1.本发明属于生物农药技术领域，具体涉及异丁子香酚及其甲基化衍生代谢产物在抑制致病疫霉、防治植物病害中的应用。


背景技术：

2.由致病疫霉(phytophthora infestans de bary)导致的番茄与马铃薯晚疫病是我国乃至世界范围里最为严重的农作物病害之一，每年对全球马铃薯产业造成30到100亿美元价值的损失。目前主流的致病疫霉防控手段高度依赖于氟啶胺、代森锰锌等化学合成农药，但由长期高频的化学农药喷施所导致的环境毒性与对人体的潜在生理毒性也日益凸显。如氟啶胺对斑马鱼、非洲爪蛙等水生生物具有急性毒性，且会在斑马鱼体内富集；代森锰锌在人体外细胞系实验中会促使非酒精性脂肪肝程度恶化，且其降解代谢产物可能导致多种人体健康风险。基于上述原因，欧盟已于2021年1月4日起不再批准使用含有代森锰锌的农药。因此，亟需开发对致病疫霉具有良好防治效果且环境友好的新型绿色农药。
3.植物中含有丰富的天然产物，这些物质通常对植物自身的生物胁迫抗性具有重要功能。因此，可以抑制致病疫霉生长的植物天然产物有潜力被开发成为针对这一重要病菌的绿色生物农药。传统的生物农药挖掘技术方案是建立在以生物活性为指导的生物物质分离提纯方法上的。基于这一方法，目前市场上已有包括丁子香酚(cas 97-53-0)、苦参碱(cas 519-02-8)、香芹酚(cas 499-75-2)等源于植物的天然产物被作为防治致病疫霉的生物农药进行销售和使用。其中，丁子香酚(0.3％溶液)在反复田间实验中均表现出不亚于传统化学农药的防治效果，且对番茄植株、马铃薯植株与薯块本身无明显负面影响。丁子香酚是目前针对致病疫霉防治效果最佳的植物源绿色生物农药，但在自然界中是否存在可能对致病疫霉具有更强抑制效果的植物天然产物仍有待进一步探索和验证。
4.与丁子香酚相同，异丁子香酚与甲基异丁香酚均为经欧盟food improvement agents与联合国粮农组织-世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会(jecfa)双重认证的食品调味剂，在常规剂量下对人体无毒性作用。在小鼠注射实验与大鼠口服实验中，丁子香酚、异丁子香酚以及甲基异丁香酚也表现出相仿的ld
50
剂量，可见这三种物质的安全性相当。具体的，丁子香酚、异丁子香酚以及甲基异丁香酚的小鼠注射毒性ld
50
剂量分别为500mg/kg、328mg/kg以及570mg/kg，大鼠口服毒性ld
50
剂量分别为1930mg/kg、1560mg/kg以及2500mg/kg。然而，异丁子香酚以及甲基异丁香酚在抑制致病疫霉、防治植物病害中的研究及应用尚未见报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术中化学农药危害性大、植物源绿色生物农药资源少等问题，本发明的目的在于提供异丁子香酚及其甲基化衍生代谢产物在抑制致病疫霉、防治植物病害中的应用，安全、环保，对致病疫霉具有良好的抑制效果，可广泛应用于马铃薯晚疫病和/或番茄
晚疫病的防治。
6.为实现上述目的，本发明第一方面提供了异丁子香酚及其甲基化衍生代谢产物在抑制致病疫霉菌中的应用。
7.作为本发明进一步的实施方式，所述异丁子香酚对致病疫霉菌的半数抑制浓度ic
50
为65.5mg/l。
8.作为本发明进一步的实施方式，所述异丁子香酚的甲基化衍生代谢产物对致病疫霉菌的半数抑制浓度ic
50
为57.9mg/l。
9.作为本发明进一步的实施方式，所述应用包括防治植物病害。
10.作为本发明进一步的实施方式，所述植物病害包括马铃薯晚疫病和/或番茄晚疫病，所述植物病害的致病菌为致病疫霉菌。
11.作为本发明进一步的实施方式，所述应用包括制备农药。
12.作为本发明进一步的实施方式，所述农药抑制的致病菌包括致病疫霉菌。
13.作为本发明进一步的实施方式，所述农药为由所述异丁子香酚与适当的辅料制成的制剂，或者所述农药为由所述异丁子香酚的甲基化衍生代谢产物与适当的辅料制成的制剂；
14.所述制剂为可溶液剂、水分散性粒剂、水乳剂或可湿性粉剂；
15.优选的，所述农药为可溶液剂；在所述可溶液剂中，异丁子香酚或异丁子香酚甲基化衍生代谢产物的重量百分含量为0.3％，所述农药的施用剂量为90-120毫升/亩；
16.优选的，所述农药为水乳剂；在所述水乳剂中，异丁子香酚或异丁子香酚甲基化衍生代谢产物的重量百分含量为20％，所述农药的施用剂量为30-45毫升/亩。
17.作为本发明进一步的实施方式，所述辅料包括农药载体和农药助剂；
18.所述农药载体为液体载体或固体载体，所述液体载体为去离子水、蒸馏水或自来水，所述固体载体选自高岭土、膨润土、硅藻土、碳酸钙、白炭黑及凹凸棒土中的一种或多种；
19.所述农药助剂选自乳化剂、分散剂、湿润剂、增稠剂、消泡剂、氧化剂、防冻剂、崩解剂、填料中的一种或多种。
20.本发明第二方面提供了应用异丁子香酚及其甲基化衍生代谢产物防治植物病害的方法，所述方法为将所述异丁子香酚或所述异丁子香酚的甲基化衍生代谢产物以杀菌有效量施用到植物的茎叶部、根部或植物种子，施用方式为喷雾、根施或种子包衣；所述植物病害为马铃薯晚疫病和/或番茄晚疫病，所述植物病害的致病菌为致病疫霉菌。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
22.(1)本发明所述的异丁子香酚及其甲基化衍生代谢产物对致病疫霉具有高效的抑制作用，且在同等添加浓度情况下，其抑制效果显著高于丁子香酚；
23.(2)本发明所述的异丁子香酚及其甲基化衍生代谢产物属于植物源来源，用于防治马铃薯晚疫病和/或番茄晚疫病使用时，对环境无污染，对人体无健康危害；
24.(3)本发明所述的异丁子香酚及其甲基化衍生代谢产物作为农药使用时，在植物的播种期、成长期和收获期均可使用，具有施用方法简单，成本低、易于推广应用的优势。
附图说明
25.图1示出了在不同添加浓度下，丁子香酚、异丁子香酚及甲基异丁香酚对致病疫霉的平板生长的抑制情况；
26.图2为在添加不同浓度的丁子香酚、异丁子香酚及甲基异丁香酚时，致病疫霉的菌丝直径对比图；
27.图3为在不同添加浓度下，丁子香酚、异丁子香酚及甲基异丁香酚对致病疫霉的生长抑制率对比图，图中，同等浓度下各不同测试物质间的抑制率具有显著差异的由不同字母a、b或c表示；p《0.05；图中数据由单因素方差分析(one-way anova)对实验结果进行分析得到。
具体实施方式
28.为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
29.下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
30.在本发明的实施例中，所使用的植物源绿色生物农药为丁子香酚(cas97-53-0)，购自北京沃凯生物科技有限公司(货号：v900001；纯度：98％)；丁子香酚的一种同分异构体——异丁子香酚(cas 97-54-1)，购自北京千业达生物科技有限公司(货号：s5757；纯度：98％；顺式转式异构体混合物)；以及异丁子香酚的甲基化衍生代谢产物——甲基异丁香酚(cas 93-16-3)，购自四川省维克奇生物科技有限公司(货号：wkq-02032；纯度：98％；顺式异构体)。
31.在本发明的实施例中，所使用的致病疫霉菌株为t30-4。在本发明的实施例中，所使用的黑麦培养基的配置方法如下：黑麦仁60克，加适量纯水，置于4℃浸泡12-24小时，次日用破壁机粉碎1分钟，过滤去渣，加蔗糖20克，琼脂粉13.5克，定容至1升，121℃高压灭菌20分钟后倒入培养皿降至室温。
32.首先说明本发明第一方面所述的异丁子香酚及其甲基化衍生代谢产物在抑制致病疫霉菌中的应用。本发明所述异丁子香酚的甲基化衍生代谢产物为甲基异丁香酚。
33.本发明实施例中，所述异丁子香酚对致病疫霉菌的半数抑制浓度ic
50
为65.5mg/l。
34.本发明实施例中，所述异丁子香酚的甲基化衍生代谢产物对致病疫霉菌的半数抑制浓度ic
50
为57.9mg/l。
35.异丁子香酚及其甲基化衍生代谢产物(甲基异丁香酚)对致病疫霉生长具有显著抑制效果，且在同等添加浓度情况下，其抑制率显著高于丁子香酚，这两种物质可以作为活性成分或农药用于抑制致病疫霉以及防治由致病疫霉引起的植物病害。
36.因此，在本发明的一些实施例中，所述应用包括防治植物病害。
37.在本发明的一些实施例中，所述植物病害包括马铃薯晚疫病和/或番茄晚疫病，所述植物病害的致病菌为致病疫霉菌。
38.在本发明的一些实施例中，所述应用包括制备农药。
39.在本发明的一些实施例中，所述农药抑制的致病菌包括致病疫霉菌。
40.在本发明的一些实施例中，所述农药为由所述异丁子香酚与适当的辅料制成的制剂，或者所述农药为由所述异丁子香酚的甲基化衍生代谢产物与适当的辅料制成的制剂；
41.所述制剂为可溶液剂、水分散性粒剂、水乳剂或可湿性粉剂。
42.当然，根据具体情况，在其它实施例中，所述制剂也可以为其他农药上允许的剂型，包括但不限于乳油、微乳剂、种衣剂、干悬浮等。
43.优选的，所述农药为可溶液剂；在所述可溶液剂中，异丁子香酚或异丁子香酚甲基化衍生代谢产物的重量百分含量为0.3％，所述农药的施用剂量为90-120毫升/亩；
44.优选的，所述农药为水乳剂；在所述水乳剂中，异丁子香酚或异丁子香酚甲基化衍生代谢产物的重量百分含量为20％，所述农药的施用剂量为30-45毫升/亩。
45.在用作防治植物病害(马铃薯晚疫病和/或番茄晚疫病)的农药时，本发明所述的异丁子香酚及其甲基化衍生代谢产物可作为活性成分直接使用，也可以通过添加农药上可接受的载体、助剂等来配制农药制剂。
46.因此，在本发明的一些实施例中，所述辅料包括农药载体和农药助剂；
47.所述农药载体为液体载体或固体载体，所述液体载体为去离子水、蒸馏水或自来水，所述固体载体选自高岭土、膨润土、硅藻土、碳酸钙、白炭黑及凹凸棒土中的一种或多种；
48.所述农药助剂选自乳化剂、分散剂、湿润剂、增稠剂、消泡剂、氧化剂、防冻剂、崩解剂、填料中的一种或多种。
49.在本发明的一些实施例中，上述辅料(农药载体和农药助剂)可以根据常法进行适当地使用，具体成分和用量可以根据需要通过试验确定，在此并无特别限定。
50.上述农药制剂可由常规的加工方法制备，即将活性成分(异丁子香酚或甲基异丁香酚)与液体载体或固体载体混合后，加入一种或多种如乳化剂、分散剂等上述农药助剂中的一种或多种。在各种情况下，应确保上述农药制剂中活性成分均匀分布。
51.当然，在本发明的一些实施例中，也可以将异丁子香酚或甲基异丁香酚与其它农用活性成分混合，制成所需剂型，应用于抑制致病疫霉以及防治植物病害。
52.本发明第二方面提供了应用异丁子香酚及其甲基化衍生代谢产物防治植物病害的方法，所述方法为将所述异丁子香酚或所述异丁子香酚的甲基化衍生代谢产物以杀菌有效量施用到植物的茎叶部、根部或植物种子，施用方式为喷雾、根施或种子包衣；所述植物病害为马铃薯晚疫病和/或番茄晚疫病，所述植物病害的致病菌为致病疫霉菌。
53.实施例1异丁子香酚与甲基异丁香酚对致病疫霉的抑制效果测试
54.在黑麦培养基中添加不同浓度的测试物质(异丁子香酚、甲基异丁香酚)，以等浓度的丁子香酚与无添加培养基为对照，通过致病疫霉菌饼接种后的生长速率实验，测试了异丁子香酚及甲基异丁香酚对致病疫霉的生长抑制效果。
55.具体的，在菌饼接种培养7天(18摄氏度暗培养)后测量各个培养基上的菌丝辐射生长直径。通过dunnett检测比较各测试物质于检测浓度下菌丝辐射生长直径与空白对照组中菌丝生长直径的差异。
56.致病疫霉生长抑制率根据下述公式进行计算：
57.生长抑制率＝(空白对照组平均直径
–
测试组各生物学重复直径)/空白对照组平均直径
58.各测试物质间抑制效率的比较则通过在同一浓度下的单向方差检测与tukey hsd检测(每个测试物质在每个检测浓度设有10个生物学重复)。由此检测在多个浓度均具有一致的显著差异的物质即被认为在对致病疫霉的抑制效率上具有显著差异。同时，通过将每个测试物质在各检测浓度的平均生长抑制率进行logistic回归分析即可计算出各测试物质的ic
50
值。测试结果如表1所示。由表1可知，异丁子香酚对致病疫霉菌的半数抑制浓度ic
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为65.5mg/l，甲基异丁香酚对致病疫霉菌的半数抑制浓度ic
50
为57.9mg/l，显著低于丁子香酚(ic
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：152.2mg/l)。
59.如图1和图2所示，在等浓度添加条件下，相比于无添加培养基对照，在40mg/l丁子香酚、异丁子香酚及甲基异丁香酚添加时，致病疫霉菌的辐射生长直径显著减小，并随各测试物质浓度上升进一步减小。
60.进一步比较各物质在等浓度条件下对致病疫霉的抑制率，结果如图3所示。由图3可知，异丁子香酚及甲基异丁香酚在各个测试浓度均比丁子香酚具有更强的致病疫霉抑制率；同时在较低浓度下(40mg/l及60mg/l)，甲基异丁香酚的致病疫霉抑制率显著高于异丁子香酚；而在120mg/l浓度下，异丁子香酚的致病疫霉抑制率显著高于甲基异丁香酚。
61.表1丁子香酚、异丁子香酚与甲基异丁香酚对致病疫霉的抑制效率
[0062][0063]
上述测试结果表明，异丁子香酚及其甲基化衍生代谢产物(甲基异丁香酚)对致病疫霉生长具有显著抑制效果，且在同等添加浓度情况下，其抑制率显著高于丁子香酚，由此表明这两种物质具有作为农药用于由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病/番茄晚疫病防治等开发应用价值。
[0064]
参照已上市丁子香酚农药施用剂量，异丁子香酚及其甲基化衍生代谢产物(甲基异丁香酚)可制备成有效成分含量为0.3％(重量)的可溶液剂，以90-120毫升/亩施用，或可制备成有效成分含量为20％(重量)的水乳剂，以30-45毫升/亩施用。
[0065]
需要说明的是，尽管本文已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围，其中未尽详细描述的技术参数在本发明列举的参数范围内变化时，仍能够得到与上述实施例相同或相近的技术效果，仍属与本发明的保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其它相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。