1.本发明设计植物组织培养
技术领域：
：，具体设计一种西洋参不定根组织培养方法。
背景技术：
：：[0002]西洋参为五加科植物西洋参的干燥根。具有补气养阴、泻火除烦、养胃生津之功效。人参皂苷作为人参中主要的活性成分之一，其在抗衰老抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节、改善心血管疾病以及对中枢神经系统等方面有很好的作用，具有很高的药用和保健价值。目前，人参皂苷主要从栽培的西洋参中获得，生产成本大，种植周期长、产量低，因此药用植物组织快繁技术是解决这一问题的有效手段之一，不定根由于生长速率快并且次生代谢产物生产能力稳定，再加上它没有外源基因，在产品的开发方面更有优势,近几年来越来越受到组织培养研究者的重视。[0003]植物不定根的发生方式分为两大类：一类是直接发生，直接从外植体上生成不定根；另一类是间接发生，可以从体细胞胚胎进一步发育而形成的再生小植株上分离得到,也可以先产生愈伤组织，再通过愈伤组织形成拟分生组织最终形成不定根。目前研究报道西洋参不定根的诱导基本以第二类发生方式为主。迄今为止,采用西洋参外植体直接诱导不定根的相关研究较少,基本都以愈伤组织进行不定根的诱导，本研究以西洋参叶片、种胚、嫩茎为材料直接进行不定根直接诱导,可以缩短不定根的诱导时间，且取材容易，以期为西洋参不定根中人参皂苷等物质进一步的生产调控及其开发利用提供材料。技术实现要素：[0004]本发明的目的是针对西洋参野生资源少，但对人参皂苷的需求却越来越大，对人参资源造成很大破坏，因而利用组培技术诱导不定根，本发明克服了现有技术不定根诱导所需时间长的问题，提供一种西洋参不定根直接诱导的方法。[0005]本发明的技术解决方案是：一种西洋参不定根直接诱导的方法，其步骤如下：（1）以西洋参种苗叶片、茎段和种胚作为外植体，其不定根诱导培养基为：1/2ms基本培养基+naa（0.4~0.8mg/l）+iba（0~0.8mg/l）；培养基中附加琼脂7.0g/l,蔗糖10g/l，调节ph至6.0，在25℃，湿度60%，黑暗条件下培养。[0006]本发明的优点是：相对于先用外植体脱分化诱导出愈伤组织，再用愈伤组织诱导不定根的途径，本发明培养基和方法步骤有利于西洋参不定根的生成，步骤简洁，生根率高，可操作性强，从外植体接种到不定根生成只需30天左右，属于直接一步诱导。经统计计算，人参种胚不定根诱导率为78.33%，叶片不定根诱导率为64.23%，茎段不定根诱导率为56.77%。[0007]下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。附图说明[0008]图1为西洋参叶片诱导不定根图2为西洋参种胚诱导不定根图3为西洋参茎段诱导不定根具体实施方式利用西洋参叶、胚、茎直接诱导不定根的方法，其步骤如下：1材料与方法1.1材料及处理将打破休眠的饱满西洋参种子种于蛭石：草炭：珍珠岩为5:3:1的基质中，水浇透，种苗日龄24天，将种苗的叶、茎，用水洗净表面灰尘，叶片先用体积分数75%的乙醇涮洗30s，用无菌水冲洗3次后移入体积分数0.1%升汞溶液浸泡10min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，祛除损伤组织后切成0.5cm2的菱形小块，无菌刀划伤叶片,将叶片的背面紧贴培养基进行培养；茎段先用体积分数75%的乙醇涮洗30s，用无菌水冲洗3次后移入体积分数0.1%的升汞溶液浸泡15min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，去除损伤组织切成1cm小段，无菌刀划伤茎，将茎平置与培养基表面进行培养；种子冲洗去掉表面泥沙，在0.1%的hgcl2溶液中浸泡消毒10s，再用流水冲洗10分钟，剥掉种壳，用体积分数75%的酒精涮洗30s，用无菌水涮洗3次，再用0.1%的hgcl2溶液浸泡15分钟，用无菌水涮洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，用无菌镊子和手术刀剥出种胚，将种胚胚根部位插入培养基进行培养。[0009]1.2西洋参叶、胚、茎不定根的诱导方法以1/2ms为基本培养基，培养基中附加萘乙酸naa（0.4~0.8mg/l）、吲哚丁酸iba（0~0.8mg/l），琼脂粉7.0g/l,添加蔗糖10g/l，调节ph至6.0，全部放置在25℃，湿度60%，黑暗条件下培养。为提高不定根诱导率和生根时间，通过正交试验设计，以外植体类型、naa浓度、iba浓度为实验因素，选用l9(34)表，每个试验处理接5瓶，每瓶接10个外植体，重复3次，筛选西洋参叶、胚、茎诱导不定根的萘乙酸和吲哚丁酸最佳浓度配比。每隔5天观察不定根诱导情况，40d后统计不定根诱导率和生根数。不定根诱导率计算方法：不定根诱导率（%）=不定根诱导外植体数目/接种外植体数目×100%。[0010]2结果与分析实验所得数据(表1)根据极差分析结果可知(表2)，r外植体类型＞rnaa＞riba，在西洋参不定根的诱导中，外植体类型亦是西洋参不定根诱导最主要的影响因子，各因素的影响因子大小依次为：外植体＞naa＞iba。经方差结果可知，外植体和生长素naa浓度均达到了极显著水平(p＜0.01)，而iba浓度不显著(p＞0.05)。且外植体的f值最大，说明外植体类型对不定根诱导的影响最大。对于西洋参不定根诱导，由表1可知种胚为最适合诱导不定根的外植体，其次为叶片、茎段，最适合种胚不定根诱导的培养基为b1c2，适合茎段诱导不定根的培养基为b1c3，适合叶片诱导不定根的培养基为b2c2，由叶片诱导出的不定根根数较少，根白有绒毛；由种胚诱导出的不定根根簇较密集，多数根粗而长；由茎段诱导出的不定根根簇非常密集，根白且细，较长。[0011]表1西洋参不定根诱导激素筛选的l9(34)正交实验设计与结果table1l9(34)orthogonalexperimentdesignandresultsofginsengadventitiousrootinductionhormonescreening表2正交试验极差方差分析结果通过以上实验结果可知，影响不定根诱导的因素是外植体类型、naa（0.4~0.8mg/l）、iba（0~0.8mg/l），其中最主要影响因素是外植体类型，因此选择合适的外植体是诱导是否成功的关键，其次是iba浓度、naa浓度，确定诱导不定根的最佳外植体为种胚，其次为叶片、茎段;诱导培养基为:1/2ms培养基+naa（0.4~0.8mg/l）+iba（0~0.8mg/l）+琼脂7g/l+蔗糖10g/l。技术特征：1.一种利用西洋参叶、胚、茎直接诱导不定根的方法，其特征在于步骤如下：(1)以西洋参叶、胚、茎作为作为外植体备用；(2)诱导西洋参不定根生成的培养基为：1/2ms基本培养基+naa(0.4～0.8mg/l)+iba(0～0.8mg/l)，培养基中附加琼脂粉7.0g/l，蔗糖10g/l，调节ph至6.0，在25±2℃下黑暗培养35后得到不定根.2.按照权利要求1所述的利用西洋参叶、胚、茎为外植体诱导不定根的方法，其特征在于选用生长30天的种苗叶、茎，用水洗净表面灰尘，叶片先用体积分数75％的乙醇涮洗30s，用无菌水冲洗3次后移入体积分数0.1％升汞溶液浸泡10min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，祛除损伤组织后切成0.5cm2的菱形小块，无菌刀划伤叶片，将叶片的背面紧贴培养基进行培养；茎段先用体积分数75％的乙醇涮洗30s，用无菌水冲洗3次后移入体积分数0.1％的升汞溶液浸泡15min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，去除损伤组织切成1cm小段，无菌刀划伤茎，将茎平置与培养基表面进行培养；种子冲洗去掉表面泥沙，在0.1％的hgcl2溶液中浸泡消毒10s，再用流水冲洗10分钟，剥掉种壳，用体积分数75％的酒精涮洗30s，用无菌水涮洗3次，再用0.1％的hgcl2溶液浸泡15分钟，用无菌水涮洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，用无菌镊子和手术刀剥出种胚，将种胚胚根部位插入培养基进行培养。3.按照权利要求1所述的利用西洋参叶、胚、茎为外植体诱导不定根的方法，其特征在于种胚不定根诱导率为78.33％。叶片不定根诱导率为64.23％。茎段不定根诱导率为56.77％。技术总结本发明公开了一种西洋参不定根组织培养方法，利用西洋参种胚、叶片、茎段直接诱导人参不定根，其不定根诱导的培养基为：1/2MS培养基+NAA（0.4~0.8mg/L）+IBA（0~0.8mg/L），培养基中附加琼脂7g/L，蔗糖10g/L，调节PH至6.0，在25+2℃下黑暗培养后得到不定根。不定根中的皂苷含量高，与一般先以外植体诱导愈伤组织，再用愈伤组织诱导不定根的方法相比，本发明具有不定根诱导快速，重复性高，周期短，取材方便，同时不受自然灾害的影响。不受自然灾害的影响。技术研发人员：许永华苗佳琪牛晨郝甜甜梁佳受保护的技术使用者：吉林农业大学技术研发日：2021.10.28技术公布日：2022/2/11