1.本发明设计植物组织培养
技术领域：
：，具体设计一种人参不定根组织培养方法。
背景技术：
：：2.人参，五加科人参属多年生草本植物，中国吉林长白山道地中药材之一，名列“东北三宝”之首，素有“百草之王”的美誉。人参皂苷作为人参中主要的活性成分之一，其在抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节、改善中枢神经疾病系统等方面有很好的功效。但由于它们生长周期长,易受气候、栽培条件以及病虫害的影响,给常规育种及种质资源保存带来极大困难，而且种植时间长，有效成分含量低，难以满足人们的需求。因此组织快繁技术是解决这一问题的有效手段之一，不定根由于没有外源基因,在产品的开发方面更有优势,近几年来越来越受到组织培养研究者的重视。[0003]植物不定根的发生方式分为两大类：一类是直接发生，直接从外植体上生成不定根；另一类是间接发生，可以从体细胞胚胎进一步发育而形成的再生小植株上分离得到,也可以先产生愈伤组织，再通过愈伤组织形成拟分生组织最终形成不定根。目前研究报道人参不定根的诱导基本以第二类发生方式为主。迄今为止,采用人参外植体直接诱导不定根的相关研究较少,基本都以人参愈伤组织进行不定根的诱导，本研究以人参叶片、种胚、嫩茎为材料直接进行不定根直接诱导,可以缩短不定根的诱导时间，且取材容易，以期为人参不定根中人参皂苷等物质进一步的生产调控及其开发利用提供材料。技术实现要素：[0004]本发明的目的是针对人参野生资源少，但对人参皂苷的需求却越来越大，对人参资源造成很大破坏，因而利用组培技术诱导不定根，本发明克服了现有技术不定根诱导所需时间长的问题，提供一种人参不定根直接诱导的方法。[0005]本发明的技术解决方案是：一种人参不定根直接诱导的方法，其步骤如下：（1）以人参种苗叶片、茎段和种胚作为外植体，其不定根诱导培养基为：ms基本培养基+naa（0.6~1.0mg/l）+iba（0.5~1.5mg/l）；培养基中附加琼脂8.0g/l,蔗糖15g/l，调节ph至6.0，在25℃，湿度60%，黑暗条件下培养。[0006]本发明的优点是：相对于先用外植体脱分化诱导出愈伤组织，再用愈伤组织诱导不定根的途径，本发明培养基和方法步骤有利于人参不定根的生成，步骤简洁，生根率高，可操作性强，从外植体接种到不定根生成只需30天左右，属于直接一步诱导。经统计计算，人参种胚不定根诱导率为88.42%，叶片不定根诱导率为68.88%，茎段不定根诱导率为35.34%。[0007]下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。附图说明[0008]图1为人参叶片诱导不定根图2为人参种胚诱导不定根图3为人参茎段诱导不定根具体实施方式利用人参叶、胚、茎直接诱导不定根的方法，其步骤如下：1材料与方法1.1材料及处理将打破休眠的饱满人参种子种于蛭石：草炭：珍珠岩为5:3:1的基质中，水浇透，种苗日龄24天，将种苗的叶、茎，用水洗净表面灰尘，叶片先用体积分数75%的乙醇涮洗30s，用无菌水冲洗3次后移入体积分数0.1%升汞溶液浸泡10min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，祛除损伤组织后切成0.5cm2的菱形小块，无菌刀划伤叶片,将叶片的背面紧贴培养基进行培养；茎段先用体积分数75%的乙醇涮洗30s，用无菌水冲洗3次后移入体积分数0.1%的升汞溶液浸泡15min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，去除损伤组织切成1cm小段，无菌刀划伤茎，将茎平置与培养基表面进行培养；种子冲洗去掉表面泥沙，在0.1%的hgcl2溶液中浸泡消毒10s，再用流水冲洗10分钟，剥掉种壳，用体积分数75%的酒精涮洗30s，用无菌水涮洗3次，再用0.1%的hgcl2溶液浸泡15分钟，用无菌水涮洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，用无菌镊子和手术刀剥出种胚，将种胚胚根部位插入培养基进行培养。[0009]1.2人参叶、胚、茎不定根的诱导方法以ms为基本培养基，培养基中附加萘乙酸naa（0.6~1.0mg/l）、吲哚丁酸iba（0.5~1.5mg/l），琼脂粉8.0g/l,添加蔗糖15g/l，调节ph至6.0，全部放置在25℃，湿度60%，黑暗条件下培养。为提高不定根诱导率和生根时间，通过正交试验设计，以外植体类型、naa浓度、iba浓度为实验因素，选用l9(34)表，每个试验处理接5瓶，每瓶接10个外植体，重复3次，筛选人参叶、胚、茎诱导不定根的萘乙酸和吲哚丁酸最佳浓度配比。每隔5天观察不定根诱导情况，40d后统计不定根诱导率和生根数。不定根诱导率计算方法：不定根诱导率（%）=不定根诱导外植体数目/接种外植体数目×100%。[0010]2结果与分析实验所得数据（表1）根据极差分析结果可知（表2），r外植体类型》riba》rnaa，在人参不定根的诱导中，外植体类型是人参不定根诱导最主要的影响因子，各因素的影响因子大小依次为：外植体》iba》naa。经方差结果可知，外植体类型和iba浓度达到了极显著水平（p《0.01），naa浓度达到了显著水平（p《0.05），且外植体的f值最大，且与其他两因素f值相差较大，说明外植体类型的影响最大。对于人参不定根诱导来说，种胚为最适合诱导不定根的外植体，其次为叶片、茎段，最适合人参种胚不定根诱导的培养基为b1c2，适合叶片诱导不定根的培养基为b2c2，适合茎段诱导不定根的培养基为b1c3。人参叶片在20天时愈伤化表面有大量白色凸起基点，随后小突起渐渐变形为锥状，35天后基本伸长为不定根；种胚在15天膨大子叶底部有白色突起，25天后基本从子叶突起部分长出不定根；茎在24天时愈伤化严重，变得疏松，30天左右从愈伤化处长出不定根。且由叶片诱导出的不定根根数较多，根短且细，底部黄色根尖白色；由种胚诱导出的不定根根簇较密集，根呈淡黄色；由茎段诱导出的不定根，稀疏根白，其长势都比较良好，待根长至1cm左右时均可切下进行液体培养。[0011]表1人参不定根诱导激素筛选的l9(34)正交实验设计与结果table1l9(34)orthogonalexperimentdesignandresultsofginsengadventitiousrootinductionhormonescreening表2正交试验极差方差分析结果通过以上实验结果可知，影响不定根诱导的因素是外植体类型、naa（0.6~1.0mg/l）、iba（0.5~1.5mg/l），其中最主要影响因素是外植体类型，因此选择合适的外植体是诱导是否成功的关键，其次是iba浓度、naa浓度，确定诱导不定根的最佳外植体为种胚，其次为叶片、茎段;诱导培养基为:ms培养基+naa（0.6~1.0mg/l）+iba（0.5~1.5mg/l）。技术特征：1.一种利用人参叶、胚、茎直接诱导不定根的方法，其特征在于步骤如下：(1)以人参叶、胚、茎作为作为外植体备用；(2)诱导人参不定根生成的培养基为：ms基本培养基+naa(0.6～1.0mg/l)+iba(0.5～1.5mg/l)，培养基中附加琼脂粉8.0g/l，蔗糖15g/l，调节ph至6.0，在25±2℃下黑暗培养35后得到不定根.2.按照权利要求1所述的利用人参叶、胚、茎为外植体诱导不定根的方法，其特征在于选用生长30天的种苗叶、茎，用水洗净表面灰尘，叶片先用体积分数75％的乙醇涮洗30s，用无菌水冲洗3次后移入体积分数0.1％升汞溶液浸泡10min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，祛除损伤组织后切成0.5cm2的菱形小块，无菌刀划伤叶片，将叶片的背面紧贴培养基进行培养；茎段先用体积分数75％的乙醇涮洗30s，用无菌水冲洗3次后移入体积分数0.1％的升汞溶液浸泡15min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，去除损伤组织切成1cm小段，无菌刀划伤茎，将茎平置与培养基表面进行培养；种子冲洗去掉表面泥沙，在0.1％的hgcl2溶液中浸泡消毒10s，再用流水冲洗10分钟，剥掉种壳，用体积分数75％的酒精涮洗30s，用无菌水涮洗3次，再用0.1％的hgcl2溶液浸泡15分钟，用无菌水涮洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，用无菌镊子和手术刀剥出种胚，将种胚胚根部位插入培养基进行培养。3.按照权利要求1所述的利用人参叶、胚、茎为外植体诱导不定根的方法，其特征在于种胚不定根诱导率为88.42％。叶片不定根诱导率为68.88％。茎段不定根诱导率为35.34％。技术总结本发明公开了一种人参不定根组织培养方法，利用人参种胚、叶片、茎段直接诱导人参不定根，其不定根诱导的培养基为：MS培养基+NAA（0.6~1.0mg/L）+IBA（0.5~1.5mg/L），培养基中附加琼脂8g/L，蔗糖15g/L，调节PH至6.0，在25+2℃下黑暗培养后得到不定根。不定根中的皂苷含量高，与一般先以外植体诱导愈伤组织，再用愈伤组织诱导不定根的方法相比，本发明具有不定根诱导快速，重复性高，周期短，取材方便，同时不受自然灾害的影响。受自然灾害的影响。技术研发人员：许永华苗佳琪陈艳阳郝甜甜梁佳受保护的技术使用者：吉林农业大学技术研发日：2021.10.28技术公布日：2022/2/11