1.本发明涉及生物医药技术领域，具体公开一种口服干细胞因子复合物及其用途。


背景技术：

2.根据《中国居民营养与慢性病状况报告(2020年)》，中国糖尿病患者已达1.21亿。目前糖尿病患者的治疗以口服降糖药物和胰岛素注射为主，通过调节患者血糖来减缓糖尿病带来的慢性和急性并发症。但口服降糖药物容易产生肝肾毒性，胰岛素治疗有低血糖发生的风险，且这两者都属于改善血糖指标，并未从根本上改善胰岛β细胞的功能。
3.目前关于恢复糖尿病患者β细胞功能的研究主要集中在干细胞、外泌体的输注上。干细胞、外泌体通过抑制炎症、调节免疫、恢复胰岛微循环、促进β细胞再生等方面促进β细胞功能的改善，目前也已得到很多实验的证实。但输注具有一定的创伤性，且对患者的身体状况有一定的要求，适用面窄，同时具有一定的风险性。
4.因此，开发一种能够恢复糖尿病患者胰岛β细胞功能的口服干细胞产品是非常必要的。


技术实现要素：

5.针对以上技术问题，本发明提供一种口服干细胞因子复合物，该复合物采用冻干的方式制成，通过舌下黏膜吸收，能够起到促进胰岛β细胞再生的作用。
6.本发明提供的口服干细胞因子复合物，其包括干细胞因子浓缩液及白蛋白肽，且干细胞因子浓缩液与白蛋白肽的混合比为80-140ml∶1-5g，所述干细胞因子浓缩液中蛋白含量为0.65-1.2mg/ml。
7.优选地，所述干细胞因子浓缩液与所述白蛋白肽的混合比为60ml∶1g，所述干细胞因子浓缩液中蛋白含量为1.2mg/ml。
8.优选地，所述干细胞因子浓缩液是由脐带、脐血或胎盘中分离的干细胞培养所得上清液经浓缩而成。
9.优选地，所述口服干细胞因子复合物还包括大豆肽、山药肽、人参肽或胰腺肽中的一种或几种的组合。
10.本发明还提供了上述复合物在制备促进β细胞增殖、恢复β细胞功能、调节血糖的药物中的用途。
11.本发明还提供一种具有修复胰岛β细胞功能的口服冻干剂，其包括上述口服干细胞因子复合物，以及药学上可接受的冻干保护剂。
12.优选地，所述冻干保护剂为d-甘露糖醇、β-葡聚糖或海藻糖中一种或几种混合物。
13.优选地，所述口服冻干剂的服用方法为舌下含服。
14.对比现有技术，本发明的有益效果为：
15.1、本发明提供一种可以口服的干细胞因子复合物，将干细胞使用的形式由输注改为了日常口服，避免了干细胞、外泌体输注的创伤性及不便，更为安全和方便。
16.2、该口服干细胞因子复合物可以进一步制备成冻干粉以供舌下含服，解决干细胞口服中遇到的胃酸不耐受及胃肠道消化破坏问题。
17.3、此口服干细胞因子复合物直接利用干细胞分泌的细胞因子，达到促进β细胞再生的目的，而白蛋白肽(蛋清肽)具有增强干细胞因子的作用：
①
在干细胞浓缩因子的冻干过程中起保护作用，减少冻干过程中干细胞因子的活性损失；
②
白蛋白肽与干细胞因子复合使用后，有利于降低胰岛中1l-1β、1l-6、tnf-α的含量，减轻胰岛炎症，为干细胞因子活性发挥创造优良的环境；
③
白蛋白肽为细胞修复再生所需的蛋白质提供原料，有利于胰岛β修复再生。
18.4、实验结果证实：本发明提供的口服干细胞因子复合物能够促进胰岛素分泌及c肽分泌，并抑制胰岛中caspase 3的表达，同时对机体血糖具有持续的调节作用。
附图说明
19.图1是各组大鼠血清中胰岛素含量；
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**
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20.图2是各组大鼠血清中c肽含量；
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21.图3是各组大鼠血清中il-1β、il-6、tnf-α含量；
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22.图4是各组大鼠胰腺、胰岛细胞的he染色结果图；
23.图5是wb检测各组大鼠胰岛中caspase 3、bcl2的表达量；
24.图6是各组大鼠葡萄糖耐量曲线。
具体实施方式
25.下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。
26.实施例1
27.一种口服干细胞因子复合物，其是由1g白蛋白肽与80ml干细胞因子浓缩液(1.2mg/ml，ph6.0)制成；
28.其中，干细胞浓缩因子来源于脐带间充质干细胞的培养上清，经过超滤浓缩至蛋白浓度1.2mg/ml。其中，脐带间充质干细胞培养上清浓缩液具体制备方法如下：
29.1.组织接收：收集临床健康分娩的婴儿离体脐带，并放置在无菌生理盐水中(含5％(v/v)青链霉素)，密封保存，1h内尽快送达实验室；
30.2.组织清洗：在超净工作台内，将接收的脐带组织取出，放入培养皿中，用生理盐水(含5％(v/v)青链霉素)冲洗两次，剪掉脐带两端结扎部位，生理盐水再次洗涤2-3遍；沿脐带生长方向，用无菌剪刀剪开脐带，生理盐水(含5％青链霉素)洗涤脐带内血块，直至组织发白；
31.3.组织贴壁培养：用无菌剪刀和镊子剔除脐带内血管(2条动脉，1条静脉)，生理盐水(含5％青链霉素)清洗一遍，获得华通氏胶。华通氏胶剪碎至1mm3，将组织块均匀铺在无菌培养皿中，组织块表面滴少许胎牛血清(覆盖组织即可)，放置在37℃、5％co2培养箱中孵育。6-8h后补加完全培养基(90％α-mem+10％fbs)，继续培养箱中培养，间隔3-4d换液；
32.4.细胞获得：组织块约培养10-14d，显微镜下观察组织块周围有大量细胞爬出，此
时转移组织块，pbs缓冲液清洗细胞表面，加入0.25％不含edta的胰蛋白酶消化2-3min，完全培养基终止后，吹打获得细胞悬液，800rpm离心5min，弃上清，所得沉淀即为p0代细胞；
33.5.干细胞因子浓缩液获得：将p0代细胞间充质干细胞以1.0
×
105/cm2密度接种于细胞培养瓶内，加入间充质干细胞培养基培养，待生长至密度为80％时，无菌操作台环境收集细胞培养上清，离心去除细胞碎片后，经超滤浓缩膜包截流处理得到浓缩液。
34.需要说明的是，上述间充质干细胞制备所用初始材料均为离体材料，本发明是将离体的材料收集后使用，并非手术方法。本领域技术人员也可以选择其他合法合伦理的方式获得脐带，或者选择人工培养的脐带组织。
35.该复合物可以进一步加入冻干保护剂制备成口服冻干粉剂，具体制备过程如下：
36.将10g d-甘露糖醇和1g白蛋白肽混匀并用少量水常温溶解，加入干细胞浓缩因子80ml(1.2mg/ml，ph6.0)，加水定容至100ml，混合均匀，用的滤膜进行过滤除菌，之后装入5ml国标低硼西林瓶中，每瓶装入2ml，送入冻干机中冻干，即得。
37.实施例2
38.一种口服干细胞因子复合物，其是由8g d-甘露糖醇、2gβ-葡聚糖、5g白蛋白肽、140ml干细胞因子浓缩液(0.65mg/ml，ph6.0)及200mg大豆肽制成。
39.实施例3
40.一种口服干细胞因子复合物，其是由2g d-甘露糖醇、2g海藻糖、2g白蛋白肽、120ml干细胞因子浓缩液(1.2mg/ml，ph6.0)及100mg人参肽制成。
41.实施例4
42.一种口服干细胞因子复合物，其是由8g d-甘露糖醇、5g白蛋白肽、80ml干细胞因子浓缩液(0.65mg/ml，ph6.0)及150mg胰腺肽制成。
43.实验例
44.从空军军医大学实验动物中心采购40只，体重为200
±
20g的sd大鼠，8只作为正常组，给予基础饲料喂养，其余不做任何处理。其余32只给予高脂饲料(基础饲料60％、猪油16％、蔗糖20％、蛋黄3％)喂养，持续喂养8周后，禁食12h，一次性腹腔注射30mg/kg链脲佐菌素，继续高脂饲料喂养1周建立高血糖动物模型。将32只大鼠分为四组，分别为模型组(8只)、复合物组(8只)，干细胞因子组(8只)及白蛋白肽组(8只)，分组结束后各组给予相应的治疗：模型组不做任何处理；复合物组给予本发明实施例1提供的干细胞因子复合物；干细胞因子组给予等量(与实施例1复合物中干细胞因子含量相同)的干细胞因子；白蛋白肽组给予等量(与实施例1复合物中白蛋白肽含量相同)白蛋白肽，均为大鼠舌下静脉注射，持续给药2周。
45.给药结束后，各组大鼠行尾静脉采血，分别进行胰岛素、c肽分泌量及血清中炎性因子il-1β、il-6、tnf-α测定。
46.采血结束后，每组选取4只动物脱颈处死，解剖后取一小块胰腺进行固定、包埋制成蜡块，he染色观察胰岛修复情况。同时取胰腺进行组织匀浆，裂解后离心取上清制成蛋白上清液，western blot检测胰腺中与胰岛β细胞凋亡相关的caspase3、bcl2的表达。
47.各组存活的大鼠在治疗结束后继续给予基础饲料喂养1周，之后口服葡萄糖进行糖耐量实验(ogtt)，验证口服干细胞因子复合物降血糖功效的持续性。具体方法为：禁食12h后，尾静脉取血，分离血清检测血糖，记为0min血糖，之后进行40％葡萄糖溶液灌胃，灌
胃时刻开始计时，分别于30min、60min、120min尾静脉取血测定血清中葡萄糖含量。
48.结果
49.(1)干细胞因子复合物对胰岛素的影响
50.胰岛素是由胰岛β细胞受外源性或内源性物质如葡萄糖、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素，是体内唯一降血糖的激素，是反应人体胰岛功能的关键指标。对各组大鼠血清中胰岛素含量测定结果如图1所示。
51.图1结果显示，与正常组相比，模型组大鼠血清中胰岛素含量显著降低，且有统计学差异，说明此糖尿病模型造模成功；与模型组相比较，白蛋白肽组胰岛素分泌量与模型组无显著性差异，而干细胞因子复合物组、干细胞因子组胰岛素分泌量均较模型组有所上升，且复合物组胰岛素含量较高，说明干细胞因子复合物具有改善胰岛素分泌的作用，且效果优于干细胞因子和白蛋白肽单独使用。
52.(2)干细胞因子复合物对c肽的影响
53.c肽是由胰岛β细胞分泌，它与胰岛素有一个共同的前体胰岛素原。胰岛素原裂解成1个分子的胰岛素和一个分子的c肽，因此c肽与自身胰岛素摩尔量是一致的。一般用c肽水平来评价胰岛β细胞的功能。对各组大鼠血清中c肽含量测定结果如图2所示。
54.图2结果显示，与正常组相比，模型组大鼠血清中c肽含量显著降低，且有统计学差异，说明此糖尿病模型造模成功；与模型组相比较，只有干细胞因子复合物组c肽含量有所上升，说明干细胞因子复合物具有改善c肽分泌的作用，干细胞因子和白蛋白肽单独使用，促进c肽分泌的效果不明显。
55.(3)干细胞因子复合物对il-1β、il-6、tnf-α的影响
56.研究表明，糖尿病是一种自然免疫和低度炎症性疾病，炎症反应参与了糖尿病的全过程，并与其发展密切相关。在高糖高脂环境诱导下，人单核细胞会产生大量的il-1β、il-6及tnf-α，促进杀伤性t淋巴细胞过度激活，导致胰岛β细胞的损伤和凋亡。同时炎症因子的增多还会使胰岛素受体底物磷酸化的部位发生在丝氨酸/苏氨酸上，从而阻碍了正常酪氨酸的磷酸化，导致胰岛素受体底物结合胰岛素受体的能力下降，从而减弱胰岛素作用，削弱胰岛素敏感性。对各组大鼠血清中il-1β、il-6、tnf-α含量测定结果如图3所示。
57.图3结果显示，与正常组相比，模型组大鼠血清中il-1β、il-6、tnf-α含量显著升高，且有统计学差异；与模型组相比较，干细胞因子复合物组、干细胞因子组及白蛋白肽组大鼠血清中il-1β、il-6、tnf-α含量均有所下降，说明三组物质均有抗炎作用；但复合物组il-1β、il-6、tnf-α下降最明显，说明干细胞因子复合物的抗炎效果优于干细胞因子和白蛋白肽单独使用。
58.(4)干细胞因子复合物对胰腺、胰岛细胞的影响
59.结果如图4所示。
60.图4he染色结果显示，正常组大鼠胰岛与腺泡之间结合紧密且界限清晰、形态饱满，胰岛细胞数量较多且形态均一、分布均匀；而模型组大鼠胰岛组织萎缩，出现与腺泡脱离现象，胰岛细胞明显减少，部分细胞变性；复合物组、干细胞因子组及白蛋白肽组大鼠胰岛组织形态得到改善，胰岛细胞数量增加，尤其是复合物组，胰岛细胞较多且细胞排列整齐，胰岛组织形态基本恢复正常，表明干细胞因子复合物能够明显减轻高脂饲料及stz对大鼠胰岛形态结构的损伤。
61.(5)干细胞因子复合物对caspase 3、bcl2表达的影响
62.以往的研究显示，胰岛β细胞中线粒体功能障碍是引发胰岛β细胞凋亡的主要途径，在此途径中caspase 3是执行者，caspase3的高表达抑制了抗凋亡蛋白bcl2的表达，因此检测胰岛中capase 3和bcl2的表达是评价胰岛修复程度的关键指标。检测结果如图5所示。
63.图5westernblot检测结果显示，与正常组相比较，模型组大鼠胰岛中caspase3表达量升高，bcl2表达量降低，说明胰岛细胞凋亡增加，抗凋亡减少；而复合物组、干细胞因子组及白蛋白肽组bcl2表达均呈现上升趋势，复合物组和干细胞因子组caspase3表达量明显下降，尤其是复合物组caspase 3表达量下降更明显；白蛋白肽组caspase 3表达量未有明显改变。此结果说明干细胞因子复合物组具有增加抗凋亡蛋白分泌，抑制胰岛细胞凋亡，保护胰岛的功效。
64.(6)干细胞因子复合物对修复后机体调节血糖能力的影响
65.给药结束后，已修复的胰岛是否能持续应对外源性的高糖反应，需要进行口服葡萄糖耐量试验(ogtt)。口服葡萄糖耐量试验是一种葡萄糖负荷试验，一次性给予高剂量葡萄糖，用以了解胰岛β细胞功能和机体对血糖的调节能力，目前在临床中用于糖尿病确诊试验。各组大鼠葡萄糖耐量曲线如图6所示。
66.图6结果显示，模型组大鼠在灌胃葡萄糖60min后达到最高，而正常组30min到达顶峰，且模型组曲线下面积高于正常组，表明模型组出现了明显的糖耐量减低。干细胞因子组和白蛋白组肽组均在在60min达到顶峰，随后呈下降趋势，曲线下面积明显低于模型组，说明糖耐量减低现象有所改善。而复合物组在灌胃后30min到达顶峰，随后持续下降，与正常组趋势一致，且曲线下面积显著低于模型组、干细胞因子组和白蛋白组肽组，表明干细胞因子复合物组具有持续调节机体血糖的能力，且效果好于单一的白蛋白肽和干细胞因子。
67.以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。