1.本发明属于纳米材料及其应用的技术领域，具体涉及一种具有强抑菌活性的纳米百里香酚及其制备方法和应用。


背景技术：

2.百里香酚，又称麝香草酚，是百里香、牛至等精油中的主要活性成分，已被欧盟(eu)和美国食品药品管理局(fda)列入食品添加剂gras(一般公认安全)名单，也是我国允许使用的食品添加剂。百里香酚常温下为无色晶体，有百里草或麝香草的气味，微溶于水。国内外已公认，百里香酚具有良好的抗氧化活性和广谱的抑菌活性，且抑菌活性优于香芹酚、丁香酚等其他植物精油，在生鲜农产品产后保鲜领域具有巨大的应用潜能。然而，百里香酚水溶性低、化学不稳定、直接使用会对果蔬等农产品外观品质产生损伤。针对此现状，国内外开展了较多的研究，尝试解决百里香酚溶解性差、稳定性差等局限。
3.多篇专利利用β-环糊精(cn202010505037.5)、壳聚糖(cn202010156575.8)等包埋提高百里香酚的稳定性。本技术发明人的前期专利cn201910468544.3一种基于大豆蛋白纳米复合提高百里香酚稳定性的方法，相比于β-环糊精和壳聚糖，大豆蛋白包埋体系的应用方式和可能性更广，例如溶剂、粉剂、凝胶、喷渍涂膜、浸渍涂膜、包装膜等，但该方法还存在工艺相对复杂、ph偏移处理产业化难度较高、荷载率较低、对致病微生物抑制机制不明确等问题。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明的目的在于提供
5.一种具有强抑菌活性的纳米百里香酚及其制备方法和应用
6.本发明的技术内容如下：
7.本发明提供了一种具有强抑菌活性的纳米百里香酚的制备方法，包括如下步骤：
8.1)将大豆蛋白充分均匀地分散在水中，对得到的大豆蛋白分散液进行预处理，得到大豆蛋白溶液；
9.所述预处理包括加热处理或超声波处理；
10.2)将溶于无水乙醇的百里香酚溶液逐滴加入到大豆蛋白溶液中，充分混合搅拌，离心，将得到的分散液进行干燥处理，即得到纳米百里香酚产品；
11.步骤1)所述大豆蛋白包括大豆分离蛋白spi、商用大豆分离蛋白制品、大豆球蛋白11s、β-伴大豆蛋球蛋白7s的一种或以上；
12.进一步地，所述大豆蛋白还包括大豆球蛋白11s和β-伴大豆蛋球蛋白7s按一定比例混合的重组蛋白；
13.所述大豆分离蛋白spi的制备方法为：将脱脂大豆粉与去离子水混合，加入蛋白酶，并将溶液ph值调节到7.0～8.0，搅拌均匀，低频超声，离心去沉淀，得到蛋白提取液，加入盐酸调节ph直至4.0～5.0，冷冻静置析出蛋白，离心，取沉淀，溶于去离子水中悬浮，调剂
ph至7～8，缓慢搅拌使其溶解，之后进行透析处理和冷冻干燥得到大豆分离蛋白spi；
14.步骤1)所述大豆蛋白分散液中的蛋白浓度为1％～10％；
15.所述加热处理的条件为65～85℃加热30～40min；
16.所述超声波处理的条件为200～250w的功率超声处理10～15min。
17.步骤2)所述溶于无水乙醇的百里香酚的浓度为0.05～1.0kg/l；
18.所述干燥处理包括真空冷冻干燥，具体操作为将分散液置于-25℃下冷冻12-24h，之后在10～30pa真空下，于-50℃下冷冻干燥24～48h。
19.本发明还提供了以上所述的制备方法制得具有强抑菌活性的纳米百里香酚。
20.本发明还提供了一种上述纳米百里香酚在抑制细菌活性方面的应用，所述细菌包括金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
21.本发明的有益效果如下：
22.本发明的具有强抑菌活性的纳米百里香酚的制备方法，制得一种高荷载量、具有水溶性且具有强抑菌活性的纳米百里香酚，通过利用超声波处理或预热处理来定向调控大豆蛋白结构，利用大豆蛋白优越的纳米输送功能，使难溶的百里香酚通过疏水相互作用荷载于大豆蛋白纳米颗粒，最后将其直接冷冻干燥，制得复合型的纳米百里香酚产品，水溶性好、荷载量大、稳定性高，具有一定缓释功能及很强的抑菌活性，且所用原料为健康的食品级原料，对大肠杆菌和金黄葡萄球菌具有较为优异的抑菌活性，能够用于生鲜食品(如农产品)的保藏，并且保持较长时间的气味正常、质地良好、无腐烂变质等的保鲜作用。
附图说明
23.图1为本发明的纳米百里香酚产品的外观、粒径分布及平均粒径；
24.图2为本发明的纳米百里香酚的原子显微镜图；
25.图3为百里香酚、大豆蛋白以及本发明的纳米百里香酚的ftir图谱；
26.图4为百里香酚、大豆蛋白以及本发明的纳米百里香酚的xrd图谱；
27.图5为本发明的纳米百里香酚对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响(a)以及对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细胞膜完整性的影响(b)。
具体实施方式
28.以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定。
29.若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
30.实施例1
31.一种具有强抑菌活性的纳米百里香酚的制备方法
32.1)将商用大豆分离蛋白制品充分均匀地分散在水中形成蛋白浓度为10％的大豆蛋白分散液，进行200w的功率超声处理15min，得到大豆蛋白溶液；
33.2)将溶于无水乙醇的1.0kg/l百里香酚溶液以体积比为1:20的比例逐滴加入到大豆蛋白溶液中，充分混合搅拌，8000g离心10min，将得到的分散液进行真空冷冻干燥处理，将分散液置于-25℃下冷冻12h，之后在30pa真空下，于-50℃下冷冻干燥24h，即得到纳米百
里香酚产品；
34.该干燥样品中百里香酚的荷载量为316mg/g蛋白，荷载率为63.2％，干燥前后百里香酚的损失率约为5.5％，相关干燥样品极易分散于水，而相应的分散液呈透明浅白色溶液(如图1所示)，表明所得干燥产品处于纳米尺寸。
35.经动态激光光衍射(dls)分析确证，如图1所示，大豆蛋白基纳米百里香酚的平均粒径远小于100nm；
36.经原子显微镜(afm)分析确证，如图2所示，大豆蛋白基纳米百里香酚以近乎球形的纳米颗粒存在；
37.如图3、图4所示，经红外光谱(ftir)和x射线衍射xrd分析确证，百里香酚在复合物中以无定型的形式存在；
38.经抑菌活性试验分析，纳米百里香酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(mic)和最小杀菌浓度(mbc)为游离百里香酚的1/2，表明纳米百里香酚相比游离百里香酚的抑菌性更好，经纳米包埋后，百里香酚的抑菌活性得到了增效；
39.如图5所示，通过对生长曲线和细胞膜完整性(相对电导率)分析抑菌机制可知，纳米百里香酚处理后金黄色葡萄球菌的生长曲线发生显著变化，纳米百里香酚主要影响细菌的延缓期，将其从小于2h延长至7h以上，且效果明显优于游离百里香酚；同时纳米百里香酚处理后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的相对电导率显著增大，且效果明显优于游离百里香酚，说明百里香酚可通过破坏细胞膜完整性来抑制致病微生物生长，而纳米百里香酚通过加速这一进程来增效百里香酚的抑菌活性。
40.将实施例1制得的纳米百里香酚配置成溶液，喷渍在新鲜鸡肉上并采用充氮包装，4℃条件下贮藏保鲜期可延长至14天以上，鸡肉气味正常、质地良好、无腐烂变质，效果明显优于对照(充氮包装，鸡肉在第10天即有异味、质地变软)。
41.实施例2
42.一种具有强抑菌活性的纳米百里香酚的制备方法
43.1)将大豆分离蛋白spi充分均匀地分散在水中形成蛋白浓度为8％的大豆蛋白分散液，进行250w的功率超声处理10min，使蛋白适度变性，得到大豆蛋白溶液；
44.所述大豆分离蛋白spi的制备方法为：将脱脂大豆粉与去离子水以体积比为1:4混合，加入15％wt的大豆蛋白酶，采用naoh将溶液ph值调节到7.0～8.0，搅拌均匀，进行50hz低频超声，5000g离心15min去沉淀，得到蛋白提取液，加入盐酸调节ph直至4.0～5.0，冷冻静置析出蛋白，离心，取沉淀，溶于去离子水中悬浮，调剂ph至7～8，缓慢搅拌使其溶解，之后进行透析处理和冷冻干燥得到大豆分离蛋白spi；
45.2)将溶于无水乙醇的0.5kg/l百里香酚溶液以体积比为1:20的比例逐滴加入到大豆蛋白溶液中，充分混合搅拌，8000g离心10min，将得到的分散液置于-25℃下冷冻15h，之后在15pa真空下，于-50℃下冷冻干燥30h，得到纳米百里香酚产品；
46.该干燥样品中百里香酚的荷载量为265mg/g蛋白，荷载率为84.8％，干燥前后百里香酚的损失率约为10.5％，相关干燥样品极易分散于水，而相应的分散液呈透明浅白色溶液；经动态激光光衍射(dls)分析确证，大豆蛋白基纳米百里香酚的平均粒径远小于200nm；经红外光谱(ftir)和x射线衍射xrd分析确证，百里香酚在复合物中以无定型的形式存在。
47.将实施例2制得的纳米百里香酚配置成溶液，喷渍在新鲜猪肉上并采用充氮包装，
4℃条件下贮藏保鲜期可延长至14天以上，猪肉仍保持红色、质地良好、无异味、无腐烂变质，效果明显优于对照(充氮包装，猪肉在第10天即颜色变白、有异味、质地变软)。
48.实施例3
49.一种具有强抑菌活性的纳米百里香酚的制备方法
50.1)将β-伴大豆蛋球蛋白7s充分均匀地分散在水中形成蛋白浓度为1％的大豆蛋白分散液，进行65℃加热处理40min，得到大豆蛋白溶液；
51.2)将溶于无水乙醇的0.05kg/l百里香酚溶液以体积比为1:20的比例逐滴加入到大豆蛋白溶液中，充分混合搅拌，8000g离心10min，将得到的分散液置于-25℃下冷冻20h，之后在20pa真空下，于-50℃下冷冻干燥35h，得到纳米百里香酚产品；
52.该干燥样品中百里香酚的荷载量为187mg/g蛋白，荷载率为74.8％，干燥前后百里香酚的损失率约为10.0％，相关干燥样品极易分散于水，而相应的分散液呈透明浅白色溶液；经动态激光光衍射(dls)分析确证，大豆蛋白基纳米百里香酚的平均粒径远小于100nm；经红外光谱(ftir)和x射线衍射xrd分析确证，百里香酚在复合物中以无定型的形式存在。
53.将实施例3制得的纳米百里香酚配置成溶液，喷渍在新鲜的罗非鱼切片鱼肉上并采用充氮包装，4℃条件下贮藏保鲜期可延长至14以上，鱼肉质地良好、无异味、无腐烂变质，效果明显优于对照(充氮包装，鱼肉在第10天即有异味、质地变软)。
54.实施例4
55.一种具有强抑菌活性的纳米百里香酚的制备方法
56.1)将大豆球蛋白11s充分均匀地分散在水中形成蛋白浓度为4％的大豆蛋白分散液，进行85℃加热处理30min，得到大豆蛋白溶液；
57.2)将溶于无水乙醇的0.25kg/l百里香酚溶液以体积比为1:20的比例逐滴加入到大豆蛋白溶液中，充分混合搅拌，8000g离心10min，将得到的分散液置于-25℃下冷冻24h，之后在10pa真空下，于-50℃下冷冻干燥48h，即得到纳米百里香酚产品；
58.得到该干燥样品中，百里香酚的荷载量为252mg/g蛋白，荷载率为80.6％，干燥前后百里香酚的损失率约为3.7％，相关干燥样品极易分散于水，而相应的分散液呈透明浅白色溶液；经动态激光光衍射(dls)分析确证，大豆蛋白基纳米百里香酚的平均粒径远小于100nm；经红外光谱(ftir)和x射线衍射xrd分析确证，百里香酚在复合物中以无定型的形式存在。
59.将实施例4制得的纳米百里香酚加入吸水衬垫后密封制成具有抑菌作用的衬垫，放入pet包装盒的底层后，加入新鲜猪肉上并采用充氮包装，4℃条件下贮藏保鲜期可延长至14天以上，猪肉仍保持红色、质地良好、无异味、无腐烂变质，效果明显优于对照(充氮包装，猪肉第10天即颜色变白、有异味、质地变软)。
60.实施例5
61.一种具有强抑菌活性的纳米百里香酚的制备方法
62.1)将β-伴大豆蛋球蛋白7s和大豆球蛋白11s分别分散在水中形成蛋白浓度为1.5％的大豆蛋白分散液，以体积比为1:1混合得到重组大豆蛋白，进行230w的功率超声处理12min，得到大豆蛋白溶液；
63.2)将溶于无水乙醇的0.2kg/l百里香酚溶液以体积比为1:20的比例逐滴加入到大豆蛋白溶液中，充分混合搅拌，8000g离心10min，将得到的分散液置于-25℃下冷冻20h，之
后在10pa真空下，于-50℃下冷冻干燥30h，即得到纳米百里香酚产品；
64.得到该干燥样品中，百里香酚的荷载量为498mg/g蛋白，荷载率为74.7％，干燥前后百里香酚的损失率约为11.0％，相关干燥样品极易分散于水，而相应的分散液呈透明浅白色溶液；经动态激光光衍射(dls)分析确证，大豆蛋白基纳米百里香酚的平均粒径远小于100nm；经红外光谱(ftir)和x射线衍射xrd分析确证，百里香酚在复合物中以无定型的形式存在。
65.将实施例5制得的纳米百里香酚加入吸水衬垫后密封制成具有抑菌作用的衬垫，放入pet包装盒的底层后，加入新鲜鸡肉上并采用充氮包装，4℃条件下贮藏保鲜期可延长至14天以上，鸡肉质地良好、无异味、无腐烂变质，效果明显优于对照(充氮包装，鸡肉第10天即有异味、质地变软)。
66.对比例1
67.作为实施例1的对照组，对比例1的制备方法参照专利cn201910468544.3一种水溶性大豆蛋白-百里香酚复合颗粒的制备方法及其应用中实施例1的制备：
68.1)将大豆分离蛋白spi充分均匀地分散在水中形成蛋白浓度为3％的大豆蛋白分散液，搅拌2h后，于4℃冰箱水化8h，取出恢复至室温后，用4m naoh调节ph至12.0，得到大豆蛋白溶液；
69.2)将百里香酚以质量比为2:5的比例加入到大豆蛋白溶液中，充分混合搅拌，用2m hcl将混合溶液ph调至7.0，之后在搅拌600rpm/min条件下室温磁力搅拌下1h，之后8000g离心20min，将得到的分散液进行冷冻干燥处理，即得到纳米百里香酚产品；
70.最后得到的该干燥样品中，百里香酚的荷载量为144.2mg/g蛋白，荷载率仅为36.05％，干燥前后百里香酚的损失率约为10.5％。
71.将对比例1制得的纳米百里香酚配置成溶液，喷渍在新鲜猪肉上并采用充氮包装，4℃条件下贮藏保鲜期可延长至12天，猪肉仍保持红色、质地良好、无异味、无腐烂变质，效果优于对照(充氮包装，猪肉第10天即颜色变白、有异味、质地变软)。
72.对比例2
73.作为实施例1的对照组，对比例2中将步骤1)的超声波处理为以300w的功率处理10min，最后得到该干燥样品中，百里香酚的荷载量为189mg/g蛋白，干燥前后百里香酚的损失率约为20.6％。
74.说明对大豆蛋白的预处理方式中，加热处理或超声波处理的条件需要适度。
75.将对比例2制得的纳米百里香酚配置成溶液，喷渍在新鲜猪肉上并采用充氮包装，4℃条件下贮藏第10天，猪肉仍保持红色、质地良好、无异味、无腐烂变质，效果优于对照(充氮包装，猪肉第10天即颜色变白、有异味、质地变软)。
76.对比例3
77.作为实施例1的对照组，对比例3的步骤2)中，将得到的分散液进行冷冻干燥处理，将分散液置于-50℃、50pa条件下冷冻干燥处理10h，即得到纳米百里香酚产品；
78.最后得到该干燥样品中，百里香酚的荷载量为196mg/g蛋白，干燥前后百里香酚的损失率约为15.3％。
79.将对比例3制得的纳米百里香酚配置成溶液，喷渍在新鲜猪肉上并采用充氮包装，4℃条件下贮藏保鲜期可延长至12天，猪肉仍保持红色、质地良好、无异味、无腐烂变质，效
果优于对照(充氮包装，猪肉第10天即颜色变白、有异味、质地变软)。
80.对比例4
81.作为实施例2的对照组，对比例4的步骤2)中，将得到的分散液进行喷雾干燥处理，设置喷嘴0.7mm，入口温度150℃，上料速度为5.0l/min，喷射气流667l/h，得到纳米百里香酚产品；
82.最后得到该干燥样品中，百里香酚的荷载量为118mg/g蛋白，干燥前后百里香酚的损失率约为33.7％。
83.将对比例4制得的纳米百里香酚配置成溶液，喷渍在新鲜猪肉上并采用充氮包装，4℃条件下贮藏10天后猪肉仍保持红色、质地良好、无腐烂、无异味，效果优于对照(充氮包装，猪肉10天即颜色变白、有异味、质地变软)。
84.将实施例以及对比例所制得的纳米百里香酚产品，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行的抑菌能力进行测试，结果如下表所示。
85.表1纳米百里香酚对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌能力
[0086][0087][0088]
由表1可见，与非纳米包埋的百里香酚(游离百里香酚)相比，本发明制备的纳米百里香酚对两种食源性致病菌的最小抑制浓度(mic)和最小杀菌浓度(mbc)均降低了20～
50％，说明纳米百里香酚的抑菌活性得到了增效，纳米百里香酚具有强的抑菌活性。