察为进一步保证测序质量，分别考察了普通taq酶(天根生化科技有限公司)和高保真taq酶(赛默飞生物科技有限公司)对pcr扩增条带的影响。
28.结果显示两种酶均能扩增出dna条带，高保真taq酶pcr条带更亮，扩增产物送农科院测序，为后续实验做准备。结果见图2。
29.普通taq酶样品信息：1、2.ry-01；3、4.kt-01；5、6.kt-02；7、8.szwp-01；9、10.szwp-02；11.kt-03；12.空白；13.marker。
30.高保真taq酶样品信息：1、2.ry-01；3、4.kt-01；5、6.kt-02；7、8.szwp-01；9、10.szwp-02；11.kt-03；12.空白；13.kt-03；14.marker。
31.3-3.特异性引物的设计与筛选(1)引物设计从genbank数据库中下载所有登陆的蚂蟥、日本医蛭及其常见伪品的coi序列，无coi序列的下载全基因组序列，与测序获得的序列共同使用bioedit软件进行同源对齐，手动校正后寻找差异性snp位点。通过primer premier 5.0软件设计出蚂蟥特异性鉴别引物4对，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物序列见表2。
32.表2.引物序列表(2)引物筛选取供试品(编号：ry-01、kt-01、kt-02、szwp-01、szwp-02、kt-03)模板dna，分别用上述4种引物进行扩增，扩增时退火温度的选择以引物合成时退火温度为参考依据。
33.反应总体积为20μl，反应体系包括2
×
taq pcr mix 10μl，引物(2.5μmol/l)10μl，灭菌双蒸水8.2μl，dna模板1μl。将离心管置pcr仪中，反应参数：95℃预变性5min，循环反应35次(95℃30s，引物a、d退火温度为50℃30s，引物b、c退火温度为45℃30s，72℃1min)，72℃延伸7min，4℃保温。pcr扩增反应结束后，取pcr扩增产物4μl，于gelred染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，120v电压下电泳15min，电泳结束后，取凝胶片置凝胶成像仪上检视。
34.结果显示蚂蟥(编号：kt-01、kt-02、kt-03)用引物a的扩增产物在400～600bp有较弱的单一条带，用引物d的扩增产物在400～600bp也有一较弱的单一条带，同时伴生较强的杂带，而日本医蛭(编号：ry-01)、菲牛蛭(编号：szwp-01)、东北小水蛭(编号：szwp-02)用引物a和引物d的扩增产物在400～600bp无明显条带。所有供试品用引物b和引物c的扩增产物均未见明显条带。因此选择引物a、d继续进行试验条件优化。具体结果见图3。图中：1、2.ry-01；3.kt-01；4.kt-02；5、6.szwp-01；7.szwp-02；8.kt-03；9.marker；10.空白对照。
35.(3)不同循环数的考察当pcr反应体系为35个循环时，引物a和引物d在400～600bp有条带，但条带较弱，因此增加引物a和引物d循环次数，分别增加5个循环提高目的条带的亮度。
36.电泳检测结果显示蚂蟥(编号：kt-01、kt-02、kt-03)用引物a的扩增产物在400～600bp的单一条带变亮，但伴生杂带，蚂蟥(编号：kt-01、kt-02、kt-03)用引物d的扩增产物在400～600bp的单一条带无显著变化，但非特异性条带亮度增加，而日本医蛭(编号：ry-01)、菲牛蛭(编号：szwp-01)、东北小水蛭(编号：szwp-02)用引物a和引物d的扩增产物在400～600bp均无明显条带。表明引物d的特异性不高，应选择引物a继续进行试验条件优化，同时从测定结果可见增加循环数后扩增产物的主条带变亮，但杂带较多，因此不再通过改变循环次数调整扩增产物质量。结果见图4。图中：1、2.ry-01；3.kt-01；4.kt-02；5、6.szwp-01；7.szwp-02；8.kt-03；9.空白；10.marker。
37.3-4.退火温度及延伸时间考察引物a在退火温度为50℃30s，72℃1min，72℃延伸7min 35个循环的扩增条件下虽然主条带较弱，但均为单一条带；增加5个循环后，主条带变亮，但杂带较多，因此不考虑增加循环次数，可以尝试提高退火温度，减少延伸时间提高主条带亮度。
38.分别设置50℃、53℃和55℃，考察不同退火温度对扩增的影响，筛选最佳退火温度，延伸时间由原来的72℃1min，35个循环，72℃延伸7min调整为72℃30s，35个循环，72℃
延伸5min，考察延伸时间对扩增的影响。
39.结果表明退火温度在50℃，72℃30s，72℃延伸5min，35个循环时，蚂蟥(编号：kt-01、kt-02、kt-03)的扩增产物在400～600bp的单一条带变亮，且无伴生杂带，而日本医蛭(编号：ry-01)、菲牛蛭(编号：szwp-01)、东北小水蛭(编号：szwp-02)的扩增产物在400～600bp均无明显条带。结果见图5。图中：1、2.ry-01；3.kt-01；4.kt-02；5、6.szwp-01；7.szwp-02；8.kt-03；9.marker。
40.3-5.模板量的考察对20μl反应体系中的模板dna量进行考察，分别加入1μl、2μl和3μl模板dna,比较不同模板条件下，特异性条带的亮度。
41.结果表明加入模板dna 1～3μl蚂蟥(编号：kt-01、kt-02、kt-03)的扩增产物在400～600bp都有单一条带，其中2μl时扩增条带最亮，随着模板量的增加条带明亮趋势不明显，因此确定pcr反应体系中dna模板的加入量为2μl。而日本医蛭(编号：ry-01)、菲牛蛭(编号：szwp-01)、东北小水蛭(编号：szwp-02)的扩增产物在400～600bp均无明显条带结果见图6。图中：1、2.ry-01；3.kt-01；4.kt-02；5、6.szwp-01；7.szwp-02；8.kt-03；9.空白；10.marker。
42.3-6.taq酶二次考察分别考察了普通taq酶(天根生化科技有限公司)和高保真taq酶(赛默飞生物科技有限公司)对pcr扩增条带的影响。
43.pcr反应在200μl离心管中进行，反应总体积为20μl，普通taq酶反应体系包括2
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taq pcr mix 10μl，引物a(0.25μmol/l)0.4μl，灭菌双蒸水7.2μl，dna模板2μl；高保真taq酶反应体系包括platinum superfi pcr master mix 10μl，gc 1μl，引物a(0.25μmol/l)1μl，灭菌双蒸水5μl，dna模板2μl。将离心管置pcr仪中，反应参数：95℃预变性4min，循环反应35次(95℃30s，50℃30s,72℃30s)，72℃延伸5min，4℃保温。pcr扩增反应结束后，取pcr扩增产物4μl，于gelred染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，120v电压下电泳15min，电泳结束后，取凝胶片置凝胶成像仪上检视。
44.结果显示两种酶均能在扩增出dna条带，高保真taq酶pcr条带亮度更高，但高保真酶成本较高，为减少实验成本，选用普通taq酶。结果见图7、8。
45.3-7.蚂蟥药材重复性试验取样品(编号：kt-03)适量，剖开洗净，依次用75％乙醇、灭菌超纯水清洗，吸干表面水分，平行取样6份，每份约60mg，置1.5ml离心管中，用omega动物基因组dna提取试剂盒提取，即得，按确定的方法和条件进行测定。
46.测定方法，主要步骤包括：(1)提取待测样品的总dna；(2)以提取的dna为模板，配制pcr反应体系，设置扩增程序，采用权利要求1所述的特异性引物进行pcr扩增；(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像的结果对蚂蟥及其制品进行特异性鉴别；当在相应的位置上观察到单一明亮条带，则鉴定待测样品中含有或候选含有对应的蚂蟥及其制品；当未观察到单一明亮条带，则鉴定待测样品中不含有或候选不含有对应的蚂蟥及其制品；当在相应的位置上观察到单一明亮条带，则鉴定待测样品为对
应的蚂蟥及其制品；当未观察到单一明亮条带，则鉴定待测样品不是对应的蚂蟥及其制品。
47.结果见图9。结果显示该方法重复性良好。
48.3-8.蚂蟥粉重复性试验取蚂蟥粉(编号：szf-03)适量，平行取样6份，每份约30mg，置1.5ml离心管中，用omega动物基因组dna提取试剂盒提取，即得，按确定的方法和条件进行测定。结果显示6份供试品均能扩增出目的条带，该方法重复性良好。结果见图10。
49.3-9.蚂蟥粉检出限试验为了考察建立方法的检测灵敏度，在未检出与对照药材相应条带的样品(编号：szf-03)中添加不同量的菲牛蛭(szwp-01)，添加比例分别为5％、12.5％、25％、37.5％、50％、62.5％、75％、87.5％。电泳检测结果表明含蚂蝗粉12.5％以上均可检出。结果见图11、12。
50.3-10.总结通过对引物的筛选，以及影响pcr反应的关键因素taq酶、循环次数、退火温度、延伸时间及dna模板用量的考察，最终确定蚂蟥及其制品的特异性pcr反应体系为：反应总体积20μl，反应体系包括2
×
taq pcr mix(预混试剂，包含dna聚合酶、dntps、mgcl2、反应缓冲液)10μl，引物a(2.5μmol/l)上下游各0.4μl，灭菌双蒸水7.2μl，dna模板2μl。将离心管置pcr仪中，反应参数：95℃预变性4min，循环反应35次(95℃30s，50℃30s，72℃30s)，72℃延伸5min，4℃保温。
51.4.样品测定使用建立好的方法对收集到的20批药材和10批蚂蝗粉进行特异性pcr扩增，结果7批蚂蟥药材和9批蚂蝗粉与蚂蟥对照药材凝胶电泳谱图相应的位置上，在400～600bp有特异性单一明亮条带，其余样品无条带。具体实验结果见图13、14、15和表3。
52.表3.样品测定结果
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。