1.本发明涉及一种萝卜小孢子培养方法，属于一种植物小孢子的培养方法，专用于提高萝卜游离小孢子胚胎发生率的方法。


背景技术：

2.萝卜(raphanus sativus l)为十字花科萝卜属一、二年生草本植物，栽培萝卜主要分为中国萝卜和四季萝卜两个亚种，中国萝卜为大型萝卜、四季萝卜为小型萝卜。中国萝卜是原产于我国的重要根菜类蔬菜作物，以膨大肉质直根为主要产品器官，是我国大众蔬菜之一、年种植面积达130万hm2，在蔬菜生产供应中占有重要地位。
3.国内萝卜新品种选育多采用常规育种技术，选择效率低，育种年限长，又因萝卜是异花授粉作物，多代自交易导致萝卜根变小、变劣等种性退化相关的问题发生，极大地制约了萝卜产业的发展。
4.单倍体具有单套染色体组，经染色体加倍成双单倍体后应用于优势育种，可显著加快品种选育进程。游离小孢子培养是作物产生单倍体的有效途径之一，是植物单倍体育种的重要手段。游离小孢子培养/花药培养技术可直接从花蕾或花药中获得新鲜的小孢子群体，在单细胞水平上获得基因型纯系植株，进而利用单倍体加倍技术获得性状稳定的双单倍体(dh)纯合体，大大缩短亲本基因型纯合时间，加快育种进程，提高品种育种效率。
5.萝卜是十字花科中最不容易进行游离小孢子培养的蔬菜作物，小孢子胚胎发生率低，是萝卜小孢子培养中急需解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明正是针对现有技术存在的不足，提供了一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法，用以解决萝卜小孢子胚胎发生率低的技术问题，满足实际使用要求。
7.为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：
8.本发明提供了一种提高萝卜小孢子胚胎发生率的方法，包括以下步骤：
9.(1)根据最低气温的相应高低选取适宜的花蕾并进行低温(变温)预处理20～24h；
10.单核靠边期小孢子占比最多的萝卜花蕾，其长度一般为2.5～3.5mm，但花蕾大小(长度、发育进展等)受温度影响较大；最低气温低于10℃时选长度为3.0～3.5mm的花蕾(单核靠边期小孢子占比最多)，最低气温高于10℃时选择长度为2.5～3.0mm的花蕾(单核靠边期小孢子占比最多)。
11.将选取的花蕾置于4℃下预处理8～10h，接着置于6℃下预处理12～14h。
12.(2)将步骤(1)的花蕾消毒后加入ph5.8的b5提取液中进行提纯，获得提纯后的小孢子；
13.(3)将步骤(2)的提纯后的小孢子悬浮在ph5.8的1/2nln-13(添加0.25mg/l 6-ba)培养基中，32.5℃下热激处理6～8h后，室温下静置暗培养，得到肉眼可见的胚状体；
14.(4)将步骤(3)的胚状体振荡培养，获得子叶型胚。
具体实施方式
15.下面将结合具体的实施例来说明本发明的内容。
16.实施例
17.1、实验材料：
18.1)、拟取花蕾的萝卜种株：秋季分别选取满身红萝卜和穿心红萝卜的种根种植于江苏省农业科学院六合基地蔬菜留种大棚内，田间管理同常规。
19.2)、b5培养基。
20.3)、1/2nln-13的制备：
21.在每100ml液体nln中加入13g蔗糖，获得nln-13，将nln-13与水按体积比1：1混合稀释，获得大量元素减半的1/2nln-13培养基。
22.2、具体步骤：
23.1)3月上旬至4月中旬，从满身红萝卜和穿心红萝卜种株上采集花蕾进行游离小孢子培养；
24.单核靠边期小孢子占比最多的萝卜花蕾，其长度一般为2.5～3.5mm，但花蕾大小(长度、发育进展等)受温度影响较大；最低气温低于10℃时选长度为3.0～3.5mm的花蕾(单核靠边期小孢子占比最多)，最低气温高于10℃时选择长度为2.5～3.0mm的花蕾(单核靠边期小孢子占比最多)。
25.将选取的花蕾置于4℃下预处理8～10h，接着置于6℃下预处理12～14h。
26.2)小孢子分离：将上述花蕾以25～30个为一组，经流水冲洗沥干水分备用，在无菌工作台上将选取的花蕾置于灭菌的烧杯中，经75％酒精消毒20s，用2％的次氯酸钠表面消毒15min，无菌水冲洗3遍，转至破碎仪中，2000rmp，30s，加入少量经高温灭菌的b5提取液，挤出小孢子；含小孢子的悬浮液用400目尼龙网过滤，除去较大的组织残渣，收集悬浮液于离心管，1000rmp离心3min，弃去上清液，再加入4mlb5提取液离心，重复3次，弃去上清液，所得沉淀物即为纯净小孢子。
27.3)游离小孢子培养：纯化后的小孢子用1/2nln-13培养液(添加0.25mg/l 6-ba)稀释，保持花粉密度为1.0
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105蕾/ml，以每皿3ml小孢子悬浮液分装入直径为30mm的无菌玻璃培养皿中，用封口膜封口；在32.5℃恒温培养箱中热激处理6～8h后，再转至25℃下静置暗培养。
28.4)待出现肉眼看见的胚状体后，将胚状体转入转速为55rpm的摇床上震荡培养21～27d，得到子叶型胚，统计胚胎发生率。
29.利用该方法，满身红萝卜和穿心红萝卜小孢子胚胎平均发生率由8胚/蕾和3胚/蕾分别提高到15胚/蕾和8胚/蕾。


技术特征：
1.一种萝卜小孢子培养方法，其特征在于：如何提高萝卜游离小孢子胚胎发生率的问题；具体方法为：1)根据最低气温的相应高低选取适宜的花蕾并进行低温(变温)预处理20～24h；单核靠边期小孢子占比最多的萝卜花蕾，其长度一般为2.5～3.5mm，但花蕾大小(长度、发育进展等)受温度影响较大；最低气温低于10℃时选长度为3.0～3.5mm的花蕾(单核靠边期小孢子占比最多)，最低气温高于10℃时选择长度为2.5～3.0mm的花蕾(单核靠边期小孢子占比最多)；将选取的花蕾置于4℃下预处理8～10h，接着置于6℃下预处理12～14h；2)将步骤1)的花蕾消毒后加入ph5.8的b5提取液中进行提纯，获得提纯后的小孢子；3)将步骤2)的提纯后的小孢子悬浮在ph5.8的1/2nln-13(添加0.25mg/l6-ba)培养基中，32.5℃下热激处理6～8h后，室温下静置暗培养，得到肉眼可见的胚状体；4)将步骤3)的胚状体振荡培养，获得子叶型胚。2.根据权利要求1所述的一种萝卜小孢子培养方法，其特征在于：所述步骤1)单核靠边期的小孢子所占的比率最高的花蕾长度受环境最低温度影响较大，因而要根据最低温度的不同，适当微调一下所采集花蕾的标准(长度)；同时低温+变温预处理花蕾，增加了小孢子的活力。3.根据权利要求1所述的一种萝卜小孢子培养方法，其特征在于：所述步骤3)1/2nln-13(添加0.25mg/l 6-ba)培养基(大量元素减半的nln-13培养基)是最适培养基，32.5℃是最佳热激温度。4.根据权利要求1所述的一种萝卜小孢子培养方法，其特征在于所述步骤3)1/2nln-13(添加0.25mg/l 6-ba)培养基，添加0.25mg/l 6-ba明显提高了萝卜游离小孢子胚胎发生率，增加了该项技术的实用性。

技术总结
本发明公开了一种萝卜小孢子培养方法，专用于提高萝卜游离小孢子胚胎发生率的方法，具体方法为：(1)根据最低气温的差异选取适宜大小的花蕾，将选取的花蕾置于4℃下预处理8～10h，接着置于6℃下预处理12～14h；(2)花蕾消毒后加入pH5.8的B5提取液中进行提纯，获得提纯后的小孢子；(3)将提纯后的小孢子悬浮在pH5.8的1/2NLN-13(添加0.25mg/L 6-BA)培养基中，32.5℃下热激处理6～8h后，室温下静置暗培养，得到肉眼可见的胚状体；(4)将胚状体振荡培养，获得子叶型胚。本发明将满身红萝卜和穿心红萝卜小孢子胚胎平均发生率由8胚/蕾和3胚/蕾分别提高到15胚/蕾和8胚/蕾。本发明解决了现有技术存在的问题。现有技术存在的问题。


技术研发人员：苏小俊 刘晓宏 柳李旺 雍明丽 王绮皎 刘哲 王燕 徐良 包崇来 梅时勇 张全杰
受保护的技术使用者：江苏省农业科学院
技术研发日：2021.09.23
技术公布日：2022/2/10