1.本发明属于一种生物酶复合物技术领域，具体涉及一种生物酶复合物及应用于植物提取过程中的方法。


背景技术：

2.花青素是一种水溶性色素，可以随着细胞液的酸碱改变颜色。细胞液呈酸性则偏红，细胞液呈碱性则偏蓝。花青素是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一。花青素为植物二级代谢产物，在生理上扮演重要的角色，常见于花、果实的组织中及茎叶的表皮细胞与下表皮层。花青素是具有亲水性和水溶性的多酚类植物色素及其代谢产物，是重要的抗氧化剂之一，具有广泛的药理特性，如抗氧化、抗衰老、抗炎、抗菌和抗癌，因此，在医药、食品等领域具有巨大的应用潜力。
3.由于花青素在加工过程中很不稳定，易受多种不同外部条件影响，为了提取植物中花青素的过程中，为了提高花青素的稳定性，需要对其进行修饰定向。修饰方法通常有糖基酰基化、糖基化、微胶囊化、金属螯合、脂质体和纳米粒子载覆等，从营养学角度分析，普通的化学修饰定向性差，而生物酶法反应过程不会对花青素分子造成破坏，具有更高的安全性，更符合农业食品安全要求，而且生物酶具有高度选择性和专有性。因此，需要研发出一种生物酶复合物及应用于植物提取过程中的方法，提高植物提取花青素过程中花青素的热稳定性、光稳定性和耐酸碱稳定性。


技术实现要素：

4.发明目的：为了克服以上不足，本发明的目的是提供一种生物酶复合物及应用于植物提取过程中的方法，通过生物酶复合物可以对花青素进行改性，引入酰基，提高花青素的稳定性，并且对花青素的提取方法进行改进，提高了花青素的提取率，且提取时间短，可操作性强，前景广泛。
5.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种生物酶复合物，所述生物酶复合物包括酰基供体、催化酶复合物、反应溶剂、4a分子筛；每1mg的花青素粉末，加入8-10g的酰基供体，加入1-2ml的催化酶复合物，加入35-40ml的反应溶剂，加入0.03-0.05g的4a分子筛；所述酰基供体为琥珀酸、苹果酸、草酸、苯甲酸甲酯、水杨酸甲酯、肉桂酸甲酯、没食子酸甲酯的一种或几种的混合；所述催化酶复合物包括催化酶、酶催化酰基化反应溶剂，所述催化酶为南极假丝酵母脂肪酶、amano 脂肪酶 ps、米曲霉脂肪酶、猪胰腺脂肪酶的一种或几种的混合，所述酶催化酰基化反应溶剂为吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮的一种或几种的混合；所述反应溶剂为50%的乙醇，所述4a分子筛为干燥活化4a分子筛。
6.花青素易受光、热、酸碱度、金属离子等因素影响， 在储存和加工过程中会存在一定程度的降解， 降低其生物活性，本发明所述的生物酶复合物，配方设计合理，用于植物提取花青素的酰基化修饰，通过生物酶复合物可以对花青素进行改性，引入酰基，改性后的花
青素对于光照和温度都表现出较高的稳定性， 花青素在酸性条件下也较为稳定，除了fe3+，改性后的花青素对cu2+、 mn2+、 ca2+、 al3+、fe2+的稳定性均强于未改性的花青素。
7.进一步的，上述的生物酶复合物，所述催化酶复合物为南极假丝酵母脂肪酶与吡啶的混合物，所述南极假丝酵母脂肪酶的酶活力为50-60u，所述吡啶为2mol/l，所述南极假丝酵母脂肪酶与吡啶的混合物的体积为2ml。
8.南极假丝酵母脂肪酶催化花青素的-3-o-葡萄糖苷，这种酶促反应可以在富含花青素的提取物上进行，也可以根据修饰的物理性质进行分离，是酰基化试验效果较为理想的催化酶，由于花青素水溶性较高，亲脂性极低，需采用极性较强有机溶剂使其在反应中溶解，但溶剂极性过高易降低脂肪酶分子结构稳定性和酶催化活性, 选用吡啶作为反应中使用的极性有机溶剂，既能较好的溶解花青素，又能保持酶催化活性。
9.进一步的，上述的生物酶复合物，所述酰基供体为琥珀酸与苯甲酸甲酯的混合物，所述琥珀酸为6g，所述苯甲酸甲酯为0.5 mol/l，加入量为2g。
10.通过琥珀酸与苯甲酸甲酯的配合，其流动的糖链将折叠好的酰基缠绕在花青素的 2-苯基苯并吡喃骨架的表面， 使其发生堆积作用， 从而对花青素的结构起到保护作用。
11.本发明还涉及所述的生物酶复合物应用于植物提取过程中的方法，包括植物提取花青素和花青素的酰基化，所述植物提取花青素，包括如下内容：（1）粗提：将含有花青素的植物避光匀浆后，冻干成粉末，在-20-30℃避光保存；按照料液比为 1:10-30，称取上述粉末、提取溶液，在30-50℃的温度下，再加入提取酶， 以400-450w的超声功率处理15-30min后，以4000-5000rpm/min 的转速于室温条件下离心15-20 min，收集上清液；（2）浓缩：在 20-30℃的温度下，将上清液进行旋转蒸发， 得到花青素浓缩液；（3）纯化： 通过活化的d-101大孔吸附树脂分离柱对上述花青素粗提液进行分离纯化，得到纯化花青素，将纯化花青素旋转蒸发后，通过冷冻干燥机将花青素溶液冷冻干燥成花青素粉末。
12.所述含有花青素的植物可以是蓝莓、桑椹等等，通过提取酶、提取溶液辅助超声法提取花青素，提高了花青素的提取率，且提取时间短，可操作性强。
13.进一步的，上述的生物酶复合物应用于植物提取过程中的方法，所述花青素的酰基化，包括如下内容：向上述花青素粉末，依次加入酰基供体、催化酶复合物、反应溶剂、4a分子筛，在40-45℃条件下恒温振荡反应6-8h，得到反应液；将反应液进行旋转蒸发得到浓缩液后真空冷冻干燥制得酰基化花青素。
14.进一步的，上述的生物酶复合物应用于植物提取过程中的方法，所述步骤（1）中的含有花青素的植物采用桑椹或者蓝莓。
15.进一步的，上述的生物酶复合物应用于植物提取过程中的方法，所述提取溶液为0.1% hcl-80% 酸化乙醇溶液。
16.进一步的，上述的生物酶复合物应用于植物提取过程中的方法，所述提取酶为木瓜蛋白酶、 β-葡聚糖酶、木聚糖酶的一种或几种的混合；所述提取酶的加入量为5-6 mg/g。
17.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：（1）本发明公开的生物酶复合物，配方设计合理，用于植物提取花青素的酰基化修饰，通过生物酶复合物可以对花青素进行改性，引入酰基，改性后的花青素对于光照和温度
都表现出较高的稳定性， 花青素在酸性条件下也较为稳定，除了fe3+，改性后的花青素对cu2+、 mn2+、 ca2+、 al3+、fe2+的稳定性均强于未改性的花青素；（2）本发明公开的生物酶复合物应用于植物提取过程中的方法，包括植物提取花青素和花青素的酰基化制备步骤设置合理，简单可控且具有很高的灵活性，通过提取酶、提取溶液辅助超声法提取花青素，提高了花青素的提取率，且提取时间短，可操作性强，用途前景广泛。
具体实施方式
18.下面将实施例结合具体实验数据，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。以下实施例提供了一种生物酶复合物及应用于植物提取过程中的方法，所述生物酶复合物包括酰基供体、催化酶复合物、反应溶剂、4a分子筛；每1mg的花青素粉末，加入8-10g的酰基供体，加入1-2ml的催化酶复合物，加入35-40ml的反应溶剂，加入0.03-0.05g的4a分子筛；所述酰基供体为琥珀酸、苹果酸、草酸、苯甲酸甲酯、水杨酸甲酯、肉桂酸甲酯、没食子酸甲酯的一种或几种的混合；所述催化酶复合物包括催化酶、酶催化酰基化反应溶剂，所述催化酶为南极假丝酵母脂肪酶、amano 脂肪酶 ps、米曲霉脂肪酶、猪胰腺脂肪酶的一种或几种的混合，所述酶催化酰基化反应溶剂为吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮的一种或几种的混合；所述反应溶剂为50%的乙醇，所述4a分子筛为干燥活化4a分子筛。
19.进一步的，所述催化酶复合物为南极假丝酵母脂肪酶与吡啶的混合物，所述南极假丝酵母脂肪酶的酶活力为50-60u，所述吡啶为2mol/l，所述南极假丝酵母脂肪酶与吡啶的混合物的体积为2ml。
20.进一步的，所述酰基供体为琥珀酸与苯甲酸甲酯的混合物，所述琥珀酸为6g，所述苯甲酸甲酯为0.5 mol/l，加入量为2g。
21.实施例1所述植物提取花青素，包括如下内容：（1）粗提：将蓝莓避光匀浆后，冻干成粉末，在-20℃避光保存；按照料液比为 1:25，称取上述蓝莓粉末、0.1% hcl-80% 酸化乙醇溶液，在35℃的温度下，再加入β-葡聚糖酶，β-葡聚糖酶的加入量为5.5mg/g，以400w的超声功率处理25min后，以5000rpm/min 的转速于室温条件下离心15 min，收集上清液；（2）浓缩：在 25℃的温度下，将上清液进行旋转蒸发， 得到花青素浓缩液；（3）纯化： 通过活化的d-101大孔吸附树脂分离柱对上述花青素粗提液进行分离纯化，得到纯化花青素溶液，将纯化花青素溶液旋转蒸发后，通过冷冻干燥机将纯化花青素溶液冷冻干燥成花青素粉末。
22.所述蓝莓来自杭州睦山农实业投资有限公司（杜鹃花科越橘属浆果类植物果实），所述β-葡聚糖酶来自上海源叶生物科技有限公司，β-葡聚糖酶能水解植物细胞壁纤维素，使细胞内的物质更容易析出。
23.效果验证：
（1）提取率的测定：取待测的纯化花青素溶液 1ml，分别加入 ph1.0 和 ph4.5 的缓冲溶液，测定吸光度值，按标准曲线计算总花青素浓度 c，按公式（1）计算花青素含量，根据公式（2）计算提取率。
24.花青素含量（mg） =c
×
v1
×
v2/v3
ꢀꢀꢀ
（1）其中，c为花青素浓度（mg/ml），v1为供试液体积（ml），v2为提取液总体积（ml）， v3为待测液体积（ml）花青素提取率（%） =m1/m2 （2）其中，m1为花青素含量（mg）， m2为蓝莓粉末含量（mg）测试结果为，实施例1的平均得率为 14.216%。
25.（2）色阶、纯度的测定：将步骤（2）的花青素浓缩液旋转蒸发后，通过冷冻干燥机干燥成未纯化的花青素粉末，将经过步骤（3）纯化后的花青素粉末作为纯化的花青素粉末，采用色价表示，称取未纯化的花青素粉末、纯化的花青素粉末各 10.0 mg，用 ph 3.0 的盐酸水溶液定容于 100 ml 量瓶中，以 ph 3.0 的盐酸水溶液为空白对照，在 520 nm 下测得 a 值，根据公式 e＝a/m（其中 e 为色价， m 为蓝莓花青素粉末质量）进行纯化前后色价的计算；根据公式计算纯化前后质量分数。未纯化的花青素粉末质量分数＝m1/m2，纯化的花青素粉末质量分数＝m3/m4（m1 为花青素浓缩液中花青素的质量， m2 为花青素浓缩液干燥后的粉末质量， m3 为纯化花青素溶液中花青素的质量， m4 为纯化花青素溶液纯化干燥后的粉末质量）。
26.测试结果为，未纯化的花青素粉末的色价为8.12、质量分数为21.3%，纯化后的花青素粉末色价为59.1、质量分数为96.52%。
27.实施例2花青素的酰基化：取上述实施例1的花青素粉末，依次加入酰基供体、催化酶复合物、反应溶剂、4a分子筛，每1mg的花青素粉末，加入琥珀酸6g，加入0.5 mol/l的苯甲酸甲酯2g，加入2ml的催化酶复合物（所述催化酶复合物为南极假丝酵母脂肪酶与吡啶的混合物，所述南极假丝酵母脂肪酶的酶活力为50-60u，所述吡啶为2mol/l，所述南极假丝酵母脂肪酶与吡啶的混合物的体积为2ml），加入40ml的50%的乙醇，加入0.03g的4a分子筛，在40℃条件下恒温振荡反应8h，得到反应液；将反应液进行旋转蒸发得到浓缩液后真空冷冻干燥制得酰基化花青素。
28.其中，琥珀酸、南极假丝酵母脂肪酶来自美国 sigma 公司，苯甲酸甲酯、吡啶、乙醇、4a分子筛来自国药集团化学试剂有限公司。
29.效果验证：（1）热稳定性：用去离子水将实施例1、2的花青素粉末稀释到相同浓度，ph 值调为 5。在室温下平衡 1 h 后，取相同体积溶液避光密封于离心管中，分别在 40、50、60 ℃的温度下，避光水浴热处理 12 h，研究温度对花青素稳定性的影响。采用 uv-vis 测定其在 520nm 处的吸光值， 从而计算花青素的保存率。
30.测试结果为，在40、50 和 60 ℃下，实施例1的花青素的保留率分别为84.1%、81.5%和 78.9%，实施例2的花青素的保留率分别为90.3%、88.0%和85.6%，（2）光稳定性：去离子水将实施例1、2的花青素粉末稀释到相同浓度，ph 值调为 5。在室温下平衡 1 h 后，取相同体积溶液置于离心管中，在 450 w 荧光灯照射箱中光照
处理 12 d，温度 20 ℃，每 2 d 取样测试，利用 uv-vis 检测计算其保留率，研究光对花青素稳定性的影响。
31.测试结果为，在20 ℃下暴露450 w光照2、4、6、8、10 和 12 d 后，实施例1的花青素保留率在 10 d 内线性急剧下降到76.9%，12 d保留率为69.1%，实施例2花青素保留率始终高于实施例1的花青素，前 6 d 内，保留率下降缓慢，第 6 天保留率仍有95.0%；后 6 d 保留率下降稍有增加，第 12 天保留率为75.3%。
32.（3）ph 稳定性：选取 ph 值范围 2 至 9，每 100 ml 缓冲溶液中溶解 15 mg 花青素。缓冲剂：0.1 mol/l 氯化钾溶液作为 ph 值为 2 的缓冲液；0.1 mol/l 柠檬酸溶液作为ph 值为 3 和 4 的缓冲液；0.1 mol/l 磷酸盐溶液作为 ph值为 5、6 和 7 的缓冲液；0.1 mol/l 磷酸盐-氢氧化钠溶液作为 ph 值为 8 和 9 的缓冲液。利用 uv-vis 检测计算其保留率。
33.测试结果为，在 ph=2~3 范围内，实施例1、实施例2的花青素保留率没有明显差异， 在处理 10h 后的保留率均在 100%左右；在ph=4 时，实施例1、实施例2的花青素保留率均有一定程度的降低，实施例2花青素保留率始终高于实施例1的花青素；ph=5 时， 实施例1的花青素的保留率呈迅速下降趋势，并且在ph=9 时保留率下降到20%左右， 而实施例2的虽然也下降，实施例2花青素保留率始终高于实施例1的花青素， 当 ph=9 时，实施例2花青素保留率仍保持在 40%左右。
34.（4）金属离子稳定性：配制 0.25~2.0mol/l 的 cu2+、 mn2+、 ca2+、al3+、fe2+、fe3+离子溶液， 和 0.5mg/ml的实施例1、2的花青素溶液，按 1:1 的体积比混合均匀， 40℃处理 10h 后检测其保留率， 计算其半抑制浓度。 之后选用半抑制浓度的金属离子溶液与花青素溶液相互作用， 观察其影响趋势。
35.测试结果为，mn2+和 ca2+对实施例1、2的花青素保留率均没有显著影响， cu2+均使实施例1、2的花青素保留率降低， 但实施例2的变化幅度相对较小，而 al3+对实施例1、2的花青素均起到一种增色作用， fe2+和 fe3+对实施例1、2的花青素保留率均大幅度降低，fe2+均使实施例1、2的花青素保留率降低， 但实施例2的变化幅度相对较小，但是fe3+，处理 10h 后实施例1、2的花青素保留率均下降到 20%左右。
36.本发明具体用途途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。