1.本发明涉及农药制剂技术领域，具体涉及一种用于防治松材线虫及其媒介昆虫的新型纳米农药制剂。


背景技术：

2.松材线虫病(bursaphelenchus xylophilus)又称松树萎蔫病、松树癌，是由我国重大外来入侵物种松材线虫引起的毁灭性森林灾害，可感染40多种松树，如黑松、欧洲红松和日本红松等；此外，该病还具有很强的传播性，这成为松材线虫病防控的严重壁垒。目前，由于没有行之有效的防控措施而给我国乃至世界林业带来不可估计的经济损失。松墨天牛(monochamus alternatus)是松材线虫的媒介昆虫，通过成虫取食松树针叶而传播松材线虫，其幼虫钻蛀取食松树也对松树造成重大危害。
3.目前，针对松材线虫及其媒介昆虫松墨天牛的防治主要包括生物防治、化学防治和物理防治。而化学防治被认为是最行之有效的解决办法，当然其它两种防治的辅助将能倍速的推进化学防治的进程。化学防治作为一种高效的防治手段被广泛的研究，商品化的试剂有乳油制剂、微胶囊混悬剂等通过注干或喷洒的方式施药，然而从实际的应用我们发现并为带来突破性效果。比如阿维菌素(avermectin，avm)作为一种典型的生物农药，是一种高效广谱的杀虫剂，用于防治松材线虫及天牛类幼虫效果较好，但因其存在水溶性差、持效期较短，有效利用率降低等缺点，这样不仅用药量大，防治费用高，而且也不可避免地造成严重的环境污染。因此，结合农药自身缺陷以及干扰松材线虫和松墨天牛的靶基因亟待设计稳定的载药缓释体系、高效的传输渗透体系、超高灵敏度的监测成像体系等构建新型智能纳米农药，并开展新的递送手段的机理机制研究。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于防治松材线虫及其媒介昆虫的新型纳米农药。本发明有效解决了传统农药制剂药效低，可控性差，无法杀死树干内害虫、害虫易产生抗药性等问题。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明的第一方面，提供dmsns作为载体在如下1)～4)任一项中的用途；
7.1).负载阿维菌素；
8.2).负载异硫氰酸荧光素；
9.3).制备纳米农药；
10.4).制备荧光标记物。
11.优选的，所述dmsns由以下方法制备：
12.(1)将纯净水进行油浴加热，滴加三乙醇胺并搅拌30min，然后加入十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸钠，继续搅拌反应1h，再加入原硅酸四乙酯继续搅拌反应2h，得到反应液；
13.(2)将步骤(1)得到的反应液在4℃下第一次离心得到沉淀，洗涤沉淀，第二次离心后向沉淀中加入甲醇和浓盐酸，进行超声分散，然后在水浴下搅拌反应三次，每次反应6h，第三次离心收集沉淀，将得到的沉淀加入纯净水中在-20℃下冷冻24h或-80℃下冷冻1h后进行冻干，得到细腻白色粉末即为dmsns。
14.优选的，所述dmsns的尺寸为200-400nm。
15.优选的，步骤(1)中，所述油浴加热的温度为80℃；所述纯净水、三乙醇、十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸钠和原硅酸四乙酯的加入量之比为25ml：60.7μl：380mg：168mg：4ml。
16.优选的，步骤(2)中，所述甲醇和浓盐酸的体积比为120：(0.24～1.54)；所述水浴的温度为60℃；所述第一次离心、第二次离心和第三次离心的速率均为11000rpm，离心时间均为10min；所述冻干的温度为-56℃，时间为48h。
17.本发明的第二方面，提供一种荧光标记物，所述荧光标记物的制备方法为：将fitc溶于纯净水中得到fitc溶液；将dmsns加入到fitc溶液中，搅拌2h后在4℃下离心，得到dmsns-fitc即为荧光标记物。
18.优选的，所述fitc溶液的浓度为0.025mg/ml；所述dmsns与fitc溶液加入的体积比为1:2。
19.本发明的第三方面，提供一种负载阿维菌素的纳米农药制剂，由以下方法制备：
20.将阿维菌素溶于甲醇中得到阿维菌素溶液；再将dmsns分散到阿维菌素溶液中，搅拌24-72h，离心收集沉淀，干燥，得到纳米农药制剂。
21.优选的，所述阿维菌素溶液的浓度为(1～19)mg/ml；所述阿维菌素溶液与dmsns加入的体积比为1:4。
22.本发明的第四方面，提供负载阿维菌素的纳米农药制剂在防治松材线虫及其媒介昆虫中的用途。
23.将上述纳米农药制剂分散到水中，采用无人机喷洒，进行松材线虫及其媒介昆虫成虫的防治；或者，将上述纳米农药制剂分散到水中，采用注射的方式注入到松树中，进行松材线虫及其媒介昆虫幼虫的防治。
24.本发明的有益效果：
25.(1)本发明首次以dmsns为载体负载农药阿维菌素，制备得到纳米农药制剂；其中，作为载体的dmsns粒径均匀稳定，分散性好；而且dmsns外壳为树枝状多孔结构，具有较大的比表面积，载药量高，并且具有很好的缓控释效果。
26.(2)本发明所制备的纳米农药制剂由于其纳米尺寸，可以穿透植物的细胞壁屏障，将药物运输到树皮内，用于防治松材线虫及其媒介昆虫。
27.(3)本发明的dmsns使用一锅法合成，合成方法简单、产率高、可以省去繁复工序，适合工业化生产，使用的有机溶剂可以回收利用，对设备要求低，不会造成环境污染，具有广阔的市场应用前景。
28.(4)阿维菌素吸附进dmsns后，可以有效防止阿维菌素的快速光解，大大提高了药物的利用率，并且减少了药剂的施用次数，实现了农药减量，环境友好。
附图说明
29.图1为实施例1制备的dmsns的扫描电镜形貌图。
30.图2为实施例1制备的dmsns的透射电镜形貌图。
31.图3中，(a)为实施例2制备的dmsns的粒径分布图，(b)为对比例1制备的dmsns的粒径分布图，(c)对比例2制备的dmsns的粒径分布图。
32.图4为实施例1制备的dmsns的微孔分布图。
33.图5为实施例1制备的dmsns的bet图。
34.图6为实施例1制备的dmsns的光降解图(其中a代表avm在310nm的uv光下的光降解速率、b代表avm@dmsns在310nm的uv光下的光降解速率、c代表avm在黑暗中的光降解速率、d代表avm@dmsns在黑暗中的光降解速率)。
35.图7为室温条件下实施例1制备的avm@dmsns在不同ph的pbs缓冲液下缓释速率图。
36.图8为实施例1制备的dmsns-fitc在天牛幼虫的体壁荧光分布图(a)和气门荧光分布图(b)。
37.图9为实施例1制备的在自然光和荧光条件下的dmsns-fitc在天牛幼虫的肠道荧光分布(a)及明场图(b)、肠道横切面的荧光分布图(c)及明场图(d)以及对df-1细胞的共聚焦图像(e)。
38.图10为树干四层结构的划分示意图。
39.图11为阿维菌素在树干中的分布情况。
具体实施方式
40.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
41.本发明中的“室温”，是指温度为25℃-35℃。
42.正如背景技术所介绍的，松材线虫及其媒介昆虫是全球性的林业检疫病虫害，是松树重要的蛀干害虫，是松材线虫以及其它线虫的传播媒介和潜在传播媒介昆虫。而且目前对于松材线虫及其媒介昆虫缺少非常有效的防治措施，从松树外部施药很难杀死树干内的松材线虫及其媒介昆虫；通过注射的方式将农药注射到树干中是较好的防治方式，但是大多数的农药均为疏水性的，很难在树干内运输，无法实现对松材线虫及其媒介昆虫的胃毒或触杀。
43.已有研究表明，室内生物测定法已确定5％的阿维菌素乳油对松材线虫有极强的毒杀性，应用阿维菌素注干施药预防松材线虫病，是控制松材线虫病的一种有效、简便的方法，是预防具有重要价值的松树感染松材线虫病的有效手段。然而，阿维菌素是疏水性的，而且易光解。因此，目前的技术难点在于阿维菌素配制成哪种剂型用于防治松材线虫及其媒介昆虫。为了解决阿维菌素疏水性和易光解的问题，有专家学者曾将阿维菌素制备成微胶囊的形式，但是微胶囊容易出现团聚现象，这就制约了阿维菌素在防治中的应用。
44.基于此，本发明提供了一种用于防治松材线虫及其媒介昆虫的新型纳米农药，以dmsns为载体负载阿维菌素，能够有效分散在水中，并能在树干内运输，实现了对松材线虫及其媒介昆虫的胃毒或触杀。本发明所使用的dmsns，目前主要是作为吸附剂和催化剂，还没有关于将dmsns应用至生产农药制剂中的相关研究，更没有关于如何通过dmsns负载农药阿维菌素防治松材线虫及其媒介昆虫的报道。
45.由于dmsns的尺寸、结构以及所带电荷的性质会影响其载药量、缓释效果和分散效果。本发明对dmsns的制备方法进行了优化，由于反应原料、反应溶剂的种类及配比会影响所制备的dmsns的产率、尺寸、结构以及所带电荷，因此，本发明对制备dmsns的原料、溶剂的种类及用量进行了考察，使本发明所制备的dmsns产率在98％以上，dmsns的尺寸在200-400nm之间，粒径均匀分散且稳定；dmsns带负电荷，每个纳米粒子之间有同等电荷排斥现象，因此使得其分散性好、无团聚现象。zeta电位可以反应分散性，本发明制备的dmsns的zeta电位绝对值在20mv以上，具有较好的分散稳定性。
46.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
47.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
48.实施例1:负载阿维菌素的纳米农药制剂的制备
49.(1)将60.7μl的三乙醇胺加入到25ml纯净水中，在80℃的油浴锅中搅拌30min，得到三乙醇胺溶液；
50.(2)将380mg十六烷基三甲基溴化铵和168mg水杨酸钠溶于步骤(1)所制备三乙醇胺溶液中，继续80℃油浴搅拌1h；
51.(3)将4ml(原)硅酸四乙酯加入到步骤(2)所制备的溶液中，80℃继续搅拌2h；反应结束后，11000rpm离心10min得到沉淀，并用乙醇洗涤去除未反应物质，然后再次11000rpm离心10min收集沉淀；
52.(4)在步骤(3)所得的沉淀中加入1.54ml 36wt％的浓盐酸和120ml甲醇在60℃条件下反应三次，每次6h，11000rpm离心10min以去除十六烷基三甲基溴化铵。沉淀中加入5ml纯净水冷冻至-56℃，然后在-56℃下冷冻干燥48h，得到dmsns，所得dmsns的产率为95.0％。
53.dmsns的产率＝(dmsns的实际产量/dmsns的理论计算产量)
×
100％。
54.(5)取阿维菌素溶于甲醇，得到浓度为19mg/ml的阿维菌素溶液。
55.(6)将dmsns搅拌加入到阿维菌素溶液中，所述阿维菌素溶液和dmsns加入的体积比为1:4，继续搅拌72h，离心收集沉淀，甲醇溶液反复洗涤，在-56℃下冷冻干燥48h，获得dmsns负载阿维菌素的新型农药。
56.所得新型农药的载药量为68.8％，平均粒径为317nm，孔径22.3nm。
57.其中，载药量＝包理进dmsns中的阿维菌素的质量/包埋阿维菌素的纳米粒子的总质量
×
100％
58.包埋进dmsns中的阿维菌素的质量通过紫外分光光度计测量，然后利用标准曲线计算出浓度，再乘以溶液体积，换算出质量。
59.本实施例制备的dmsns负载阿维菌素的扫描电镜、透射电镜如图1和图2所示，dmsns负载阿维菌素的粒径分布图如图3所示。
60.实施例2:
61.(1)将60.7μl的三乙醇胺加入到25ml纯净水中，在80℃的水浴中搅拌30min；
62.(2)将380mg十六烷基三甲基溴化铵和168mg水杨酸钠溶于步骤(1)所制备的水-三乙醇胺溶液中，继续80℃水浴搅拌1h；
63.(3)将4ml(原)硅酸四乙酯加入到步骤(2)所制备的溶液中，80℃水浴继续搅拌2h；
反应结束后，离心得到沉淀，并用乙醇洗涤去除未反应物质；
64.(4)在步骤(3)所得的沉淀中加入240μl36wt％的浓盐酸和120ml甲醇在60℃条件下反应6h三次，11000rpm离心10min以去除十六烷基三甲基溴化铵，沉淀中加入5ml纯净水冷冻至-56℃，然后在-56℃下冷冻干燥48h，得到dmsns，所得dmsns的产率为98.0％。
65.(5)取阿维菌素溶于甲醇，得到浓度为1mg/ml的阿维菌素溶液。
66.(6)将dmsns搅拌加入到阿维菌素溶液中，所述阿维菌素溶液和dmsns加入的体积比为1:4，继续搅拌72h，离心收集沉淀，甲醇溶液反复洗涤，在-56℃下冷冻干燥48h，获得dmsns负载阿维菌素的新型农药。
67.所得新型农药的载药量为69.0％，平均粒径为319nm，孔径19.1nm。
68.实施例3
69.(1)首先向三口圆底烧瓶中加入25ml纯净水，然后放入搅拌子并置于油浴锅中，上方安装好冷凝回流装置后将油浴锅加热至热80℃，取60.7μl三乙醇胺(tea)滴入三口瓶中，转速调到出现旋涡即可，搅拌30min；然后向其中加入380mg十六烷基三甲基溴化铵(ctab)和168mg水杨酸钠(nasal)，继续搅拌反应1h后向其中加入4ml(原)硅酸四乙酯(teos)，继续搅拌反应2h，然后将上述溶液在4℃，11000rpm条件下离心10min得到沉淀，用无水乙醇洗涤3次沉淀，以除去反应物质，同样条件离心收集沉淀，将沉淀转入烧杯中，加入搅拌子，向沉淀中加入120ml甲醇和1.54ml 36wt％的浓盐酸超声分散，60℃水浴下磁力搅拌反应6h，同样条件离心收集沉淀以除去模板，所得到的沉淀加入5ml纯净水冷冻之后放入冻干机48h冻干，得到细腻白色粉末即为dmsns。
70.(2)取5mgfitc溶于200ml纯净水中，超声溶解得到fitc溶液；取5mgdmsns加入到10ml fitc溶液中，加入搅拌子，放置于磁力搅拌器上以300rpm搅拌2h后在4℃，11000rpm的条件下离心10min即可得dmsns-fitc。
71.因为阿维菌素没有荧光，dmsns是通过物理吸附阿维菌素，未发生反应，因此，本技术利用荧光染料fitc替代阿维菌素制备dmsns-fitc，有荧光的地方即为药物所能到达的部位。本发明中所有的荧光图都是经过dmsns-fitc处理的。
72.具体的处理方法：
73.1)使用dmsns-fitc处理天牛幼虫2min，然后反复冲洗，利用体视镜观察松墨天牛幼虫表面的荧光分布和气门处荧光分布(图8)。说明本发明制备的纳米农药粘附性好，并且可以快速进入害虫体内。
74.2)将dmsns-fitc处理的松墨天牛幼虫的肠道解剖出来，置于4％的多聚甲醛固定液中固定24h，然后石蜡包埋，做后肠的横切面切片，在荧光显微镜下观察荧光分布情况(图9abcd)。
75.3)dmsns-fitc孵化df-1细胞4h，多次洗涤细胞，去除未结合的dmsns-fitc，在激光共聚焦显微镜下观察dmsns-fitc对细胞的摄取情况(图9e)。
76.对比例1
77.(1)将60.7μl的三乙醇胺加入到25ml纯净水中，在80℃的油浴锅中搅拌30min；
78.(2)将380mg十六烷基三甲基溴化铵和168mg水杨酸钠溶于步骤(1)所制备的水-十六烷基三甲基溴化铵-水杨酸钠-三乙醇胺溶液中，继续80℃搅拌1h；
79.(3)将4ml(原)硅酸四乙酯和1.6ml 1，2-双(三乙氧基甲硅烷基)加入到步骤(2)所
制备的溶液中，80℃继续搅拌2h；反应结束后，离心得到沉淀，并用乙醇洗涤去除未反应物质；
80.(4)在步骤(3)所得的沉淀中加入240μl 36wt％的浓盐酸和120ml甲醇在60℃条件下反应6h三次，以去除模板，得到dmsns，所得dmsns的产率为69.0％。
81.(5)取阿维菌素溶于甲醇，得到浓度为1mg/ml的阿维菌素溶液。
82.(6)将dmsns搅拌加入到阿维菌素溶液中，所述阿维菌素溶液和dmsns加入的体积比为1:4，继续搅拌48h，离心收集沉淀，甲醇溶液反复洗涤，冷冻干燥，获得dmsns负载阿维菌素的新型农药。
83.所得新型农药的载药量为37.3％，平均粒径为376nm，孔径20.4nm。
84.对比例2
85.(1)按照《枝状介孔二氧化硅纳米颗粒的制备及载释性能测试》(化工技术与开发，2017年9月，第46卷第9期)中的方法制备dmsns：
86.准确移取7.5ml三乙醇胺(tea)至装有200ml蒸馏水的烧杯中，加入380mg十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，再加入一定量的三氟乙酸钠(fc2)，烧杯上方用玻璃片盖住以隔绝空气，置于80℃恒温水浴中，磁力搅拌1h后添加一定量正硅酸乙酯(teos)，继续搅拌2h，得到乳白色悬浊液。反应结束后，将溶液离心分离，得到白色固体。将白色固体放入马弗炉中，600℃下焙烧6h，除去表面活性剂，得到dmsns。
87.(2)取阿维菌素溶于甲醇，得到浓度为19mg/ml的阿维菌素溶液。
88.将dmsns搅拌加入到阿维菌素溶液中，所述阿维菌素溶液和dmsns加入的体积比为1:4，继续搅拌72h，离心收集沉淀，甲醇溶液洗涤，获得dmsns负载阿维菌素的新型农药。
89.所得新型农药的载药量为25.1％，平均粒径为310nm，孔径14nm。
90.对比例2制备的dmsns对设备要求高，耗费大量能源，成本高，温度控制难度大，致使产物的产率不定，高温无法搅拌致使粒径很难均一，稳定。
91.试验例所以载药量低
92.1.分散性试验
93.对比例1～2制备的纳米农药、实施例2制备的纳米农药置于水中，在水中的分布情况见图3。由图3可知，采用本发明方法制备的纳米农药在水中分散性好。
94.2.传输速率试验
95.实施例2和对比例1的区别在于对比例1增加了一种溶剂，为了考察使用不同溶剂制备dmsns对负载阿维菌素后纳米农药传输速率的影响，按照阿维菌素的浓度为1mg/l、10mg/l、50mg/l，将实施例2和对比例1制备的纳米农药分别用水进行配制。然后分别注射到六棵直径相近，健康状况相同的松树树干中(注射深度均相同，均注射在图10中的第1层的表层)。
96.注：由于实施例2和对比例1制备的纳米农药是阿维菌素负载到纳米载体上的，所以注射时根据阿维菌素的浓度计算纳米载体的浓度。根据计算出的纳米载体的浓度配置相应溶液注射到树干中。纳米载体的浓度＝阿维菌素的浓度/纳米载体的载药量。
97.根据图10将树干截面由外向内分成四层(即layer1～layer4)，6棵松树中每层的长度均相同。24h后，在注射位置，根据这四层的深度钻取碎屑，用高效液相仪分别检测碎屑中阿维菌素的浓度，所得结果见图11。由图11可知，阿维菌素的浓度为50mg/l时，对比例1制
备的纳米农药出现在第2层，而实施例2制备的纳米农药已出现在第4层。说明本发明制备的纳米农药其在树干中的传输速度更快，传输效率更高。
98.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。