1.本发明涉及纳米农药技术领域，具体涉及一种用于防治松树枯萎病的智能二氧化硅纳米农药。


背景技术：

2.当前，松材线虫病(bursaphelenchus xylophilus)是一种重大的全球性的林业检疫病虫害，严重威胁着世界森林资源以及人类生态环境。目前对松材线虫的防治必须以预防为主，在没有暴发之前，做到及时发现并采取有效措施，防治其媒介昆虫，这是有效减轻其危害程度的基础。我国目前着重对松材线虫开展全面检疫，并采用了天敌防治、疫木监管、引诱剂诱杀、化学防治等方法，由于化学防治具有高效性，所以触杀、内吸和胃毒类，渗透性强的化学农药在松材线虫的实际防治过程中使用较为普遍，比如苦豆碱等传统农药，但因其存在水溶性差、持效期较短，有效利用率低等缺点。因此，如何提高传统农药的水溶解性、靶向性、降解性、控释功能成为了当今研究的热点。
3.从近几年纳米农药的研究和发展来看，纳米技术在农药领域的发展和应用取得了一定的进展和效果，特别是纳米技术和纳米材料的应用不仅可以提高不溶性农药的水基分散特性和生物利用度，加快农药残留的降解过程，改善农药的环境行为和生物安全性；还能减少农作物上农药残留以及对环境的污染，加强对病虫害的化学防治，保护生态环境安全，其中运用拉曼光谱技术在农药残留检测上有操作简单、快速检测、成本低等优势，在农药残留检测领域有着广泛的应用前景。除此之外，现在研发的高效、安全、更稳定的纳米农药新配方还可以减少化学和生物农药的用量，提高农药的发挥效果，增加农作物收成，提高农药利用率，减少残留和污染。因此，纳米农药和纳米技术已成为当今农药领域研究和开发的重点。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于防治松材线虫的新型纳米农药，有效解决了传统农药制剂药效低，可控性差，无法杀死树干内害虫、害虫易产生抗药性等问题。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明的第一方面，提供dmsns作为载体在负载苦豆碱中的用途，所述dmsns由以下方法制备：
7.将纯净水进行油浴加热，滴加三乙醇胺并搅拌30min，然后加入十六烷基三甲基溴化铵和水杨酸钠，继续搅拌反应1h，再加入原硅酸四乙酯继续搅拌反应2h，反应完成后离心得到沉淀，洗涤沉淀，加入甲醇和浓盐酸，在水浴下搅拌反应6h，再次离心、洗涤，得到的白色粉末即为dmsns。
8.优选的，dmsns的尺寸为200-400nm。
9.优选的，所述油浴加热的温度为80℃；所述纯净水、三乙醇、十六烷基三甲基溴化
铵、水杨酸钠和原硅酸四乙酯的加入量之比为25ml：60.7μl：380mg：168mg：4ml。
10.优选的，所述甲醇和浓盐酸的体积比为120：(0.24～1.54)；所述水浴的温度为60℃。
11.本发明的第二方面，提供dmsns-au nps作为载体在负载苦豆碱中的用途，所述dmsns-au nps由以下方法制备：
12.(1)将0.01wt％的haucl4溶液油浴加热至沸腾，倒入柠檬酸三钠溶液，搅拌得到正红色的aunps溶液，冷却至室温，再滴加dttc溶液至aunps溶液变色，向变色后的溶液中滴加mpeg-cooh和mpeg，搅拌反应2h后离心，吸取上清液，将上清液离心后收集沉淀，得到au-peg nps；
13.(2)将dmsns分散于步骤(1)制备的au-peg nps中，搅拌过夜后离心收集沉淀并洗涤，得到dmsns-au nps。
14.优选的，步骤(1)中，所述油浴的温度为155℃；变色后的溶液与mpeg-cooh和mpeg的体积比为4：1：1。
15.优选的，步骤(2)中，所述dmsns与au-peg nps的加入量之比为10mg：200μl。
16.本发明的第三方面，提供一种负载苦豆碱的纳米农药制剂，由以下方法制备：将苦豆碱溶于乙醇中得到苦豆碱溶液；将dmsns或dmsns-au nps分散到苦豆碱溶液中，继续搅拌24-72h，离心收集沉淀，干燥，得到负载苦豆碱的纳米农药制剂。
17.优选的，所述苦豆碱溶液的浓度为40mg/ml；所述苦豆碱溶液与dmsns加入的体积比为1:5；所述苦豆碱溶液与dmsns-au nps加入的体积比为1:5。
18.本发明的第四方面，提供负载苦豆碱的纳米农药制剂在防治松树枯萎病中的应用。
19.本发明的有益效果：
20.(1)本发明首次以dmsns和dmsns-au nps为载体负载农药苦豆碱，制备得到纳米农药制剂；其中，作为载体的dmsns和dmsns-au nps粒径均匀稳定，分散性好；而且它们的外壳都为树枝状多孔结构。dmsns-au nps的介孔内负载小粒径au-peg，具有较大的比表面积，载药量高，并且具有很好的缓控释效果。
21.(2)本发明所制备的纳米农药制剂由于其纳米尺寸，可以穿透植物的细胞壁屏障，将药物运输到树皮内，用于防治松材线虫及其媒介昆虫。
22.(3)本发明的制备的纳米载体和纳米农药制剂使用一锅法合成，合成方法简单、产率高、可以省去繁复工序，适合工业化生产，使用的有机溶剂可以回收利用，对设备要求低，不会造成环境污染，具有广阔的市场应用前景。
23.(4)本发明的dmsns-au-alo nps中的au还负载dttc，可利用拉曼光谱技术在农药残留检测领域有着广泛的应用前景，具有操作简单、快速检测、成本低等优势。
24.(5)苦豆碱吸附进本发明的dmsns-au nps或dmsns后，可以有效防止苦豆碱的快速光解，实现对松材线虫的双重杀灭，还可以大大提高了药物的利用率，并且减少了药剂的施用次数，实现了农药减量，环境友好。
附图说明
25.图1为本发明制备的dmsns(a)和dmsns-au(b)的扫描电镜形貌图。
26.图2为本发明制备的dmsns(a)和dmsns-au(b)的透射电镜形貌图。
27.图3为本发明制备的实施例1制备的纳米农药(a)、实施例2制备的纳米农药(b)、对比例1制备的纳米农药(c)和对比例3制备的纳米农药(d)的粒径分布图。
28.图4为本发明制备的dmsns-au的微孔分布图。
29.图5为本发明制备的dmsns-au的bet图。
30.图6为苦豆碱的标准曲线。
31.图7为实施例1和对比例1制备的纳米农药的缓释曲线。
32.图8为本发明制备的dmsns-alo-fitc在松材线虫媒介昆虫幼虫的无荧光对照(a)、体式镜荧光分布图(b)和体壁沟壑荧光分布图(c)。
33.图9为本发明制备的dmsns-alo-fitc在松材线虫媒介昆虫幼虫的气门荧光分布图。
34.图10为本发明制备的dmsns-alo-fitc在松材线虫媒介昆虫幼虫的he石蜡切片分布图(a)和肠道切片荧光分布图(b)。
35.图11为dapi在df-1细胞上的细胞摄取图(a)，dmsns-alo-fitc在df-1细胞上的细胞摄取图(b)，dapi和dmsns-alo-fitc在df-1细胞上的合成细胞摄取图。
36.图12为本发明制备的dmsns-au-fitc在松材线虫主要传播媒介天牛幼虫体壁的荧光分布图。
37.图13为本发明制备的dmsns-au-fitc在松材线虫主要传播媒介天牛幼虫的he水平切片(a)和he纵切片(b)。
38.图14为本发明制备的dmsns-au-fitc在松材线虫主要传播媒介天牛幼虫的横切面图像，其中(a)为自然光条件下的切面图像，(b)为激发荧光条件下的切面图像。
39.图15为本发明制备的dmsns-au-fitc在松材线虫主要传播媒介天牛幼虫的肠道横切面图像，其中(a)为自然光条件下的切面图像，(b)为激发荧光条件下的切面图像。
40.图16为本发明制备的dmsns-au-alo的细胞摄取图。
41.图17为实施例1制备的纳米农药在树干中的分布情况(a)、对比例1制备的纳米农药在树干中的分布情况(b)以及苦豆碱乳油在树干中的分别情况(c)。
42.图18为树干四层结构的划分示意图。
43.图19为苦豆碱在树干中的分布情况。
具体实施方式
44.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
45.术语说明:
46.本发明中的“室温”，是指温度为25℃-35℃。
47.正如前文中背景技术部分介绍的，松材线虫及其媒介昆虫是全球性的林业检疫病虫害，目前对于松材线虫缺少非常有效的防治措施，从松树外部施药很难杀死树干内的松材线虫；通过注射的方式将农药注射到树干中是较好的防治方式，但是大多数的农药均为疏水性的，很难在树干内运输，无法实现对松材线虫的胃毒或触杀。
48.已有研究表明，苦豆碱已经成为世界上首例用于林间成功防治松材线虫病的天然化合物，应用苦豆碱注干施药预防松材线虫病，是控制松材线虫病的一种有效、简便的方法，是预防具有重要价值的松树感染松材线虫病的有效手段。目前的技术难点在于苦豆碱配制成哪种剂型用于防治松材线虫。
49.基于此，本发明提供了一种用于防治松材线虫的新型纳米农药，所述纳米农药是以dmsns或dmsns-au nps为载体负载苦豆碱，能够有效分散在水中，并能在树干内运输，实现了对松材线虫的胃毒或触杀。本发明所使用的dmsns，目前主要是作为吸附剂和催化剂，还没有关于将dmsns应用至生产农药制剂中的相关研究，更没有关于如何通过dmsns负载农药苦豆碱防治松材线虫的报道。
50.由于苦豆碱的载药量并不会完全依据载体粒径大小以及载体孔径大小来决定，并且载体不同还影响最终制备的纳米农药的传输速率及分散性，dmsns或dmsns-au nps的尺寸、结构以及所带电荷的性质会影响其载药量、缓释效果和分散效果。本发明对dmsns及dmsns-au nps的制备方法进行了优化，由于反应原料、反应溶剂的种类及配比会影响所制备的dmsns或dmsns-au nps的产率、尺寸、结构以及所带电荷，因此，本发明对制备dmsns及dmsns-au nps的原料、溶剂的种类及用量进行了考察，使本发明所制备的dmsns及dmsns-au nps产率在98％以上，dmsns及dmsns-au nps的尺寸在200-400nm之间，粒径均匀分散且稳定；dmsns及dmsns-au nps带负电荷，每个纳米粒子之间有同等电荷排斥现象，因此使得其分散性好、无团聚现象。zeta电位可以反应分散性，本发明制备的dmsns及dmsns-au nps的zeta电位绝对值在20mv以上，具有较好的分散稳定性。本发明中，苦豆碱是物理吸附进dmsns的介孔里，au nps是嵌入到dmsns的微孔里。加入au nps的目的是利用其光学特性和和热学特性，赋予复合材料更多的功能：可以做热成像、做探针、或者热消融，所以本发明制备的是一种智能的复合材料负载苦豆碱。
51.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
52.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
53.实施例1
54.(1)将60.7μl的三乙醇胺加入到25ml纯净水中，在80℃的油浴锅中搅拌30min；
55.(2)将380mg十六烷基三甲基溴化铵和168mg水杨酸钠溶于步骤(1)所制备的水-三乙醇胺溶液中，继续80℃搅拌1h；
56.(3)将4ml(原)硅酸四乙酯加入到步骤(2)所制备的溶液中，80℃继续搅拌2h；反应结束后，离心得到沉淀，并用乙醇洗涤多次去除未反应物质；
57.(4)在步骤(3)所得的沉淀中加入1.54ml 36wt％浓盐酸和120ml甲醇在60℃下反应三次，每次6h，离心以去除十六烷基三甲基溴化铵，得到dmsns，所得dmsns的产率为95.0％。
58.dmsns的产率＝(dmsns的实际产量/dmsns的理论计算产量)
×
100％。
59.(5)取苦豆碱溶于乙醇，得到浓度为40mg/ml的苦豆碱溶液。
60.(6)将dmsns搅拌加入到苦豆碱溶液中，所述苦豆碱溶液和dmsns加入的体积比为1:5，继续搅拌72h，离心收集沉淀，乙醇溶液反复洗涤，冷冻干燥，获得dmsns负载苦豆碱的
新型农药。
61.所得新型农药的载药量为67.2％，平均粒径为305nm，孔径22.3nm。
62.其中，载药量＝包理进dmsns中的苦豆碱的质量/包埋苦豆碱的纳米粒子的总质量
×
100％
63.包埋进dmsns中的苦豆碱的质量通过紫外分光光度计测量，然后利用标准曲线计算出浓度，再乘以溶液体积，换算出质量。
64.实施例2
65.(1)取1g haucl4溶于超纯水中，定容100ml，得到1wt％的haucl4溶液，取2.5ml稀释10倍得到0.01wt％的haucl4溶液，将250ml 0.01wt％haucl4溶液置于500ml的三口烧瓶内，放入油浴锅中冷凝回流，加热至沸腾后，倒入7.5ml 1wt％的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌20min得到aunps溶液。
66.(2)取出放入冰水中冷却至室温，收集。取2mg dttc，分散于1l的超纯水中，搅拌30min，得到3.67mmol/l的dttc溶液备用。将aunps置于磁力搅拌器上，取2mg dttc加入20ml超纯水，向aunps溶液中逐滴滴加dttc溶液至溶液刚好变色。取400ml变色后的溶液，逐滴加入50ml mpeg-cooh和50ml mpeg，搅拌反应2h后离心，用吸管吸取上清液，上清液离心3次，收集沉淀，得到au-peg nps。
67.au-peg的产率＝(au-peg的实际产量/au-peg的理论计算产量)
×
100％。
68.(3)取实施例1制备的dmsns 10mg溶于200μl步骤(2)所制备的au-peg nps中，搅拌过夜后离心收集沉淀，用水洗涤3次，得到dmsns-au nps。
69.(4)取苦豆碱溶于乙醇，得到浓度为40mg/ml的苦豆碱溶液。
70.(5)将dmsns-au nps搅拌加入到苦豆碱溶液中，所述苦豆碱溶液和dmsns-au nps加入的体积比为1:5，继续搅拌72h，离心收集沉淀，乙醇溶液反复洗涤，冷冻干燥，获得dmsns-au nps负载苦豆碱的新型农药。
71.所得新型农药的载药量为70.6％，平均粒径为322nm，孔径23.32nm。
72.其中，载药量＝包理进dmsns-au nps中的苦豆碱的质量/包埋苦豆碱的纳米粒子的总质量
×
100％
73.包埋进dmsns-au nps中的苦豆碱的质量通过紫外分光光度计测量，然后利用标准曲线计算出浓度，再乘以溶液体积，换算出质量。
74.实施例3
75.(1)将60.7μl的三乙醇胺加入到25ml纯净水中，在80℃的水浴中搅拌30min；
76.(2)将380mg十六烷基三甲基溴化铵和168mg水杨酸钠溶于步骤(1)所制备的水-十六烷基三甲基溴化铵-水杨酸钠-三乙醇胺溶液中，继续80℃水浴搅拌1h；
77.(3)将4ml(原)硅酸四乙酯加入到步骤(2)所制备的溶液中，80℃水浴继续搅拌2h；反应结束后，离心得到沉淀，并用乙醇洗涤去除未反应物质；
78.(4)在步骤(3)所得的沉淀中加入240μl浓盐酸和120ml甲醇在60℃条件下反应6h三次，以去除模板，得到dmsns，所得dmsns的产率为94.0％。
79.(5)取苦豆碱溶于乙醇，得到浓度为1mg/ml的苦豆碱溶液。
80.(6)将dmsns搅拌加入到苦豆碱溶液中，所述苦豆碱溶液和dmsns加入的体积比为1:5，继续搅拌72h，离心收集沉淀，乙醇溶液反复洗涤，冷冻干燥，获得dmsns负载苦豆碱的
新型农药。
81.所得新型农药的载药量为66.5％，平均粒径为322nm，孔径20.84nm。
82.实施例4
83.(1)取25ml 0.1％haucl4溶液，定容至250ml，得到0.01％haucl4溶液250ml。
84.(2)然后将haucl4溶液转入500ml双口圆底烧瓶中，加入梭形转头。放入155℃的油浴锅中以10rpm转速加热至溶液沸腾时，迅速倒入7.5ml柠檬酸三钠溶液，搅拌20min，得到正红色aunps溶液。
85.(3)取出放入冰水中冷却至室温，收集。取2mg dttc，分散于1l的超纯水中，搅拌30min，得到3.67mmol/l的dttc溶液备用。将aunps置于磁力搅拌器上，取2mg dttc加入20ml超纯水，向aunps溶液中逐滴滴加dttc溶液至溶液刚好变色。取400ml变色后的溶液，逐滴加入50ml mpeg-cooh和50ml mpeg，搅拌反应2h后离心，用吸管吸取上清液，上清液离心3次，收集沉淀，得到au-peg nps。
86.(4)取实施例3所制备的dmsns10 mg溶于200μl步骤(3)所制备的au-peg nps中，搅拌过夜后离心收集沉淀，用水洗涤3次，得到dmsns-au nps。
87.(9)取苦豆碱溶于乙醇，得到浓度为40mg/ml的苦豆碱溶液。
88.(10)将dmsns-au nps搅拌加入到苦豆碱溶液中，所述苦豆碱溶液和dmsns-au nps加入的体积比为1:5，继续搅拌72h，离心收集沉淀，乙醇溶液反复洗涤，冷冻干燥，获得dmsns-au nps负载苦豆碱的新型农药。
89.所得新型农药的载药量为70.18％，平均粒径为319nm，孔径20.12nm。
90.对比例1
91.(1)将60.7μl的三乙醇胺加入到25ml纯净水中，在80℃的油浴锅中搅拌30min；
92.(2)将380mg十六烷基三甲基溴化铵和168mg水杨酸钠溶于步骤(1)所制备的水-十六烷基三甲基溴化铵-水杨酸钠-三乙醇胺溶液中，继续80℃搅拌1h；
93.(3)将2ml(原)硅酸四乙酯和1.6ml 1，2-双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷加入到步骤(2)所制备的溶液中，80℃继续搅拌12h；反应结束后，离心得到沉淀，并用乙醇洗涤去除未反应物质；
94.(4)在步骤(3)所得的沉淀中加入240μl浓盐酸和120ml甲醇在60℃条件下反应6h三次，以去除模板，得到dmsns，所得dmsns的产率为89.0％。
95.(5)取苦豆碱溶于乙醇，得到浓度为1mg/ml的苦豆碱溶液。
96.(6)将dmsns搅拌加入到苦豆碱溶液中，所述苦豆碱溶液和dmsns加入的体积比为1:5，继续搅拌48h，离心收集沉淀，乙醇溶液反复洗涤，冷冻干燥，获得dmsns负载苦豆碱的新型农药。
97.所得新型农药的载药量为42.7％，平均粒径为276nm，孔径20.4nm。
98.对比例2
99.(1)按照《枝状介孔二氧化硅纳米颗粒的制备及载释性能测试》(化工技术与开发，2017年9月，第46卷第9期)中的方法制备dmsns：
100.准确移取7.5ml三乙醇胺(tea)至装有200ml蒸馏水的烧杯中，加入380mg十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，再加入一定量的三氟乙酸钠(fc2)，烧杯上方用玻璃片盖住以隔绝空气，置于80℃恒温水浴中，磁力搅拌1h后添加一定量正硅酸乙酯(teos)，继续搅拌2h，得到
乳白色悬浊液。反应结束后，将溶液离心分离，得到白色固体。将白色固体放入马弗炉中，600℃下焙烧6h，除去表面活性剂，得到dmsns。
101.(2)取苦豆碱溶于无水乙醇，得到浓度为40mg/ml的苦豆碱溶液。
102.将dmsns搅拌加入到苦豆碱溶液中，所述苦豆碱溶液和dmsns加入的体积比为1:4，继续搅拌72h，离心收集沉淀，无水乙醇溶液洗涤，获得dmsns负载苦豆碱的新型农药。
103.所得新型农药的载药量为35.9％，平均粒径为200nm左右，孔径20nm左右。
104.对比例3
105.利用对比例2制备的dmsns制备dmsns-au nps负载苦豆碱的新型农药：制备步骤同实施例2。
106.所得新型农药的载药量为36.1％，平均粒径为200nm左右，孔径20nm左右。
107.试验例
108.1.缓释试验
109.对实施例1制备的纳米农药和对比例1制备的纳米农药的缓释效果进行考察。试验方法为：
110.分别称取80mg实施例1制备的纳米农药和对比例1制备的纳米农药分别放入250ml锥形瓶中，并各加入100ml水作为释放介质。将锥形瓶放入摇床中，在180rpm，25℃条件下匀速摇晃。通过液相色谱法测定释放介质中的苦豆碱的浓度并计算出释放量。
111.由图7可知，与对比例1的方法制备的纳米农药制剂相比，采用本发明的方法制备的纳米农药制剂持效期长，缓释效果好。
112.2.分散性试验
113.对比例1、对比例3制备的纳米农药、实施例1～2制备的纳米农药置于水中，在水中的分布情况见图3。由图3可知，采用本发明方法制备的纳米农药在水中分散性好。
114.3.1传输速率试验
115.向三棵直径相近、病况相近的疫木(松树)树干中分别注射等量的实施例1制备的纳米农药、对比例1制备的纳米农药以及苦豆碱乳油(浓度按苦豆碱记，均为50mg/l)。将苦豆碱乳油用fitc进行荧光处理(实施例1制备的纳米农药、对比例制备的纳米农药在制备过程中已用fitc进了荧光处理)。24h后，沿疫木的树髓将注射苦豆碱的部分截下，去掉树皮并批成小段，用小动物成像仪对其中的小段进行成像，所得结果见图17。
116.注：由于实施例1和对比例1制备的纳米农药是苦豆碱负载到纳米载体上的，所以注射时根据苦豆碱的浓度计算纳米载体的浓度。根据计算出的纳米载体的浓度配置相应溶液注射到树干中。纳米载体的浓度＝苦豆碱的浓度/纳米载体的载药量。
117.由图17可以看出，实施例1制备的纳米农药在喷洒后很快通过树皮传输进入树干，而对比例1制备的纳米农药，其进入树干的面积较少，而苦豆碱乳油完全不能穿过树皮，树干上并无荧光痕迹。从图17中成像的颜色可以看出，实施例1制备的纳米农药进入树干内的浓度远高于对比例1。说明本发明制备的纳米农药的传输速度快，在树干内运输速度快。
118.3.2传输速率试验
119.按照苦豆碱的浓度为1mg/l、10mg/l、50mg/l，将实施例2和对比例3制备的纳米农药分别用水进行配制。然后分别注射到六棵直径相近，健康状况相同的松树树干中(注射深度均相同，均注射在图18中的第1层的表层)。
120.注：由于实施例2和对比例3制备的纳米农药是苦豆碱负载到纳米载体上的，所以注射时根据苦豆碱的浓度计算纳米载体的浓度。根据计算出的纳米载体的浓度配置相应溶液注射到树干中。纳米载体的浓度＝苦豆碱的浓度/纳米载体的载药量。
121.根据图19将树干截面由外向内分成四层(即layer1～layer4)，六棵松树中每层的长度均相同。24h后，在注射位置，根据这四层的深度钻取碎屑，用高效液相仪分别检测碎屑中苦豆碱的浓度，所得结果见图19。由图19可知，本发明制备的纳米农药其在树干中的传输速度更快，传输效率更高。苦豆碱的浓度为1mg/l时，对比例3制备的纳米农药出现在第2层，但实施例2制备的纳米农药已经出现在第4层。苦豆碱的浓度为50mg/l时，对比例3制备的纳米农药才刚刚出现在第4层。
122.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。