1.本发明属于饲料加工技术领域，具体涉及一种饲料添加剂制备方法。


背景技术：

2.近年来，由于抗生素等化学药品大多在养殖业中被限用或禁用，利用益生菌的优势菌群或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，成为了养殖业中的首选，由于益生菌通过动物消化道生物的竞争性排斥作用，能够抑制有害菌类的生长，同时，还具促进动物的生长和提高饲料转化率。富含益生菌的饲料添加剂对畜产品无毒，对人体也无副作用，是未来养殖业中最具有生命力的绿色饲料添加剂。但，目前市场供应的大多富含益生菌的饲料添加剂都没有从营养价值的角度去考虑，其选用的赋形剂(也称为填充料或稀释剂)大都是一些石粉、碳酸钙、贝壳粉、麦麸、稻壳粉、玉米芯粉等，在考虑到其益生菌饲料添加剂的活菌含量的同时，如何去选择使用添加具有丰富营养性或功能保健性的原料作为填充料，同时还具有活的益生菌的稳定性，这些条件是含有益生菌饲料添加剂的研究重点，提升益生菌饲料添加剂的综合性功效和生产、贮存中的稳定是益生菌饲料添加剂要解决的问题和发展方向。


技术实现要素：

3.针对目前存在的问题，本发明提供了一种饲料添加剂制备方法。。
4.本发明采用的技术方案是：
5.一种饲料添加剂制备方法，包括以下步骤：
6.步骤1：菌种活化及种子液制备
7.将冷冻保存的黑曲霉、里氏木霉株菌种分别接种于pda斜面培养基上进行培养，然后将pda斜面培养菌种接入pda茄形瓶中继续培养，得到黑曲霉种子培养液和里氏木霉种子培养液；
8.产朊假丝酵母菌株接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面进行培养，然后将沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面菌种接入直径90mm的培养皿中继续培养，得到产朊假丝酵母种子培养液；
9.步骤2：柚渣培养基制备
10.按照柚渣77％、麦麸20％、尿素2％、硫酸铵1％、磷酸二氢钾0.1％进行混合，拌入适量水混匀后进行灭菌处理，继续添加适量水使柚渣培养基水分含量为65％；
11.步骤3：发酵处理
12.第一次发酵：将制备好的柚渣培养基移至发酵室内，并接种黑曲霉种子培养液和里氏木霉种子培养液，充分混合后控制发酵室温度为28-30℃，控制发酵过程的空气相对湿度和发酵料温湿度，检查菌体生长情况，是否发出异常气味，培养36h停止发酵，通入100℃水蒸汽10min，关闭发酵室门窗焖20min；
13.第二次发酵：将第一次发酵后的培养料移至另一发酵室，冷却至室温，添加适量
7％的葡萄糖，补充培养料水分至65％，接入产朊假丝酵母种子液，混合后控制发酵室温度为28-30℃，培养48h收集培养料；
14.步骤4：干燥。
15.优选的，在步骤1中，在pda斜面培养基上培养的条件是在28℃下培养48-72h，后放入4℃冰箱保存；在pda茄形瓶中培养的条件是在28℃下培养72h，每个茄形瓶用10ml无菌水分两次洗下。
16.优选的，在步骤1中，在沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面上培养的条件是在28℃下培养48-72h后放入4℃冰箱保存；在培养皿中培养的条件是在28℃下培养72h，每个培养皿用10ml无菌水分两次洗下。
17.优选的，在步骤1中，pda培养基：按照马铃薯200g、蔗糖/葡萄糖20g、琼脂20g混合，加热熔化后加水至1000ml，ph自然，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min；
18.沙氏葡萄糖琼脂培养基：按照葡萄糖40g、动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物10g、琼15g混合，加热熔化后加水至1000ml，ph自然，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min。
19.优选的，在步骤2中，灭菌条件是在121℃灭菌20min。
20.优选的，在步骤2中，柚渣为小柚果丁提取柚皮苷后的废渣，干燥后室温保存，使用前粉碎至约40目。
21.优选的，在步骤3第一次发酵中，黑曲霉种子培养液：里氏木霉种子培养液＝1:1，总接种量为2.0％。
22.优选的，在步骤3第二次发酵中，产朊假丝酵母种子液接种量为2.0％。
23.优选的，在步骤4中，将收集的培养料采用阳光晒干或均匀铺到加热板上或烘箱上40℃烘干至水分含量低于9％，干燥后粉碎即为产品。
24.本发明的有益效果：本产品中富含产朊假丝酵母活菌，在土杂鸡的饲养过程中，添加本饲料添加剂可以有效降低鸡盲肠中的大肠杆菌和沙门氏菌数量，促进乳酸菌和双歧杆菌在盲肠中的定殖和生长，从而促进鸡肠道菌群健康，具有重大的经济和社会效益。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1所示为霉菌灭菌时间对霉菌发酵后培养基中霉菌菌数的影响；
27.图2所示为葡萄糖添加量对产朊假丝酵母数量的影响；
28.图3所示为产朊假丝酵母种子液接种量对产朊假丝酵母数量的影响；
29.图4所示为培养时间对产朊假丝酵母数量的影响；
30.图5所示为水分含量对产朊假丝酵母数量的影响。
具体实施方式
31.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例
中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
32.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.本发明具体提供了一种饲料添加剂制备方法，包括以下步骤：
34.步骤1：菌种活化及种子液制备
35.将冷冻保存的黑曲霉、里氏木霉株菌种分别接种于pda斜面培养基上进行培养，在28℃下培养48-72h，后放入4℃冰箱保存备用。然后将上述pda斜面菌种接入pda茄形瓶(50mlpda制成的大斜面)中，在28℃下培养72h，每个茄形瓶用10ml无菌水分两次洗下，得黑曲霉和里氏木霉的种子培养液。
36.产朊假丝酵母菌株接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面，在28℃下培养48-72h后放入4℃冰箱保存备用；然后将沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面菌种接入直径90mm的培养皿中，在28℃下培养72h，每个培养皿用10ml无菌水分两次洗下，得产朊假丝酵母种子培养液。
37.马铃薯蔗糖琼脂培养基(pda)：配方为马铃薯200g(去皮煮沸后取汁)、蔗糖(葡萄糖)20g、琼脂20g，加热熔化后加水至1000ml，ph自然，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min。
38.沙氏葡萄糖琼脂培养基：葡萄糖40g、动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物10g、琼脂15g，加热熔化后加水至1000ml，ph自然，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min。
39.步骤2：柚渣培养基制备
40.柚渣77％、麸皮20％、尿素2％、硫酸铵1％，磷酸二氢钾0.1％。拌入适量水后混匀后121℃灭菌20min，添加适量水使培养基水分含量约为65％。柚渣为小柚果丁提取柚皮苷后的废渣，干燥后室温保存，使用前粉碎至约40目。
41.步骤3：发酵处理
42.第一次发酵：将制备好的柚渣培养基移至发酵室内，并接种黑曲霉种子培养液和里氏木霉种子培养液，比例为黑曲霉:里氏木霉＝1:1，总接种量为2.0％，充分混合后控制发酵室温度为28-30℃，控制发酵过程的空气相对湿度和发酵料温湿度，检查菌体生长情况，是否发出异常气味，培养36h左右停止发酵，通入100℃水蒸汽10min，关闭发酵室门窗焖20min。
43.第二次发酵：将第一次发酵后的培养料移至另一发酵室，冷却至室温，添加适量7％的葡萄糖，补充培养料水分至65％，接入2.0％的产朊假丝酵母种子液，混合后控制发酵室温度为28-30℃，培养48h收集培养料。
44.步骤4：干燥
45.将收集的培养料采用阳光晒干或均匀铺到加热板上或烘箱上40℃烘干至水分含量低于9％，干燥后粉碎即为产品。
46.单因素试验
47.1、霉菌培养(第一次发酵)
48.霉菌培养期间培养基的感官特征情况见表1。可见当培养28h时，培养基中开始长出白色的菌丝，并且随着时间的延长，菌丝越长越多，并使整个培养基慢慢结成团。培养24h及之前，培养基都有柚皮的辛辣味，随着菌丝的生长，辛辣味逐步减弱，并在32h时基本消失；从36h开始培养基有发霉的味道，40h后霉味变浓。40h时，培养基表面有淡黑色孢子产生，因孢子产生后会使培养基变黑，对后续饲料添加剂产品外观产生不利影响，且孢子在发酵过程中容易从培养基中逸出对培养设施、环境造成不利影响，另外本霉菌培养后的培养基需要经过灭菌再进行下一步产朊假丝酵母培养，相对营养细胞来说，孢子更难杀死，所以从发酵后培养基的感官特征判断，霉菌培养时间控制在36h比较合适。
49.表1霉菌培养过程中培养基的感官特征
[0050][0051]
2、霉菌灭菌(第一次发酵)
[0052]
霉菌发酵后的培养基在100℃水蒸气加热下霉菌菌数的变化见图1，可知当培养基开始受热时，其中的霉菌数量为1.7
×
105cfu/g，受热5min后其中的霉菌数量为4.0
×
104cfu/g，受热10min后其中的霉菌已被全部杀死，故选择杀灭霉菌的受热条件为100℃水蒸气加热10min。
[0053]
3、葡萄糖添加量(第二次发酵)
[0054]
霉菌发酵并灭菌后的培养基中添加葡萄糖对产朊假丝酵母培养的影响见图2，可见随着葡萄糖添加量的增加，发酵后的培养基(含水)中产朊假丝酵母菌数稳步增加，从未添加葡萄糖时的2.55
×
108cfu/g增加到葡萄糖添加量为7％时的8.32
×
108cfu/g，增加了1.26倍；葡萄糖添加量为9％时，产朊假丝酵母菌数则有一定的下降，可能是葡萄糖含量超过一定的比例后会对酵母的生长产生一定的抑制作用。故产朊假丝酵母培养时较为适宜的葡萄糖添加量为7％。
[0055]
4、产朊假丝酵母种子液接种量(第二次发酵)
[0056]
霉菌发酵并灭菌后的培养基中产朊假丝酵母种子液接种量对产朊假丝酵母培养的影响见图3，可知产朊假丝酵母种子液接种量为1％、2％、3％、4％、5％时，发酵后的培养基(含水)中产朊假丝酵母菌数分别为5.52
×
108cfu/g、8.57
×
108cfu/g、8.42
×
108cfu/g、8.86
×
108cfu/g、8.61
×
108cfu/g，除接种量为1％时发酵后的培养基(含水)中产朊假丝酵母菌数明显较低外，其余接种量之间差别不明显，从降低成本考虑选择接种量为2％。
[0057]
5、培养时间(第二次发酵)
[0058]
培养时间对产朊假丝酵母培养的影响见图4，可知培养24h时培养基中的产朊假丝酵母数量为5.03
×
108cfu/g；培养48h、72h、96h时培养基中的产朊假丝酵母数量为分别为8.46
×
108cfu/g、8.92
×
108cfu/g、8.71
×
108cfu/g，培养72h、96h时与48h时相比产朊假丝
酵母数量分别增加了5.44％、2.96％，增加不大。从培养过程观察可知，在培养过程中，少部分培养基从48h开始会有霉菌菌落出现，并在96h时菌落比较明显。因为产朊假丝酵母产品对霉菌数量有要求，为控制好产品质量，培养48h时培养基中产朊假丝酵母菌数较高，且此时培养基中不会出现霉菌，本研究中48h是适合产朊假丝酵母培养的时间。
[0059]
6、水分含量(第二次发酵)
[0060]
培养基中水分含量对产朊假丝酵母培养的影响见图5，可知培养后培养基中的产朊假丝酵母菌数随着水分含量的增加而增加，当水分含量为65％时达到最大值；当水分含量超过65％后培养基中的产朊假丝酵母菌数随着水分含量的增加而减少。产朊假丝酵母培养时培养基的水分含量以65％为好。
[0061]
7、培养料干燥工艺
[0062]
不同干燥方式对培养基中产朊假丝酵母活菌数量的影响见表2，可知随着晒干时间的增加，培养基的水分含量、产朊假丝酵母活菌数量(折算成水分含量为9％时的数量)逐步下降，当培养基晒干至4h时，水分含量降至5.7％，产朊假丝酵母活菌数为2.22
×
108cfu/g，与未晒前相比培养基中的活菌数损失率达90.3％，但仍达到中华人民共和国农业行业标准“ny/t 1969-2010饲料添加剂产朊假丝酵母”中水分≤9.0％、酵母活细胞数≥1亿个/g的规定。随着烘干(烘干温度为40℃)时间的增加，培养基的水分含量、产朊假丝酵母活菌数量(折算成水分含量为9％时的数量)逐步下降，当培养基烘干至6h时，水分含量降至8.7％，产朊假丝酵母活菌数为3.79
×
108cfu/g，与未烘前相比培养基中的活菌数损失率达83.7％，但仍达到相关的规定。
[0063]
表2晒干对培养基中产朊假丝酵母活菌数量的影响
[0064][0065]
注：“活菌数”是指干燥不同时间时测得的培养基中的活菌数折算成水分含量为9％时的数量。
[0066]
实验材料与方法
[0067]
1.饲料添加剂饲养土杂鸡初步研究
[0068]
供试鸡为2日龄土杂鸡，由市场购买。基础日粮为普通全价配合饲料。
[0069]
2.试验动物分组及管理
[0070]
健康的2日龄土杂鸡(60只)，由市场购买。适应性饲喂1周后挑选出体重相近、生长状态正常的鸡，随机分成4组，每组10只，试验期共28d。ⅰ组为空白对照组，饲喂普通全价配合饲料；ⅱ、ⅲ、ⅳ组为试验组，分别在普通全价配合饲料中添加1％、2％、3％的柚渣发酵饲料。前7天采用纸箱平养，后期采用舍内笼养，自由采食、饮水，自然通风光照，防疫程序按常规进行。
[0071]
2.生长发育指标的测定
[0072]
每周空腹称鸡体质量，计算平均日增质量、平均日采食量和料重比等。
[0073]
3.盲肠中微生物测定
[0074]
于试验鸡28日龄时，每重复取3只鸡屠宰，盲肠中食糜，用生理盐水冲食糜于铝盒中，再将处理好的样品放置于-20℃冰箱保存。采用平板涂布法测定鸡粪中微生物数量，大肠杆菌采用麦康凯培养基37℃有氧培养24h进行计数；乳酸杆菌、双歧杆菌和沙门菌分别用乳酸细菌培养基、双歧杆菌肉汤培养基和亚硫酸铋培养基，37℃厌氧培养48h进行计数。
[0075]
结果与分析
[0076]
饲料添加剂饲养土杂鸡初步研究
[0077]
柚渣饲料添加剂对土杂鸡生长性能的影响，如下表所示：
[0078]
表1柚渣饲料添加剂对土杂鸡生长的影响
[0079][0080][0081]
由表1可知，第二周的饲养中，各组鸡体质量平均值在178.1g-181.3g之间，日增质量在13.8g-14.4g之间，日均采食量在23.9g-24.5g之间，料重比在1.70-1.73之间，各同组数据之间差异都不显著。第三周的饲养中，各组鸡体质量平均值在342.4g-368.7g之间，日增质量在23.1g-26.8g之间，日均采食量在38.4g-39.0g之间，料重比在1.48-1.67之间，体质量、日增质量同组数据之间差异比较显著。第四周的饲养中，各组鸡体质量平均值在496.3g-538.6g之间，日增质量在22.0g-24.3g之间，日均采食量在40.0g-40.6g之间，料重比在1.67-1.84之间，体质量、日增质量同组数据之间差异显著。
[0082]
总体上看，各组鸡在饲养过程中，在第二周饲养期间各项指标同组数据之间差异不显著，也没有明显规律。第三、第四周饲养期间体质量、日增质量均有变化，且都比第二周的要高；第二、第三、第四周饲养期间的料重比差异不明显。第三、第四周饲养期间添加了饲料添加剂的组鸡日增质量均比对照组的要高，料重比则比对照组较低(说明添加了饲料添加剂的组饲料转化率较高)；且随着饲料添加剂添加量的增加日增质量越高、饲料转化率越高。
[0083]
柚渣饲料添加剂对土杂鸡肠道菌群的影响，如下表2所示。
[0084]
表2柚渣饲料添加剂对土杂鸡盲肠中微生物数量的影响
[0085][0086]
由表2可知，添加柚渣饲料添加剂能降低土杂鸡盲肠中大肠杆菌和沙门菌数量，ⅰ组、ⅱ组、ⅲ组大肠杆菌数量与对照组相比分别降低了1.13％、3.69％、2.84％，差异显著(p《0.05，下同)；沙门菌数量与对照组相比分别降低了4.52％、5.10％、5.98％，差异显著。添加柚渣饲料添加剂能增加土杂鸡盲肠中乳酸菌和双歧杆菌数量，ⅰ组、ⅱ组、ⅲ组乳酸菌数量与对照组相比分别增加了1.60％、7.37％、7.86％，差异显著；双歧杆菌数量与对照组相比分别增加了7.79％、9.64％、11.0％，差异显著。由此可知，本试验添加的饲料添加剂可以有效降低盲肠中的大肠杆菌和沙门氏菌数量，促进乳酸菌和双歧杆菌在盲肠中的定殖和生长。
[0087]
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。