1.本发明属于药理学技术领域，涉及一种具有协同治疗人脑胶质瘤的联合用药 方式；具体地，是涉及两种抑制肿瘤细胞药物联合使用，即奋乃静与替莫唑胺联 合治疗人脑胶质瘤细胞，进而建立模型量化联合效果。


背景技术：

2.癌(cancer)是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类； 一般所说的“癌症”习惯上泛指所有恶性肿瘤；癌症具有细胞分化和增殖异常、生 长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征，其发生是一个多因子、多步骤的复 杂过程；目前，癌症治疗以手术、放疗和全身治疗为主，而全身治疗又包括化疗、 靶向治疗、激素治疗和免疫治疗，其中化疗是最常用也是最有效的策略。
3.胶质母细胞瘤(gbm)是最常见的脑实质内肿瘤，是最具侵袭性的原发性脑肿 瘤；发病率为每100000名居民中有4-5名患者；一名被诊断为胶质母细胞瘤的 患者仍然面临着不良的预后，并且在过去十年中几乎没有取得治疗进展；gbm 患者的标准护理包括手术切除、替莫唑胺(tmz)辅助化疗和放疗；然而，这些 治疗方案并不能延长gbm患者的中位生存率；近年来，在临床的研究中烷化剂 被越来越多的用于治疗人脑胶质瘤，其中，替莫唑胺(tmz)已成为化疗药物中治 疗胶质瘤效果最佳的药物之一。
4.替莫唑胺是新一代的烷化剂类抗肿瘤药，欧洲首次获批上市开始用以治疗胶 质瘤，目前依旧是临床中被选择用于治疗恶性神经胶质瘤的高频率药物，它可以 在体内自发较快地降解产生活性代谢物mtic，而mttc在生理环境中能分解产 生重氮甲烷，攻击胶质瘤细胞的dna，使dna在鸟嘌呤的6位氧原子、7位 氮原子位置发生甲基化损伤，从而起到抗胶质瘤的作用。在已有研究中已显示了 替莫唑胺还具有较强的抗血管活性和抗肿瘤增殖的能力；替莫唑胺的脂溶性较好， 因此易于透过血脑屏障到达靶部位，它还具有叠加毒性轻微、抗瘤谱较宽、可口 服且能够快速被吸收、脂溶性大易于穿过血脑屏障、生物利用度极高等特点，所 以在临床上常作为抗胶质瘤的一线化疗药被推广应用，此外，替莫唑胺对黑色素 瘤、淋巴瘤、白血病等也具有一定的治疗效果；在临床中，如果长时间的给患者 使用单一的抗肿瘤药物，会出现基因突变和干细胞靶点的缺失，可能会导致一些 重要的蛋白质表达水平产生变化从而诱导产生耐药性。
5.奋乃静(ppz)是一种典型的抗精神病药，被归类为哌嗪基吩噻嗪。吩噻嗪类 药物是一类用于治疗精神疾病的多巴胺受体拮抗剂，研究表明这类药物对cscs 具有抑制作用，能在不影响正常成体干细胞的情况下发挥抗癌作用，对肺癌干细 胞、乳腺干细胞等多种肿瘤干细胞具有抑制作用；这类药物通过抑制干细胞相关 基因epcam、cd133、oct4的表达来抑制癌细胞株huh7、lm3、sn449的细胞 迁移。在兽医学中，吩噻嗪被广泛用作镇静剂；最近有报道称，包括ppz在内 的吩噻嗪类药物对人t细胞急性淋巴细胞白血病具有抗肿瘤作用；ppz直接与 pp2a a亚单位结合，诱导erk1/2和akt去磷酸化；研究表明ppz对犬淋巴 瘤细胞系有抗肿瘤作用；ppz治疗激活pp2a和去磷酸化akt、mek1/2和erk1/2。
6.随着现代医学向着联合治疗方向的发展和药物相互作用研究的深入，包含两 种或两种以上药物活性成分的组合物与现有技术相比，如果产生了意料不到的技 术效果或者降低了毒副作用，则该组合物具有创造性；而药物之间的协同作用效 果，往往被认为是预料不到的；联合化疗药物是一种克服肿瘤内异质性导致的单 一给药耐药性的策略。


技术实现要素：

7.发明目的：本发明的目的是提供了一种具有协同治疗人脑胶质瘤的联合用药 策略；其另一目的是建立模型量化替莫唑胺与奋乃静联合使用的协同效果。
8.技术方案：本发明所述的一种具有协同治疗人脑胶质瘤的联合用药方式，即 通过奋乃静与替莫唑胺联合治疗人脑胶质瘤细胞，
9.其中，所述奋乃静的结构如式(i)所示：
[0010][0011]
所述替莫唑胺的结构如式(ii)所示：
[0012][0013][0014]
进一步的，将具有干细胞抑制作用的干细胞抑制剂与具有dna损伤作用的 化疗药物联合使用，用于抑制u87和u251胶质瘤细胞株的生长。
[0015]
进一步的，所述具有干细胞抑制作用的干细胞抑制剂是吩噻嗪类药物：奋乃 静。
[0016]
进一步的，所述具有dna损伤作用的化疗药物：替莫唑胺。
[0017]
进一步的，取对数生长期的u87和u251胶质瘤细胞株用于实验。
[0018]
进一步的，通过mtt法加入不同浓度的替莫唑胺和奋乃静及合用药物，用 于测定ic50值。
[0019]
进一步的，在所述u87胶质瘤细胞株中，使用浓度为7.289μm的tmz(替 莫唑胺)与浓度为16.256μm的ppz(奋乃静)联合给药。
[0020]
进一步的，所述u251胶质瘤细胞株中，使用浓度为9.454μm的tmz(替 莫唑胺)与浓
度为14.036μm的ppz(奋乃静)联合用药。
[0021]
其中，所谓药物协同,就是几种药物联合使用所产生的效应超过了它们各自 单独使用所应有的效应之和，即“一加一大于二”；该定义来源于药物相加作用 遵循简单的效应相加模型，即e
1,2
＝e1+e2，式中两种药物的合并效应e
1,2
等于各 组成药物单独作用(效应，e1+e2)的代数和；据此，相加作用通常根据简单的 数学公式1+1＝2进行形象的描述和解释:1+1》2时为协同，1+1＝2时为叠加， 而1+1《2时为拮抗。
[0022]
采用联合作用指数(combined index，ci)判断两种药物的协同性，ci计算方 法：ci＝da/icx，a+db/icx，b(a，b代表两种不同药物，icx，a和icx， b是两种药物单独使用使生长抑制率达x时的药物浓度，da和db是两药联合 使用使生长抑制率达x时两种药物的浓度)，0.9≤ci≤1.1为叠加作用，0.8≤ci 《0.9为低度协同作用，0.6≤ci《0.8为中度协同作用，0.4≤ci《0.6为高度协同 作用，0.2≤ci《0.4为强协同作用。
[0023]
有益效果：本发明与现有技术相比，本发明通过两种抑制肿瘤细胞药物联合 使用，即奋乃静与替莫唑胺联合治疗人脑胶质瘤细胞，建立模型量化联合效果； 另外，本发明通过讲干细胞抑制剂奋乃静和人脑胶质瘤化疗药物替莫唑胺的不同 浓度选择，联合给药抑制u87细胞和u251细胞的增殖，通过模型量化得到两种 药物联合使用后的联合指数(ci)值达到0.3299
±
0.002，具有强的协同作用，通过 集落形成实验检测的到联合用药组的细胞克隆形成率要显著低于对照组和单独 给药组，是一种新的、具有创造性的给药方式可为治疗人脑胶质瘤提供新的用药 策略。
附图说明
[0024]
图1是本发明中脑胶质瘤细胞集落形成实验示意图；
[0025]
图2是本发明中脑胶质瘤细胞集落形成实验对比图。
具体实施方式
[0026]
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本 发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0027]
本发明所述的一种具有协同治疗人脑胶质瘤的联合用药方式，即通过将奋乃 静与替莫唑胺联合使用，用于治疗人脑胶质瘤细胞；
[0028]
其中，所述奋乃静的结构如式(i)所示：
[0029][0030]
所述替莫唑胺的结构如式(ii)所示：
[0031][0032]
进一步的，将具有干细胞抑制作用的干细胞抑制剂与具有dna损伤作用的 化疗药物联合使用，用于抑制u87和u251胶质瘤细胞株的生长。
[0033]
进一步的，所述具有干细胞抑制作用的干细胞抑制剂是吩噻嗪类药物：奋乃 静。
[0034]
进一步的，所述具有dna损伤作用的化疗药物：替莫唑胺。
[0035]
进一步的，取对数生长期的u87和u251胶质瘤细胞株用于实验。
[0036]
进一步的，通过mtt法加入不同浓度的替莫唑胺和奋乃静及合用药物，用 于测定ic50值。
[0037]
进一步的，在所述u87胶质瘤细胞株中，使用浓度为7.289μm的tmz(替 莫唑胺)与浓度为16.256μm的ppz(奋乃静)联合给药。
[0038]
进一步的，所述u251胶质瘤细胞株中，使用浓度为9.454μm的tmz(替 莫唑胺)与浓度为14.036μm的ppz(奋乃静)联合用药。
[0039]
进一步的，现有技术中已公开替莫唑胺用于治疗人脑胶质瘤，但未公开替莫 唑胺与奋乃静联合使用，用于治疗人脑胶质瘤。
[0040]
进一步的，在联合使用过程中，其中组合物以药物有效量施用。
[0041]
实施例
[0042]
一、细胞培养：
[0043]
人脑胶质瘤细胞用含10％的小牛血清的dmem培养基，37℃、5％co2、 相对湿度90％的培养箱培养；细胞呈贴壁生长，待细胞长满瓶底后，弃掉培养液， 用0.25％胰蛋白酶消化，2～3天分瓶传代培养，取对数生长期细胞用于实验；
[0044]
二、mtt法检测胶质瘤细胞增殖：
[0045]
取对数生长期的肿瘤细胞用胰酶消化，配成每毫升3
×
104个的细胞悬液， 每孔100μl加入96孔板中，24h后每孔分别加100μl不同浓度的tmz或ppz 及合用药物，溶剂对照组加入对应的培养基，每个浓度设3个平行孔，37℃培 120h后弃上清，每孔加入0.5mg
·
ml-1
mtt溶液100μl，37℃培养4h后弃上 清，每孔加入120μl dmso，震荡均匀后570nm测定吸光度值(od570)；以加 入培养基的肿瘤细胞为溶剂对照组，按以下公式计算tmz和ppz对肿瘤细胞增 殖的抑制作用，并计算ic
50
；抑制率(％)＝(od溶剂对照组-od给药组)/od 溶剂对照组
×
100％；以上实验重复3次，如表1所述；
[0046]
表1不同实验组的ic
50
(μm)值
[0047][0048]
在u251细胞中，使用浓度为9.454μm的tmz与浓度为14.036μm的ppz 联合给药时测得ic
50
为(1.983
±
0.021)μm，通过计算得到ci指数为0.3509
±ꢀ
0.004；在u87细胞中，使用浓度为7.289μm的tmz与浓度为16.256μm的ppz 联合给药时测得ic
50
为(1.661
±
0.013)μm，通过计算得到ci指数为0.3299
±ꢀ
0.002；在两种人脑胶质瘤细胞中，测得ci指数均在(0.2-0.4)范围内，为强协同 作用，即联合使用奋乃静和替莫唑胺具有创造性；
[0049]
三、脑胶质瘤细胞集落形成实验：
[0050]
将对数生长期的u251和u87细胞消化后收集并稀释为1
×
104/ml的细胞悬 液在六孔板中接种，待贴壁后给药，在37℃和5％co2的条件下培养两周，当大 多数的克隆细胞数多于50个时停止，吸去培养基并加入pbs洗涤三次后加入4％ 的多聚甲醛固定20min后洗去固定液，每孔加入2ml的结晶紫溶液染色15min 后吸去并洗涤三次，在空气中干燥24h后可进行拍照并计算细胞克隆形成率；
[0051]
结果显示，联合使用tmz和ppz可以显著抑制人脑胶质瘤细胞的克隆形成 数，抑制率有明显的提升，药效具有飞跃的提升，具有创造性。
[0052]
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施 例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于 本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰， 应视为本发明的保护范围。