1.本发明涉及复方黄柏液涂剂在制备治疗骨髓增生性肿瘤药物中的应用，属于涉及中药应用技术领域。
背景技术：
2.骨髓增生性肿瘤(mpn)是一组造血干/祖细胞恶性增生导致血细胞过度增殖的血液病。骨髓增生性肿瘤分为两大类：第一类是费城染色体阳性的骨髓增生性肿瘤，即慢性髓性白血病；另外一类是经典的费城染色体阴性的骨髓增生性肿瘤，包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化。其中，真性红细胞增多症和原发性血小板增多症发展到后期也会转化为骨髓纤维化。骨髓增生性肿瘤患者因骨髓内造血异常导致髓外造血、脾脏肿大、血栓、骨髓纤维变性等病理症状。中医理论通过对mpn病位、病性及病因病机的深入分析，将mpn命名为“骨髓瘀毒病”，认为此病当属于中医“血瘀”、“积聚”、“眩晕”、“髓枯”、“血痹”和“癥瘕”等范畴。随着病情发展，最终转化为骨髓衰竭或急性白血病。
3.由于恶性肿瘤细胞转移与侵袭等髓外浸润，造成该疾病放疗、化疗等治疗手段效果不佳，即使患者进行骨髓细胞移植，也会因其髓外浸润的肿瘤细胞未被彻底清除而导致疾病复发。目前我国白血病发病率约为2.76/10万，在国内各地区肿瘤类疾病发病率排名第六位，在儿童及35岁以下成人恶性肿瘤致死率中位居第一，严重危害我国人民生命健康。目前临床针对骨髓增生性肿瘤主要以降低过高的血细胞数来缓解脾肿大等症状和预防血栓形成，这些治疗手段虽然可以延长患者生存期，但并不能有效治愈疾病和改善患者生活质量。
4.jak2、mpl和calr基因突变已被证实是mpn的主要致病基因，其中jak2
v617f
突变在真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化分别占95％、59％和 53％，是最常见的突变。mpl和calr突变主要发生在原发性血小板增多症和骨髓纤维化中。近年来研究表明，炎症可能在mpn的发生发展中发挥重要作用。炎性细胞因子的过度产生是许多恶性血液病的共同特征，提示这些细胞因子在血液系统恶性肿瘤发展方面发挥着作用。炎症信号对骨髓微环境和造血干细胞稳态、健康骨髓细胞输出等具有重大影响，炎症可以触发纤维化和血管生成，有助于mpn的发生。因此，通过干预炎症状态修复受损的造血微环境和造血干细胞功能，可作为mpn的治疗新策略。
5.中药方剂复方黄柏液涂剂是由连翘、黄柏、金银花、蒲公英、蜈蚣组成的经典方剂，适用于疮疡溃后、伤后感染等属阳证，收载于2015年版《中国药典》。目前临床上复方黄柏液涂剂常作为皮肤溃疡、感染等疾病的外用药物，具有较好的疗效。
6.虽然复方黄柏液涂剂在临床上已经有广泛的应用，但现有应用中却从未报道过复方黄柏液涂剂在骨髓增生性肿瘤相关疾病的应用。
技术实现要素：
7.针对现有技术的不足，本发明提供了复方黄柏液涂剂在制备治疗骨髓增生性肿瘤
药物中的应用。
8.本发明的技术方案如下：
9.复方黄柏液涂剂在制备治疗骨髓增生性肿瘤药物中的应用。
10.根据本发明优选的，所述骨髓增生性肿瘤为经典的费城染色体阴性的骨髓增生性肿瘤。
11.进一步优选的，所述骨髓增生性肿瘤为真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和骨髓纤维化。
12.根据本发明优选的，所述复方黄柏液涂剂包含以下原料：黄柏、连翘、金银花、蒲公英、蜈蚣。
13.根据本发明优选的，所述复方黄柏液涂剂的有效成分原料的重量配比为：黄柏35～45重量份，连翘70～90重量份，金银花35～45重量份，蒲公英35～45重量份，蜈蚣2.1～2.7重量份。
14.进一步优选的，所述复方黄柏液涂剂的有效成分原料的重量配比为：黄柏40重量份，连翘80重量份，金银花40重量份，蒲公英40重量份，蜈蚣2.4重量份。
15.上述复方黄柏液涂剂的制备方法，包括以下步骤：
16.(1)按重量配比称取黄柏、连翘、金银花、蒲公英和蜈蚣，加水煎煮提取三次；第一次 1小时，第二次45分钟，第三次30分钟；
17.(2)煎液合并，过滤，浓缩滤液至相对密度为1.10-1.15的清膏；
18.(3)加入乙醇，使乙醇含量达70％，静置24小时，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，得清液备用；
19.(4)将步骤(3)所得的清液加水至1000重量份，搅匀，静置，冷藏24小时，滤过，灌装，灭菌，即得。
20.根据本发明优选的，步骤(2)中，所述相对密度是在50℃下进行测量。
21.根据本发明优选的，所述应用是将复方黄柏液涂剂原液提高2～4倍的溶液浓度，采用腹腔注射的方法进行使用。
22.进一步优选的，所述应用是将复方黄柏液涂剂原液提高3倍的溶液浓度，采用腹腔注射的方法进行使用。
23.本发明的技术特点：
24.复方黄柏液主要药理作用包括抗菌，对金葡菌、链球菌、大肠杆菌等临床常见270余株致病菌均有抑制作用；消炎，可下调多种炎性因子蛋白表达，快速减轻红、肿、热、痛等症状；促进愈合，可调节生长因子释放与表达；增强免疫力，显著影响a-msc的免疫调节功能，增强单核巨噬细胞吞噬功能等。骨髓增生性肿瘤主要是起源于造血干细胞的突变，造成以jak/stat信号通路为主的信号通路异常激活，从而导致一系或者多系的血细胞异常增生的疾病。基于此，本发明发现复方黄柏液涂剂可以通过对nf-κb信号通路、tgf-β信号通路、 jak-stat信号通路的干预，进而影响mpn发生发展，对骨髓增生性肿瘤疾病进行干预和治疗。
25.有益效果：
26.1、本发明提供了复方黄柏液涂剂在用于制备治疗骨髓增生性肿瘤药物的应用，特别是在治疗真性红细胞增多症药物和治疗原发性血小板增多症药物应用上的新思路。本发
明首次发现复方黄柏液涂剂在骨髓增生性肿瘤中具有良好的疗效，并在骨髓增生性中肿瘤中进行了实验验证，动物实验结果表明，复方黄柏液涂剂的施用对骨髓增生性肿瘤小鼠模型具有显著的治疗效果，可以显著降低骨髓增生性肿瘤造成的造血干祖细胞和各系血细胞异常增生，减轻脾肿大，减少肿瘤细胞向其他组织的浸润，并抑制原发性血小板增多症向骨髓纤维化的进展。
27.2、复方黄柏液涂剂已在临床上使用，且相较于目前mpn治疗的化学药物价格低廉，使用方便，并且无毒副作用，适于广泛推广使用。
附图说明
28.图1是网络药理学对复方黄柏液涂剂干预骨髓增生性肿瘤疾病的信号通路预测。
29.其中：a为go分析可视化图，b为kegg富集分析柱状图。
30.图2是复方黄柏液涂剂对正常小鼠红细胞变化的影响。
31.图3是复方黄柏液涂剂对正常小鼠白细胞变化的影响。
32.图4是复方黄柏液涂剂对正常小鼠血小板变化的影响。
33.图5是复方黄柏液涂剂对正常小鼠体重变化的影响。
34.图6是复方黄柏液涂剂对正常小鼠脾脏大小的影响。
35.图7是复方黄柏液涂剂对正常小鼠脾脏重量、肾组织和肝脏的重量变化照片。
36.图8是复方黄柏液涂剂对真性红细胞增多症小鼠的红细胞变化的影响。
37.图9是复方黄柏液涂剂对真性红细胞增多症小鼠的血容比变化的影响。
38.图10是复方黄柏液涂剂对真性红细胞增多症小鼠的血红蛋白变化的影响。
39.图11是复方黄柏液涂剂对真性红细胞增多症小鼠的外周血涂片结果图。
40.图12是复方黄柏液涂剂对真性红细胞增多症小鼠的脾脏大小和重量的结果图。
41.图13是复方黄柏液涂剂对真性红细胞增多症小鼠的病理结果图。
42.图14是复方黄柏液涂剂对真性红细胞增多症小鼠的骨髓流式结果图。
43.图15是复方黄柏液涂剂对真性红细胞增多症小鼠的骨髓流式结果图。
44.图16是复方黄柏液涂剂对真性红细胞增多症小鼠的肝脏和肾脏病理切片结果图。
45.图17是复方黄柏液涂剂对真性红细胞增多症小鼠的体重、肝脏和肾脏重量结果图。
46.图18是复方黄柏液涂剂对真性红细胞增多症小鼠的脾脏和骨髓大小的结果图。
47.图19是复方黄柏液涂剂对真性红细胞增多症小鼠的cfu-gemm集落形成结果图。
48.图20是复方黄柏液涂剂对真性红细胞增多症小鼠的cfu-gm集落形成结果图。
49.图21是复方黄柏液涂剂对原发性血小板增多症小鼠白细胞变化结果图。
50.图22是复方黄柏液涂剂对原发性血小板增多症小鼠髓系细胞变化结果图。
51.图23是复方黄柏液涂剂对原发性血小板增多症小鼠血小板变化结果图。
52.图24是复方黄柏液涂剂对原发性血小板增多症小鼠外周血涂片结果图。
53.图25是复方黄柏液涂剂对原发性血小板增多症小鼠外周血流式结果图。
54.图26是复方黄柏液涂剂对原发性血小板增多症小鼠脾脏大小和重量结果图。
55.图27是复方黄柏液涂剂对原发性血小板增多症小鼠胸骨和脾脏的病理切片结果图。
56.图28是复方黄柏液涂剂对原发性血小板增多症小鼠骨髓网织纤维化结果图。
57.图29是复方黄柏液涂剂对原发性血小板增多症小鼠肝脏和肺组织病理切片结果图。
58.图30是复方黄柏液涂剂对原发性血小板增多症小鼠骨髓髓系细胞流式结果图。
59.图31是复方黄柏液涂剂对原发性血小板增多症小鼠骨髓巨核细胞流式结果图。
60.图32是复方黄柏液涂剂对原发性血小板增多症小鼠cfu-gemm集落形成结果图。
61.图33是复方黄柏液涂剂对原发性血小板增多症小鼠cfu-gm集落形成结果图。
62.图34是复方黄柏液涂剂对原发性血小板增多症小鼠体重、肺组织、肝脏和肾脏结果图图35是复方黄柏液涂剂对原发性血小板增多症小鼠生存曲线图。
具体实施方式
63.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结果获得其他的附图。
64.本发明先通过网络药理学对复方黄柏液涂剂干预骨髓增生性肿瘤疾病的信号通路进行了预测，结果如图1所示。本发明通过图1发现复方黄柏液涂剂可以对nf-κb信号通路、 jak-stat信号通路、tgf-β通路造成了干预，进而可以影响mpn发生发展，以下实施例为具体的验证数据。
65.以下实施例中所述复方黄柏液涂剂的有效成分原料的重量配比为：黄柏40重量份，连翘 80重量份，金银花40重量份，蒲公英40重量份，蜈蚣2.4重量份。
66.制备方法包括以下步骤：
67.(1)按重量配比称取黄柏、连翘、金银花、蒲公英和蜈蚣，加水煎煮提取三次；第一次 1小时，第二次45分钟，第三次30分钟；
68.(2)煎液合并，过滤，浓缩滤液至相对密度为1.10的清膏；
69.(3)加入乙醇，使乙醇含量达70％，静置24小时，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，得清液备用；
70.(4)将步骤(3)所得的清液加水至1000重量份，搅匀，静置，冷藏24小时，滤过，灌装，灭菌，即得。
71.实施例1：复方黄柏液涂剂对正常小鼠的毒性实验
72.1、实验动物：
73.清洁级8周龄成年雌鼠c57/bl6小鼠，体重19-21克，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供方，动物合格证编号：syxk(鲁)20200022。
74.2、实验分组：
75.动物在适应环境1周，称量体重后随机分为两组，即对照组和给药组，每组8只。
76.3、给药方法：
77.每天下午对给药组小鼠和对照组小鼠进行腹腔注射给药，给药组用3倍浓缩的复方黄柏液涂剂按0.3ml/20g体重的比例给药，连续给药21天，对照组给药时间和给药途径与
给药组一致，以pbs缓冲液代替药物。
78.4、观察指标：
79.4.1外周血指标变化实验
80.所有小鼠在给药前后监测小鼠外周血中各指标的变化。每周对小鼠进行割尾巴取血，放入edta抗凝管中，通过血项检测仪检测外周血中的各项成分进行分析。
81.4.2毒性检测实验
82.小鼠给药21天后，处死小鼠，进行取材，取小鼠脾脏、肾脏、肝脏、肺组织记录其重量。
83.5、实验结果：
84.5.1外周血检测实验结果：见图2-4。
85.由图2-4结果可知，正常小鼠注射复方黄柏液涂剂对小鼠正常造血功能无影响，外周血中白血胞、红细胞和血小板数量无明显差异。
86.5.2毒性检测实验结果：见图5-7。
87.由图5结果可知，正常小鼠给予复方黄柏液涂剂注射后对小鼠体重无影响。
88.由图6-7结果可知，正常小鼠给予复方黄柏液涂剂腹腔注射后对小鼠的脾脏大小和重量无影响，小鼠的肾脏重量和肝脏重量与对照组相比也无明显差异。
89.6、实验结论
90.与对照组小鼠相比，给药组小鼠外周血中红细胞、白细胞和血小板均无明显异常，不影响正常小鼠的造血功能。另外给药21天后小鼠体重及各器官重量均无明显变化，表明复方黄柏液涂剂腹腔注射用药安全，无毒副作用。
91.实施例2：复方黄柏液涂剂对骨髓增生性肿瘤中epo
high
诱导的真性红细胞增多症的治疗效果实验
92.1、实验动物：
93.清洁级8周龄成年雌鼠c57/bl6小鼠，体重19-21克，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物合格证编号：syxk(鲁)20200022。
94.2、实验分组：
95.动物在适应环境1周后，称量体重而后随机分为3组，即正常对照组，模型组和模型给药组，每组8只。
96.3、真性红细胞增多症模型建立方法：
97.采用epo
high
的小鼠真性红细胞增多症模型。
98.epo
high
模型建立方法如下：小鼠腹腔注射重组人促红素注射液，5000ui/kg，每2天注射一次，持续21天，建立小鼠红细胞升高为主的真性红细胞增多症，之后继续每2天注射一次，维持疾病症状。
99.4、给药方法：
100.在模型建立成功后，每天下午腹腔注射给药，连续给药23天。模型给药组用三倍浓缩的复方黄柏液涂剂按照0.3ml/20g的比例给药，正常对照组和模型组的给药时间及途径与模型给药组一致，以pbs缓冲液替代药物。
101.5、观察指标：
102.5.1外周血指标变化实验
103.所有小鼠在造模前，造模后及给药过程中检测小鼠外周血各指标的变化。每周对小鼠进行割尾巴取血，放入edta抗凝管中，通过血项检测仪检测血液中成分进行分析。
104.5.2小鼠外周血涂片实验
105.在模型组小鼠给药23天后，小鼠眼球取血，涂片，may-gr
ü
nwald染色室温5分钟，转移至磷酸盐缓冲液中1.5分钟，wright-giemsa染色15分钟，用清水冲洗两次，晾干，封片，在显微镜下拍片记录。
106.5.3脾脏变化实验
107.在模型组小鼠给药后23天，处死小鼠，进行取材。取所有小鼠的脾脏，记录其大小和重量。
108.5.4肺部血栓检测
109.所有小鼠在治疗23天之后，取肺部组织固定在福尔马林中，进行石蜡切片并he染色。
110.5.5小鼠骨髓红细胞检测
111.所有小鼠在治疗23天之后，取小鼠股骨和胫骨，冲出骨髓，制备单细胞悬液，流式抗体染色，检测红细胞表达。
112.5.6毒性检测
113.在实验过程中每周监测小鼠体重变化。所有小鼠在治疗23天后，取肾脏和肝脏记录重量变化。肝脏和肾脏固定在福尔马林溶液中，进行石蜡切片并he染色。
114.6、实验结果：
115.6.1外周血指标变化实验结果：见图8-10。
116.由图8结果可知，在给予复方黄柏液涂剂治疗9天后，与模型组相比，模型给药组小鼠外周血中红细胞数量显著降低。在治疗的第23天，模型给药组小鼠红细胞恢复到正常对照组水平。
117.由图9-10结果可知，与模型组相比，模型给药组小鼠血红蛋白含量和血容比在给药后第 9天显著降低。
118.6.2外周血涂片实验结果：见图11。
119.由图11结果可知，与模型组相比，模型给药组小鼠外周血中网织红细胞数量显著减少。
120.6.3小鼠脾脏变化实验结果：见图12。
121.由图12结果可知，与模型组相比，模型给药组小鼠脾脏大小和脾脏重量均显著减少，且恢复到正常对照组小鼠水平。
122.6.4肺部血栓检测实验结果：见图13。
123.由图13结果可知，与模型组相比，模型给药组小鼠肺部栓塞显著减少，表明给药后改善了epo
high
诱导的肺部血块聚集。
124.6.5骨髓流式检测实验结果：见图14-15。
125.由图14-15的小鼠骨髓红细胞(ter119阳性)流式分析结果可知，与模型组相比，模型给药组小鼠骨髓红细胞比例显著降低，epo
high
诱导的红细胞异常增殖分化得到明显改善。
126.6.6毒性检测实验结果：见图16-17。
127.由图16-17结果可知，与正常对照组相比，复方黄柏液涂剂腹腔给药后，小鼠体重、肾脏和肝脏未见明显变化，且小鼠肝脏和肾脏均未见病理损伤，表明复方黄柏液涂剂腹腔给药不具有毒性。
128.7、实验结论
129.小鼠外周血红细胞数量、血红蛋白含量、血容比以及脾脏变化是检测骨髓增生性肿瘤中真性红细胞增多症的常用检测指标。与正常对照组相比，模型组中红细胞数量、血红蛋白含量和血容比都显著升高，表明epo
high
诱导的真性红细胞增多症模型建立成功。
130.复方黄柏液涂剂腹腔给药治疗后，与模型组相比，模型给药组的红细胞数量、血红蛋白含量和血容比都显著减少，外周血中网织红细胞数量显著降低，脾脏肿大得到显著改善，肺部血栓也明显减少，说明复方黄柏液涂剂对epo
high
诱导的真性红细胞增多症有明显的疗效。模型给药组小鼠体重、肾脏及肝脏未见异常，进一步说明复方黄柏液涂剂用药不仅有效，而且安全。
131.实施例3：复方黄柏液涂剂对骨髓增生性肿瘤中jak2
v617f
诱导的真性红细胞增多症的治疗效果实验
132.1、实验动物
133.清洁级8周龄成年balb/c小鼠，体重19-21克，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物合格证编号：syxk(鲁)20200022。
134.2、实验分组
135.动物在适应环境1周后，称量体重而后随机分为2组，即模型组和模型给药组，每组4 只。
136.3、jak2
v617f
诱导的真性红细胞增多症模型建立
137.取小鼠骨髓，纯化造血干祖细胞(c-kit阳性)，培养箱培养10小时，用 mscv-ires-gfp-jak2
v617f
病毒转染细胞，37℃，2500rpm，90分钟。培养24小时后，移植到辐射小鼠体内。检测血项变化，21天后建立真性红细胞增多症。
138.4、给药方法
139.每天下午模型给药组用3倍浓缩的复方黄柏液涂剂按照0.3ml/20g体重的比例腹腔注射给药，连续给药49天。模型组的给药时间及途径与模型给药组一致，以pbs缓冲液替代药物。
140.5、观察指标
141.5.1小鼠脾脏和骨髓变化
142.在给药49天后，处死小鼠，取小鼠脾脏和骨髓。
143.5.2cfu-gemm和cfu-gm集落形成实验
144.在小鼠处理49天后，取小鼠骨髓，纯化lineage阴性细胞。分别培养在定向分化的培养基methocult
tm
gfm3534和methocult
tm
gfm3234+50ng/ml rmscf+10ng/ml rmil-3+10ng/mlrmil-6+3u/ml rhepo中,置于37℃，5％co2，湿度＞95％的培养基中培养7-9天观察集落形成。
145.6、实验结果
146.6.1小鼠脾脏和骨髓变化结果图：见图18。
147.由图18结果可知，与模型组相比，模型给药组小鼠的脾脏显著减小。
148.6.2克隆形成实验结果：见图19-20。
149.由图19结果显示，与模型组相比，模型给药组小鼠骨髓来源的粒细胞-红细胞-巨噬细胞
ꢀ‑
巨核细胞集落数量和大小显著减少。
150.由图20结果显示，与模型组相比，模型给药组小鼠骨髓来源的粒细胞-巨噬细胞集落数量和大小显著减少。
151.7、实验结论
152.与模型组相比，复方黄柏液涂剂腹腔注射给药后显著减轻了jak2
v617f
诱导的mpn小鼠脾脏肿大，并显著降低了jak2
v617f
诱导的mpn小鼠骨髓中干祖细胞数量和增殖能力，说明复方黄柏液涂剂对jak2
v617f
诱导的真性红细胞增多症有明显治疗效果。
153.实施例4：复方黄柏液涂剂对骨髓增生性肿瘤中mpl
w515l
诱导的原发性血小板增多症的治疗效果实验
154.1、实验动物：
155.清洁级8周龄成年雌性balb/c小鼠，体重19-21克，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供方，动物合格证编号：syxk(鲁)20200022。
156.2、实验分组：
157.动物在适应环境1周后，称量体重而后随机分为3组，即正常对照组，模型组和模型给药组，每组8只。
158.3、原发性血小板增多症模型建立：
159.提取小鼠骨髓造血干祖细胞(c-kit阳性)，培养箱培养10小时，对照组用 mscv-ires-gfp-mpl
wt
病毒转染祖细胞，37℃，2500rpm，90分钟。模型组和模型给药组用mscv-ires-gfp-mpl
w515
l转染祖细胞，37℃，2500rpm，90分钟。培养24小时后，移植到致死性辐射的小鼠体内。监测血项变化，21天后建立原发性血小板增多症模型。
160.4、给药方法
161.造模第14天开始，每天下午模型给药组用三倍浓缩的复方黄柏液涂剂按照0.3ml/20g体重的比例腹腔注射给药，连续给药35天。对照组和模型组的给药时间及途径与模型给药组一致，以pbs缓冲液替代药物。
162.5、观察指标
163.5.1外周血血项检测实验
164.所有小鼠在造模前，造模过程中及给药过程中检测小鼠外周血各指标的变化。每周对小鼠进行眼底静脉丛取血，放入edta抗凝管中，通过血项检测仪检测血液中成分进行分析。
165.5.2外周血涂片实验
166.在模型组小鼠给药35天后，小鼠眼球取血，涂片，may-gr
ü
nwald染色室温5分钟，转移至磷酸盐缓冲液中1.5分钟，wright-giemsa染色15分钟，用清水冲洗两次，晾干，封片，在显微镜下拍片记录。
167.5.3脾脏变化实验(大小、重量和病理切片染色)
168.在模型组小鼠给药后35天后，处死小鼠，进行取材。取所有小鼠的脾脏，记录其大小和重量，固定于福尔马林液中，石蜡切片，并进行he染色。
169.5.4小鼠骨髓病理切片
170.在所有小鼠处理35天后，取小鼠胸骨，固定于福尔马林中，石蜡切片，he染色和网织纤维化染色。
171.5.5小鼠肺部肝脏肾脏病理切片
172.在所有小鼠处理35天后，取小鼠肺组织，肝脏，肾脏固定于福尔马林中，石蜡切片， he染色。
173.5.6小鼠骨髓细胞流式检测
174.在所有小鼠处理35天后，处死小鼠，取小鼠股骨和胫骨冲出骨髓，制备单细胞悬液；流式抗体染色，检测细胞比例变化。
175.5.7cfu-gemm和cfu-gm集落形成实验
176.在所有小鼠处理35天后，取小鼠骨髓，纯化lineage阴性的细胞。分别培养在定向分化的培养基methocult
tm
gfm3534和methocult
tm
gfm3234+50ng/ml rmscf+10ng/mlrmil-3+10ng/ml rmil-6+3u/ml rhepo中，置于37℃，5％co2，湿度＞95％的培养基中培养 7-9天观察集落形成。
177.5.8毒性监测
178.在实验过程中每周监测小鼠体重变化。所有小鼠在治疗结束后，取肾脏、肝脏、肺记录重量变化。
179.5.9小鼠存活率统计
180.对造模成功的小鼠，随机分为两组，即模型a组和给药b组，每组各8只。给药b组每天下午腹腔注射复方黄柏液涂剂0.3ml/20g，模型a组以同样剂量的pbs缓冲液代替。记录其小鼠死亡时间，并绘制生存曲线。
181.6、实验结果：
182.6.1外周血血项检测实验结果：见图21-23。
183.由图21结果显可知，复方黄柏液涂剂给药7周后，与模型组相比，模型给药组小鼠外周血中白细胞数量显著减少。
184.由图22结果可知，复方黄柏液涂剂给药7周后，与模型组相比，模型给药组小鼠外周血中淋巴细胞、单核细胞和中心粒细胞数量显著减少。
185.由图23结果可知，复方黄柏液涂剂给药7周后，与模型组相比，模型给药组小鼠外周血中血小板减少。
186.6.2外周血涂片实验结果：见图24-25。
187.由图24结果可知，与模型组相比，复方黄柏液涂剂给药7周后，模型给药组小鼠外周血中粒细胞显著减少。
188.由图25结果可知，与模型组相比，复方黄柏液涂剂给药治疗后，模型给药组小鼠外周血中gfp阳性细胞比例显著降低。
189.6.3脾脏变化实验结果：见图26-27。
190.由图26结果可知，与模型组相比，复方黄柏液涂剂给药7周后，模型给药组小鼠的脾脏重量和大小显著减小，恢复到对照组小鼠水平。
191.由图27病理切片染色结果表明，与模型组相比，复方黄柏液涂剂给药7周后，模型给药组小鼠脾脏中白细胞浸润显著减少。
192.6.4小鼠骨髓病理切片结果：见图27-28。
193.由图27结果表明，与模型组相比，复方黄柏液涂剂给药7周后显著降低了小鼠骨髓中的粒细胞浸润。
194.由图28结果表明，与模型组相比，复方黄柏液涂剂给药7周后显著缓解了小鼠骨髓的网织纤维化水平。
195.6.5小鼠肺部肝脏肾脏病理切片结果：见图29。
196.由图29结果显示，复方黄柏液涂剂给药7周后，与模型组相比，复方黄柏液涂剂给药7 周后显著降低了粒细胞在肺组织和肝脏中浸润。
197.6.6小鼠骨髓细胞流式结果：见图30-31。
198.图30结果显示，与模型组相比，复方黄柏液涂剂给药7周后显著降低了mpn小鼠骨髓中髓细胞比例。
199.图31结果显示，与模型组相比，复方黄柏液涂剂给药7周后显著降低了mpn小鼠骨髓中巨核细胞比例。
200.综上所述，复方黄柏液涂剂给药7周后可以显著改善了mpl
w515l
诱导的mpn症状。
201.6.7克隆形成实验结果：见图32-33。
202.由图32结果显示，与模型组相比，模型给药组小鼠骨髓来源的粒细胞-红细胞-巨噬细胞
ꢀ‑
巨核细胞集落数量和大小显著减少。
203.由图33结果显示，与模型组相比，模型给药组小鼠骨髓来源的粒细胞-巨噬细胞集落数量和大小显著减少。
204.6.8毒性监测结果：见图34。
205.由图34结果可知，与对照组相比，复方黄柏液涂剂给药7周后小鼠体重、肝脏重量、肾脏重量和肺重量没有明显变化。
206.6.9小鼠生存率统计结果：见图35。
207.由图35结果可知，与模型组相比，复方黄柏液涂剂给药后延长了小鼠的平均寿命，且具有显著性差异。
208.7、实验结论
209.小鼠外周血细胞异常增生，脾脏变大，髓外造血等是骨髓增生性肿瘤的常用检测方法。本实施例结果表明，与对照组相比，模型组小鼠外周血中血小板和白细胞数量显著升高，外周血中gfp阳性细胞比例显著增加，脾脏肿大，脾脏、骨髓、肝脏和肾脏中白细胞浸润明显，表明mpl
w515l
诱导的骨髓增生性肿瘤模型建立成功。
210.在复方黄柏液涂剂腹腔给药后，可以显著改善mpl
w515l
诱导的mpn小外周血细胞异常增生，显著降低脾脏大小重量以及髓外造血。同时，复方黄柏液涂剂给药后，降低了骨髓中的各系细胞恶性增生，减少了mpl
w515l
诱导的mpn小鼠干祖细胞克隆形成能力，减轻 mpl
w515l
诱导的mpn小鼠中骨髓纤维化程度。这些结果表明复方黄柏液涂剂腹腔给药对 mpl
w515l
诱导的骨髓增生性肿瘤有很好的治疗效果，并抑制mpl
w515l
诱导的骨髓纤维化进展。毒性检测实验显示，复方黄柏液涂剂给药后未对小鼠肝脏、肾脏及肺造成病理损伤，复方黄柏液涂剂用药不仅有效，且安全。
211.综上，复方黄柏液涂剂用于mpl
w515l
诱导的骨髓增生性肿瘤的治疗疗效显著，且用药安全。