1.本发明涉及一种黄栀子中栀子苷、栀子黄色素及栀子多糖的制备方法，属中药制药工程技术领域。


背景技术：

2.黄栀子(fructusgardeniae)又名山栀子、栀子，是一种常见的果实类药材，为国家首批公布的药、食两用资源，具有保肝利胆、解热镇痛、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血脂等多种药理活性
[1-2]
。除医药用价值之外，黄栀子还是一种天然的色素原料，常作为食品添加剂和化工染料在亚洲各国食品行业、日用化工行业中具有广泛地应用。
[0003]
对黄栀子的开发利用主要是从其果实中提取有效成分进行研究加工。目前栀子属植物中已被分离鉴定的有效成分包括环烯醚萜类（栀子苷、异栀子苷等）、三萜类化合物（藏红花素、藏红花酸等）、有机酸类（绿原酸、熊果酸等）、黄酮类、多糖类以及挥发油等。其中栀子苷、栀子黄色素及栀子多糖是应用价值较高、范围较广的主要有效成分。
[0004]
一、栀子苷栀子苷又名京尼平苷，属于环烯醚萜类化合物。栀子苷不仅在吲哚生物碱的合成及植物分类学方面具有重要意义，更具有广泛的生物活性
[3]
。药理学及毒理学研究表明，栀子苷具有保肝利胆、保护胰腺组织、调节胃肠功能、改善脑缺血、镇痛抗炎、抗肿瘤等药理作用
[4]
。
[0005]
二、栀子黄色素栀子黄色素是一种主要化学成分为藏红花素、藏红花酸、栀子苷、绿原酸以及黄酮类的混合物，其中藏红花素和藏红花酸是世界上唯一存在的水溶性类胡萝卜素
[5-6]
。栀子色素是栀子的主要开发产品，是天然食用色素物质，无毒、安全性高，具有一定的营养价值和保健作用。
[0006]
三、栀子多糖栀子多糖是栀子含有的一种非常重要的活性成分，主要由l-岩藻糖、l-阿拉伯糖、l-鼠李糖、d-半乳糖和d-葡萄糖等单糖按一定比例组成，具有复杂的、多方面的生物活性和功能，可用于食品工业和医药工业做稳定剂、增稠剂和胶冻剂等
[7]
。
[0007]
上述三种成分的制备方法有传统的煎煮法、浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流法、压榨法等，近年来更多的采用超声、微波等技术辅助提取。其中栀子苷、栀子黄色素的提取较多的采用超声辅助法，但在料液比、提取溶剂浓度、超声时间、超声功率等工艺参数的设定上差异较大，目标成分的得率、纯度也高低不一。目前超声提取制备栀子多糖的研究相对较少。仅有宫江宁等
[8]
研究表明，采用超声波提取法提取栀子多糖的最佳提取工艺条件为：超声功率120w，提取时间73min，在此条件下栀子多糖的提取率为（6.34
±
0.09）%。该方法中提取时间相对较长。
[0008]
目前现有技术如cn111138557a只制备了栀子多糖，cn1544532只制备了栀子黄色素，cn1466951只提取了环烯醚萜类，cn1670037a综合提取了栀子苷、栀子黄色素、绿原酸、栀子多糖等成分，但其栀子苷和栀子多糖得率均较本发明所得结果更低，其栀子黄色素得率高于本发明所得结果但色价明显低于本发明所得结果；且本发明经进一步纯化，有效去除栀子粗多糖中的蛋白质、色素、小分子杂质等非糖物质，从而获得更纯的栀子多糖产品。


技术实现要素：

[0009]
本发明所要解决的主要技术问题是建立一种黄栀子中栀子苷、栀子黄色素及栀子多糖的制备方法。
[0010]
本发明是通过以下技术方案来实现的：一种制备黄栀子有效成分的方法，其特征在于，将黄栀子果实干燥、粉碎，95 wt %乙醇浸泡脱脂，除去乙醇晾干，置于60℃烘箱继续干燥至无醇味，以乙醇-水溶液作为提取溶剂，按照一定料液比，采用高压超声辅助提取法进行提取，过滤，所得滤液离心并收集上清液上样于大孔吸附树脂柱获得栀子黄色素产品，所得滤渣用于栀子多糖的制备。
[0011]
所述的一种制备黄栀子有效成分的方法，其特征在于，黄栀子果实的粉碎: 黄栀子果实粉碎后的栀子粉末筛至40目，95 wt %乙醇浸泡脱脂时间为48 h。
[0012]
所述的高压超声辅助提取法：提取条件为，超声功率300 w，提取溶剂为的乙醇-水溶液，乙醇-水溶液v:v为70%，栀子粉末与提取溶剂的料液比为1 g∶10 ml，提取温度为40℃，提取时间为50 min，获得上清液的离心条件为3600 ~4000 rpm/min、离心3~5 min。
[0013]
所述的一种制备黄栀子有效成分的方法，其特征在于，上清液的处理：采用的大孔吸附树脂柱为hpd722，hpd722的规格为φ25 mm
×
40 mm，上清液以固定流速上样，收集过柱后的流出液a，待充分吸附后用蒸馏水冲洗树脂柱，收集水洗脱液b，再用25 wt %乙醇洗脱，收集洗脱液c，合并流出液a、水洗脱液b、洗脱液c，蒸发浓缩后得栀子苷富液，栀子苷富液用于栀子苷的进一步纯化；用70 wt %乙醇继续洗脱分离过大孔吸附树脂柱hpd722，直至洗脱液无色，收集洗脱液，蒸发浓缩、冷冻干燥得栀子黄色素产品。
[0014]
所述的一种制备黄栀子有效成分的方法，其特征在于，上清液的分离流程：上清液的上样浓度为10 mg/ml，流速为2 ml/min，蒸馏水冲洗用量为3 bv，25 wt %乙醇洗脱用量为6 bv。
[0015]
所述的一种制备黄栀子有效成分的方法，其特征在于，栀子苷的进一步纯化：栀子苷富液采用大孔吸附树脂柱h103吸附，大孔吸附树脂柱h103规格为φ25 mm
×
40 mm，吸附平衡后用25 wt %的乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸发浓缩、冷冻干燥得栀子苷产品。
[0016]
所述的一种制备黄栀子有效成分的方法，其特征在于，滤渣用于栀子多糖的制备：将滤渣干燥后采用高压超声辅助水提法提取，提取液经过滤、离心，离心后的上清液经减压浓缩，加入95 wt %乙醇使醇含量达80%，4℃静置过夜，过滤收集沉淀，所得沉淀分别用乙醇、乙醚、丙酮依次洗涤2~3次后60℃烘箱干燥，得栀子粗多糖，进一步纯化得到栀子粗多糖产品。
[0017]
所述的一种制备黄栀子有效成分的方法，其特征在于，栀子粗多糖的高压超声辅助水提法制备，高压超声辅助水提法：超声功率为300 w，滤渣与水的料液比为1 g∶20 ml，提取温度为60℃，提取时间为30 min，过滤后的提取液的离心条件为3600 ~4000 rpm/min，离心3~5 min。
[0018]
所述的一种制备黄栀子有效成分的方法，其特征在于，栀子粗多糖的纯化：加水溶解栀子粗多糖配制成浓度为10 mg/ml的粗多糖水溶液，于-20℃和室温反复冻融5次，离心除蛋白，透析，脱色，冷冻干燥。
[0019]
所述的一种制备黄栀子有效成分的方法，其特征在于，栀子粗多糖的纯化：所述的离心除蛋白的条件为11000 rpm离心10 min，透析条件为采用3500 da的透析袋蒸馏水透析
48 h，脱色条件为以5 mg/ml的浓度上阴离子交换树脂柱d941，蒸馏水洗脱，收集水洗脱液并蒸发浓缩，冷冻干燥得栀子多糖产品。
[0020]
本发明的有益效果：本发明是在通用的中药化学成分制备的基础上，提供一种新的方法组合，利用较新型提取设备高压超声反应釜，通过优化提取工艺条件，从同一份黄栀子原料中提取获得上述三种具有较高应用价值的有效成分：栀子苷、栀子黄色素及栀子多糖，并结合一系列分离纯化技术对目标成分进行精制。
[0021]
本发明制备流程简单，有机试剂用量少，实际操作可行、经济、环保。本发明中，高压超声反应釜的应用在常规超声提取的基础上加入了“高压”这一提取环境，加速超声破碎过程，能够在较低温度下实现快速提取，缩短提取时间并有效提高目标成分得率。本发明中，大孔树脂hpd722和h103的联合使用，能够分别使栀子黄色素和栀子苷达到较大分离效率，使分离纯化后的栀子苷纯度达90%，栀子黄色素色价达489.44的，其中栀子黄色素od值为0.155，明显低于0.4，可有效避免发生绿变。栀子多糖通过精制处理去除杂质后含量达45.3%（以葡萄糖计）。本发明中黄栀子整体利用率高，经济效益将增加。
具体实施方式
[0022]
1. 将黄栀子果实干燥、粉碎后过40目筛备用，以95 wt%乙醇浸泡48 h脱脂，除去乙醇晾干，置于60℃烘箱继续干燥至无醇味，获得干燥成40目的栀子粉末。
[0023]
2. 按照栀子粉末与70 wt %的乙醇水溶液提取溶剂的料液比为1∶10（1 g∶10 ml）称取干燥成40目的栀子粉末，再按照栀子粉末与70 wt %的乙醇水溶液提取溶剂的料液比1∶10（g∶ml）称取70 wt %的乙醇水溶液，在上述的40目的栀子粉末中加入所述的70 wt %的乙醇水溶液的提取溶剂，在40℃条件下高压超声提取50 min，超声功率为300 w，过滤，滤液以3600 ~4000 rpm/min离心3~5 min，收集上清液，上清液经大孔吸附树脂hpd722吸附分离，获得浓度为10 mg/ml的上清液；余下滤渣用于栀子多糖的提取。
[0024]
3. 将浓度为10 mg/ml的上清液以2 ml/min的流速上样于大孔吸附树脂柱hpd722（φ25 mm
×
40 mm），收集过柱后的流出液a，充分吸附后用3 bv（1 bv等于1柱床体积，下同）蒸馏水冲洗，收集水洗脱液b，再用6 bv的25 wt %乙醇洗脱，收集洗脱液c，合并上述的a、b、c，蒸发浓缩后得栀子苷富液，栀子苷富液采用大孔吸附树脂柱h103吸附，吸附平衡后用25 wt %的乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸发浓缩、冷冻干燥得栀子苷产品。
[0025]
4. 用70 wt %乙醇继续洗脱树脂柱hpd722至洗脱液无色，收集洗脱液，蒸发浓缩、冷冻干燥得栀子黄色素产品，滤渣备用。
[0026]
5. 将经过上述步骤1-4提取过栀子苷和栀子黄色素余下的滤渣干燥后加入是滤渣重量的20倍量水，采用高压超声辅助水提法，超声功率300 w、提取温度60℃、提取时间30 min的条件进行提取，提取液过滤、离心后减压浓缩至100 ml左右，加入95 wt %乙醇使醇含量达80%，4℃静置过夜，过滤收集沉淀，所得沉淀分别用乙醇、乙醚、丙酮依次洗涤2~3次后60℃烘箱干燥，得栀子粗多糖。
[0027]
6. 将步骤5所得栀子粗多糖加水溶解，配制成浓度为10 mg/ml的粗多糖水溶液，于-20℃和室温反复冻融5次，10000 rpm离心10 min，收集上清液用3500 da的透析袋蒸馏水透析48 h，获得粗多糖水溶液。
[0028]
7. 将步骤6所得的透析后的粗多糖水溶液稀释，以5 mg/ml的浓度上阴离子交换树脂柱d941进行脱色，蒸馏水洗脱，收集水洗脱液并蒸发浓缩，冷冻干燥得栀子多糖产品。
[0029]
8. 称重制备所得栀子苷、栀子黄色素、栀子多糖，计算得率分别为3.9%、1.5%、11.2%；紫外分光光度法检测并计算得栀子苷纯度为90.0%，栀子黄色素od值为0.155，色价为489.44；苯酚硫酸法测栀子多糖含量（按葡萄糖计）为45.3%。
[0030]
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