1.本发明属于纳米材料，具体涉及一种细胞核仁成像红色荧光碳点及其制备方法和应用。


背景技术：

2.核糖核酸(rna)广泛地分布在细胞质以及细胞核中，其中细胞核中的rna主要富集在核仁区域。rna在细胞的生命活动中扮演着重要角色，如作为信使rna(mrna)在蛋白质合成过程中负责传递遗传信息和直接指导蛋白质合成；作为转移rna(trna)在蛋白质合成过程中负责转运氨基酸和解读mrna遗传密码；作为核糖体rna(rrna)与核糖体蛋白构成核糖体；作为rna酶调节基因表达和催化生化反应过程等。细胞核仁结构普遍存在于真核细胞核中，其主要成分包括rdna、rrna和核糖核蛋白，是真核细胞核间期核中最显著的结构，它也是rrna基因存储、rrna合成加工以及核糖体亚单位的装配场所。核仁的大小、形状随生物的种类、细胞类型和细胞代谢状态而变化。因此，对活细胞核仁的实时观测对于细胞行为研究来说至关重要。
3.由于细胞核仁结构在光学显微镜明场下很难被观察，因此需要对其进行染色。其中，通过荧光探针标记核仁结构的染色方法因为其非侵入式和灵敏度高的特点备受关注。目前，用于细胞核仁染色的商品化的荧光染料只有syto rnaselect(绿色荧光)，但是它的缺点(价格昂贵、只适用于死细胞核仁染色、水溶性和光稳定性差)限制了其在核仁染色领域的应用。虽然近些年来，一些可用于核仁染色的荧光材料被报导，但是他们仍然存在水溶性较差、发射波长短、信噪比差和活体成像受限等问题。因此，在活细胞核仁荧光成像领域，迫切需要开发出性能优异的新型活细胞核仁荧光成像染料。
4.现有技术中公开了一种简单的可大量生产的绿色荧光碳点及其制备方法和应用(201910728346.6)，其中使用了碱性品红，然而其所制得的碳点荧光发射波长较短，且为绿色荧光发射。一种核仁靶向荧光碳点及其制备方法与应用(201710156126.1)，由间苯二胺和半胱氨酸制成，该碳点荧光发射波长相对较短，荧光成像信噪比不佳，在斑马鱼活体中无法实现清晰的细胞核仁成像。
5.另一方面，体内荧光成像领域近些年来受到了极大的关注。因为体外培养细胞和动物体内细胞的生命活动有较大差别，因此对动物体内特定细胞、器官或组织的荧光成像对生命科学研究具有重大意义。但是，体内荧光成像面临两个重要挑战。一方面，短波长的光无法穿透深层动物组织；另一方面，复杂的体内环境对成像探针要求高，如需具备良好的生物相容性和免清洗成像能力。所以具有较大激发/发射波长、生物相容性好且可实现免清洗成像的荧光探针是实现高质量体内荧光成像的重要保证。据我们所了解，目前可以实现高质量动物体内细胞核仁荧光成像的探针极为缺乏，这严重影响了活体中核仁相关生命活动的研究进展。因此，开发一种体内细胞核仁荧光成像探针对生命科学和医学研究来说具有重大意义。


技术实现要素：

6.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种细胞核仁成像红色荧光碳点，该碳点具有长波长的荧光发射、优异的生物相容性、良好的水分散性和很高的光稳定性的特点，可实现高质量的体外和体内细胞核仁成像。
7.本发明还提供所述细胞核仁成像红色荧光碳点的制备方法和应用。
8.技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述一种细胞核仁成像红色荧光碳点，其包括以下重量份的原料：刚果红1份，对苯二胺1
‑
10份。
9.作为优优选，所述对苯二胺为2份。
10.本发明所述的细胞核仁成像红色荧光碳点制备方法，包括以下步骤：
11.(1)取刚果红与对苯二胺混合后进行水热反应；；
12.(2)水热反应后降至室温后，除去不溶物，再通过透析得到红色荧光碳点的水分散液。
13.其中，步骤(1)中将刚果红与对苯二胺分别溶于水，将两者的水溶液混合，再将所得混合液转移至水热反应釜中进行水热反应。
14.作为优选，步骤(1)中在水热反应的温度为120
‑
200℃，时间为4
‑
24h。
15.其中，步骤(2)中通过离心或过滤除去不溶物。
16.其中，步骤(2)中透析为用截留分子量1000da的透析袋进行透析即得目标荧光碳点溶液。
17.作为优选，在水热反应釜中以200℃反应8h，降至室温后，经离心和透析即得所述荧光碳点的分散液。
18.本发明所述的细胞核仁成像红色荧光碳点在细胞层次或活体组织成像中的应用。
19.本发明所述的细胞核仁成像红色荧光碳点在制备用于细胞层次或活体组织成像的细胞核仁荧光探针中的应用。
20.本发明制备的碳点由于其良好的荧光性质、制备简单、尺寸小、水分散性好以及生物毒性低等优点而被广泛应用于成像、检测和药物递送等领域。本发明利用一步水热法制得的碳点具有良好的光稳定性，并可实现对哺乳动物细胞核仁的长时间高质量成像。并且，相较于商品化的核仁成像试剂syto rnaselect，合成的碳点具有制备方法简单、成本低廉、水分散性好、生物安全性好、荧光发射波长大、光稳定性好、免清洗、长时间成像、斯托克斯位移大和可实现死细胞和活细胞核仁染色等优点。最重要的一点是，本发明合成的碳点还可在活体动物中实现原位细胞核仁的观测，有望取代商品化的核仁荧光探针。
21.本发明使用全新的原料刚果红和对苯二胺制备碳点。反应原料之一的对苯二胺可以为最终反应产物(即碳点)提供带苯环的共轭结构，有利于保证最终产物具有长波长的荧光发射。另外，对苯二胺的两个氨基可以为产物提供氨基和正电荷，有利于促进最终制得的碳点和带负电荷的核仁组分(主要是核仁中的rna)结合，从而确保了所得碳点的特异性核仁靶向。但是单独采用对苯二胺为原料合成的碳点发射波长较短、水分散性较差，这显著限制了其应用。本发明使用的另一反应原料刚果红因为存在两个磺酸根具有极佳的水溶性，因而确保了反应产物碳点极佳的水分散性，并且其结构中的巨大的共轭结构也保证了最终碳点具有长荧光发射波长。此外，刚果红分子中有很多n元素，尤其是其中两个苯环上的氨基结构，也有利于所得碳点与核仁中的rna的结合。以上因素最终使得由这两个原料所制得
的碳点可实现高质量的核仁荧光成像，保证其具有更好的应用前景。
22.本发明综合利用了两个反应原料对苯二胺和刚果红的结构互补优势，不但保证了所得碳点具有特异的核仁靶向的能力，而且所得碳点也同时具有极好的水分散性和长荧光发射波长，最终使得碳点可以实现高质量的活细胞核仁成像效果。
23.此外，本发明中使用的刚果红和现有技术中采用的碱性品红在结构上具有很大差别。首先，碱性品红的共轭结构远远小于刚果红的共轭结构，因此本发明制得的碳点具有更长的荧光发射波长，为红色荧光发射；而碱性品红所制得的碳点荧光发射波长短很多，为绿色荧光发射。其次，碱性品红结构没有磺酸根，而刚果红具有磺酸根，由于磺酸根是最强的水溶性基团，该基团的引入可以确保所得碳点的优异水分散性。第三，单个碱性品红分子中只有3个n原子，而单个刚果红分子则有6个n原子，这也导致两种碳点最终具有不同的n元素掺杂含量，并影响碳点的发光性质和核仁靶向性质等。
24.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
25.(1)高质量和普适性的核仁靶向成像性能：该碳点可以实现高对比度的细胞核仁靶向荧光成像，并且可实现至少24h的稳定核仁成像。此外，该碳点对哺乳动物细胞核仁的靶向成像具有普适性，在50μg/ml的浓度下便可实现对包括以人肺细胞(hp)为代表的正常组织细胞以及以人肺癌细胞(a549)和小鼠黑色素瘤细胞(b16)为代表的癌细胞的核仁成像。此外，该碳点同时适用于死细胞和活细胞核仁染色；
26.(2)优异的荧光性质：所制得的碳点荧光量子产率高(在乙醇为20％，在二甲基亚砜中为28％)，发射波长大并且斯托克斯位移大，因而具有背景干扰低，对生物样品损伤小和样品穿透性强等特点；
27.(3)优异的抗光漂白能力：该碳点在激光照射下不易被光漂白，其光稳定性远高于常规的核仁靶向有机染料分子如syto rnaselect染料等，因此可以实现长时间连续成像观察；
28.(4)免清洗长时间成像能力：将该碳点与细胞孵育10
‑
15min后不需要pbs清洗便可直接观察，这简化了实验操作且有助于实现活体内的核仁成像；
29.(5)优异的生物相容性：细胞毒性评价实验结果显示，该碳点在高达800μg/ml时(实际染色浓度仅需要50μg/ml)对肺癌细胞的毒性也很低，存活率均在90％及以上；
30.(6)良好的水分散性和水稳定性：所制得的荧光碳点具有很好的水分散性和水稳定性，适合在生理环境下的核仁成像以及细胞核靶向载药的应用；
31.(7)活体动物体内成像：该碳点的长发射波长使其具有良好的组织穿透性，同时其较大的斯托克斯位移有效降低了背景荧光信号，背景噪声更小、成像效果更好，最终可实现动物体内高质量的核仁成像；
32.(8)本发明制备方法简单，原料价廉易得，可实现大量制备，并制备用于细胞层次或活体组织成像的细胞核仁荧光探针中。
附图说明
33.图1为利用刚果红和对苯二胺制备荧光碳点的示意图；
34.图2为本发明制得的荧光碳点的透射电子显微镜(tem)图；
35.图3为本发明制得的荧光碳点的一周内的粒径变化图；
36.图4为本发明制得的荧光碳点的紫外
–
可见吸收光谱图；
37.图5为本发明制得的荧光碳点的荧光发射光谱图；
38.图6为对苯二胺单独水热制得的碳点的荧光发射谱图；
39.图7为本发明制得的荧光碳点对a549细胞核仁的长时间成像结果图；
40.图8为本发明制得的荧光碳点和商品化细胞核染料hoechst 33342和核仁染料syto rnaselect对a549细胞的共聚焦成像图的对比图；
41.图9为本发明制得的荧光碳点和核仁染料syto rnaselect对a549细胞核仁染色后的光稳定性对比图；
42.图10为本发明制得的荧光碳点对不同种类细胞的核仁成像效果图；
43.图11为本发明制得的荧光碳点对a549细胞的毒性评价结果图；
44.图12为本发明制得的荧光碳点对斑马鱼活体细胞核仁成像效果图；
45.图13为本发明制得的荧光碳点对斑马鱼活体不同部位的细胞核仁成像效果图；
46.图14为本发明制得的荧光碳点对秀丽隐杆线虫活体细胞核仁成像效果图。
具体实施方式
47.下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
48.实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
49.实施例1
50.红色荧光碳点的制备，包括以下步骤：
51.(1)原料的准备：称取刚果红与对苯二胺，使其质量比为1:2，将两者分别溶于水后(溶解即可)充分混匀并转移至水热反应釜中；
52.(2)反应：在水热反应釜中以200℃反应8h，形成碳点溶液；
53.(3)纯化：将碳点溶液用14000rpm的转速离心10min，取上清液用截留分子量1000da的透析袋在室温下透析4h得到红色荧光碳点的水分散液，即为目标荧光碳点分散液。之后取5ml碳点分散液用冷冻干燥机冻干后得到固体碳点粉末，用微量天平称量出碳点粉末的质量，即可算得制得的碳点分散液原液浓度，后续对其稀释或者浓缩形成不同浓度的碳点分散液。
54.该反应的示意图见图1；制备所得荧光碳点的透射电子显微镜结果见图2，根据统计的结果得出其粒径大小为5.6
±
4.2nm；制备所得荧光碳点一周内的水合动力学尺寸结果见图3，可以发现其粒径大小基本不变，表明碳点的水分散性和稳定性很好；制备所得荧光碳点的紫外
–
可见吸收光谱见图4，其特征吸收峰为490nm；制备所得荧光碳点在不同波长激发下的荧光发射光谱见图5，其最大激发波长为490nm，最大发射波长为630nm，表明该碳点具有较大的斯托克斯位移和红色荧光发射；采用相同反应条件以及单独的对苯二胺原料制备得到的碳点荧光发射光谱见图6，其最大发射波长为520nm(黄色荧光)，远小于本发明制备得到的碳点，证明刚果红组分的必要性。
55.实施例2
56.实施例2荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(1)中刚果红与半对苯二胺的物质的量比为1:1。
57.实施例3
58.实施例3荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(1)中刚果红与半对苯二胺的物质的量比为1:3。
59.实施例4
60.实施例4荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(1)中刚果红与半对苯二胺的物质的量比为1:4。
61.实施例5
62.实施例5荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(1)中刚果红与半对苯二胺的物质的量比为1:6。
63.实施例6
64.实施例6荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(1)中刚果红与半对苯二胺的物质的量比为1:10。
65.实施例7
66.实施例7荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(2)中，反应条件为：在140℃下反应24h。
67.实施例8
68.实施例8荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(2)中，反应条件为：在160℃下反应12h。
69.实施例9
70.实施例9荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(2)中，反应条件为：在180℃下反应8h。
71.实施例10
72.实施例10荧光碳点的制备步骤与实施例1相同，不同之处在于：步骤(2)中，反应条件为：在200℃下反应4h。
73.实施例11
74.测试实施例1所制得的荧光碳点对a549细胞的长时间成像效果，方法如下：
75.(1)细胞培养：将a549细胞在dmem完全培养基中于37℃、5％co2环境中培养，待细胞密度达到80％左右时，用胰酶消化并通过流式细胞仪计数，将消化下来的a549细胞接种于96孔板中，使最终每个孔中细胞数量为5
×
103个，之后该96孔板仍于37℃、5％co2环境中继续保持24h；
76.(2)长时间染色观察：将步骤(1)中96孔板取出，取其中一个孔用ph 7.4的磷酸缓冲液(pbs)洗孔中细胞3次，加入100μl碳点分散液(50μg/ml，由实施例1制备碳点原液稀释得到)后，在不同时间点(1、2、4、8、12和24h)时用552nm的激光作为激发光，使用共聚焦显微镜观察。长时间染色结果见图7，可以发现即使长达24h后，本发明制备的荧光碳点仍然可以实现高质量的核仁成像效果。
77.实施例12
78.测试实施例1所制得的荧光碳点对比商品化染料对a549细胞的成像效果，方法如下：
79.(1)细胞培养：同实施例11(1)；
80.(2)细胞固定：将步骤(1)中96孔板取出，用ph 7.4的磷酸缓冲液(pbs)洗孔中细胞
3次，取1个孔加入200μl预冷的甲醇，于
‑
20℃放置10min备用；
81.(3)细胞染色：分别用ph 7.4的pbs配制1μm的核仁染料(syto rnaselect来自于赛默飞世尔科技有限公司)溶液、2μm细胞核染料(hoechst 33342来自于默克公司)溶液和浓度为100μg/ml的碳点分散液。而后用ph 7.4的pbs清洗步骤(2)细胞(分经甲醇固定与未固定两组)3次，其中未固定组取一个孔加入50μl hoechst 33342和50μl的碳点分散液，固定组的孔加入50μl syto rnaselect和50μl的碳点分散液。最后96孔板于37℃、5％co2环境中与细胞共孵育15min；
82.(4)共聚焦荧光显微镜成像观测：用波长为405、488和552nm的激光作为激发光，其中hoechst 33342染料在405nm激光激发下发出蓝色荧光，syto rnaselect染料在488nm激光激发下发出绿色荧光，而碳点在552nm激光激发下发出红色荧光。荧光成像结果见图8。由成像结果可发现碳点可选择性地使核仁成像，并且碳点的背景噪声更小、成像效果更好。更重要的是，商品化syto rnaselect染料只能用于固定细胞(死细胞)的核仁染色而无法用于活细胞的核仁成像，而碳点则能同时实现固定细胞(死细胞)和活细胞的核仁成像。
83.实施例13
84.测试实施例1所制得的荧光碳点和商品化核仁染料(syto rnaselect)的光稳定性对比，方法如下：
85.(1)细胞培养：同实施例11(1)；
86.(2)细胞固定：同实施例12(2)；
87.(3)细胞染色：用ph 7.4的pbs清洗步骤(2)中的细胞(分经甲醇固定与未固定两组)3次，其中未固定组加入100μl碳点分散液(50μg/ml)；固定组加入100μl的核仁染料(500nm)后放入培养箱孵育15min；
88.(4)共聚焦荧光显微镜成像观测：用波长为488和552nm的激光作为激发光，其中syto rnaselect染料在488nm激光激发下发出绿色荧光，而碳点在552nm激光激发下发出红色荧光。用30％输出强度的488nm的激光照射syto rnaselect染料处理组不同时长(0、1、3和5min)并观察成像效果；用30％强度的552nm的激光照射本发明制备的碳点处理组不同时长(0、1、3和5min)并观察成像效果。荧光成像结果见图9，由结果可以发现商品化染料在光照下很快被淬灭，而本发明制备的碳点则具有极好的光稳定性。
89.实施例14
90.测试实施例1所制得的荧光碳点对b16以及hp细胞的核仁成像效果，其方法同实施例11，其中只进行碳点的染色，结果如图10。由图10可见，实施例1所制得碳点对上述两种不同细胞均具有优异核仁靶向成像的性能。
91.实施例15
92.测试实施例1所制得的荧光碳点的细胞毒性，步骤如下：选择肺癌细胞(a549)，配制成5
×
104个/ml的细胞悬液，将其分别与终浓度为0、25、50、100、200、400和800μg/ml的荧光碳点混合孵育24h后，利用酶标仪采用噻唑蓝(mtt)检测法评价荧光碳点对a549细胞的毒性。结果见图11。实验结果表明经过浓度高达800μg/ml的荧光碳点处理24h后，a549细胞依然有90％以上的存活率，说明该碳点具有良好的生物相容性。
93.实施例16
94.测试实施例1所制得的荧光碳点对斑马鱼活体成像效果，步骤如下：选取正常发育
的斑马鱼卵进行染色实验，在斑马鱼胚胎发育到24和36hpf(hpf代表斑马鱼卵受精后的发育时间)时，取1个胚胎置于含有200μg/ml荧光碳点的斑马鱼培养液中染色10min。随后将染色过的胚胎吸入96孔板中，并加入10μl的ms222麻醉剂对斑马鱼进行麻醉，最后将装有斑马鱼胚胎的96孔板放置在荧光共聚焦显微镜下观察。利用共聚焦显微镜对斑马鱼胚胎进行成像，观察碳点染色情况。共聚焦结果表明(图12)，该荧光碳点可以实现高质量的斑马鱼胚胎表皮细胞核仁的荧光成像。
95.为了进一步观察实施例1所制得的荧光碳点对斑马鱼活体成像效果，在实施例16的基础上对斑马鱼的部分部位进行了放大成像。共聚焦结果表明(图13)，该荧光碳点可以实现非常细致的体内成像效果，这对斑马鱼相关的研究来说非常重要。
96.实施例17
97.测试实施例1所制得的荧光碳点对秀丽隐杆线虫活体成像效果，步骤如下：首先选取正常发育到成虫阶段的线虫，将线虫放入含有200μg/ml荧光碳点的pbs缓冲液(ph7.4)中染色10min后，滴加10μl盐酸四咪唑溶液(4mg/ml)麻醉线虫5min。将麻醉后的线虫滴加到载玻片上，用共聚焦显微镜观察线虫的染色情况，相关成像结果见图14。由图14可知，该荧光碳点可实现高质量的线虫体内细胞核仁的荧光成像。