1.本发明属于美容多肽技术领域，提供了一种具有抗氧化和修复作用的多肽组合物及其应用。


背景技术：

2.人体皮肤暴露于多种有害物质中，其中紫外线在皮肤损伤中发挥着重要作用。紫外线引起的损伤包括直接dna损伤以及由活性氧(ros)引起的dna、蛋白质和脂质的氧化损伤。作为细胞中ros产生的主要部位，线粒体特别易受光应力的影响。由此产生的线粒体功能障碍可能对许多必需的细胞过程产生不利影响。
3.如果dna损伤得不到修复，就会发生突变。线粒体dna(mtdna)在这种情况下特别敏感，因为这种类型的dna不仅编码呼吸链的必需蛋白质，而且还紧邻呼吸链。编码呼吸链蛋白质的基因突变会导致mtros产生增加。mtros加速了mtdna损伤和突变，由此产生恶性循环。线粒体功能障碍会对细胞中的许多基本过程产生负面影响，包括减少atp的产生以及对细胞凋亡和坏死的敏感性。因此，mtros的增加被认为是细胞和生物体老化的主要原因。
4.为了打破ros和dna损伤的恶性循环，身体会尝试用天然物质如辅酶q10等来抵消ros。辅酶q10(coq10)长期以来被认为是一种有助于人们保持年轻的有效成分。这种脂溶性成分，天然存在于体内并位于线粒体中细胞膜，对能量产生和作用至关重要，作为一种强大的抗氧化剂来对抗过早衰老。在皮肤细胞中，辅酶q10可以抵御紫外线引起的损伤和氧化应激。daniel等
1.发现uv照射后，被coq10处理过的皮肤成纤维细胞里的线粒体膜电位保持，线粒体功能障碍减少，细胞atp水平加速再生。coq10还可以减少人角质形成细胞中uva照射引发的ros产生和dna损伤。此外，coq10被证明可以减少培养的人真皮成纤维细胞中uva诱导的mmp
2.。
5.随着年龄的增长，辅酶q10的水平会降低，阻碍细胞的抗氧化防御和产生能量的能力。一般化妆品应对这种问题采取措施是直接外用辅酶q10，但研究表明，外供给辅酶q10可能主要增加皮脂中辅酶q10的水平，无法恢复表皮中辅酶q10水平。
6.另一方面，uv引起蛋白质和脂质过氧化损伤，脂质过氧化产生各种自由基，从而夺取蛋白质的氢生成蛋白质自由基，使蛋白质聚合和交联。脂质过氧化的羰基化合物(醛、酮)与蛋白质的氨基和巯基反应，使蛋白质分子发生交联。脂质过氧化会破坏生物膜的正常结构。生物膜是由脂质和蛋白组成的流动镶嵌结构，为完成某种功能，膜蛋白可以在膜上运动，脂质过氧化引起的膜蛋白的交联限制了蛋白质的运动，严重损害生物膜的功能。皮肤中的不饱和脂质不稳定，比较容易氧化，双键的数量、构型和相对位置是关系到氧化深度的三个重要因素。之前一直认为双键被直接氧化，现在更多的实验证明，主要是双键相邻的α-亚甲基发生氧化脱氢，由于α-亚甲基脱去氢形成自由基与双键形成p-π共轭，所以更易氧化。像亚油酸、亚麻油酸这种隔离双键的成分，由于双键中间的α-亚甲基受两边双键活化，脱去氢更容易，所以含有亚油酸、亚麻油酸的油脂要比其他油脂更容易被氧化。而亚油酸作为人体必需脂肪酸，是人体皮肤角质层相互紧密连接的关键成分。另外各种生物膜都是磷脂双
分子层，含有大量的不饱和脂肪酸，来保证生物膜的流动性。所以脂质过氧化将带来严重的后果。脂质过氧化直接影响人的衰老和寿命。在外观上来看，脂质过氧化导致皮肤出现皱纹、黯淡无光等衰老迹象。
7.本发明从上述衰老的机理出发，采用促进辅酶q10的内源性合成的多肽和抑制脂质过氧化损伤的多肽组合，提供一种预防或对抗与氧化过程相关的病理症状的多肽组合物。


技术实现要素：

8.本发明人通过大量实验研究，出乎意料地发现，包含具有特定多肽的组合物，有助于皮肤促进coq10的内源性合成，抑制包括非金属离子引起的脂质氧化作用，促进胶原蛋白生成，保护皮肤免受氧化损伤，修复老化皮肤，同时具备优异的使用安全性，从而开启新的治疗和美容前景。
9.因此，本发明的目的在于提供一种具有抗氧化和修复作用的多肽组合物。所述组合物通过不同多肽以特定比例复配得到，能够发挥协同作用，可用于抗氧化，治疗、预防或修复皮肤老化或光老化的迹象。
10.本发明所述一种具有抗氧化和修复作用的多肽组合物，包含：
11.(1)促进辅酶q10的内源性合成、提高皮肤能量的多肽，选自：五肽-34三氟乙酸盐；
12.(2)抑制脂质过氧化损伤的多肽，选自：肌肽、脱羧肌肽或乙酰肌肽；
13.所述多肽组合物中，促进辅酶q10的内源性合成、提高皮肤能量的多肽与抑制脂质过氧化损伤的多肽的浓度比为1:4。
14.五肽-34三氟乙酸盐通过上调pdss1(二磷酸丙酯合酶亚基1)，促进辅酶q10(coq10)的内源性合成
3.，提高皮肤中辅酶q10的含量，能够减少紫外引起的氧化应激损伤，提高atp合成水平，振兴皮肤，抵抗衰老。
15.肌肽(β-alanyl-l-histidine)、脱羧肌肽(β-alanyl histamine)、n-乙酰肌肽(n-acetyl-β-alanylhistidine)是在人体组织中具有多种生物学和药理学伴侣特性的重要成分。它们含有的咪唑基团具有极强的络合金属离子的能力，这样就可以避免游离的金属离子催化形成自由基，进而导致脂质过氧化。同时咪唑基团的共轭结构，电子云密度较大，n上含有的孤对电子，使其既容易得到质子也易失去质子，有实验证明咪唑基提供质子和接受质子的速度十分快，且供出质子和接受质子的速度几乎相等。能迅速捕捉羟基自由基、单线态氧、过氧自由基等。因此，肌肽、脱羧肌肽或乙酰肌肽具有极强的抗氧化能力。
16.本发明所述的具有抗氧化和修复作用的多肽组合物，其制剂选自：精华液、粉剂、片剂、胶囊、乳剂、软膏、霜剂或凝胶。
17.本发明的另一方面，提供一种具有抗氧化和修复作用的多肽组合物在制备抗氧化的美容组合物或药物组合物中的用途。
18.本发明的另一方面，提供一种具有抗氧化和修复作用的多肽组合物在制备用于治疗、预防或修复皮肤老化或光老化的美容组合物或药物组合物中的用途。
19.皮肤老化或光老化的治疗、预防或修复是促进胶原蛋白生成，减少、预防或治疗面部皱纹。
20.本发明相对于现有技术所取得的有益效果包括：
21.1、针对不同的衰老机理，本发明采用促进辅酶q10的内源性合成、提高皮肤能量的多肽和抑制脂质过氧化损伤的多肽，两者按照1:4进行复配，通过不同靶点的多肽组合发挥协同作用，有效抗氧化，可用于减少蛋白质和脂质氧化损伤；显著促进胶原蛋白生成，可用于改善肤质、减缓皮肤老化、修复老化皮肤。
22.2、五肽-34三氟乙酸盐在低剂量下便表现出明显的细胞毒性，现有技术在使用该多肽进行组合应用时，往往忽略了这一点。本发明从安全性角度出发，使用安全剂量的五肽-34三氟乙酸盐进行复配，所得组合物在发挥抗氧化和修复功效的同时，具有优异的安全性。
附图说明
23.图1为测试样品对hacat细胞活性影响结果图。
24.图2为各样品在不同浓度下对dpph自由基清除结果(n＝4)。
25.图3为天狼星红染色细胞显微图像。
具体实施方式
26.为了更好地理解本发明，下面结合实施例对发明作详细的说明，然而，应当理解的是，这些实施例仅用作说明目的，并且不旨在限制本发明的范围。
27.本发明实施例的组合物中各多肽的复配比例如下：
28.原料名称组合物1组合物2组合物3五肽-34三氟乙酸盐(下称肽a)12.54脱羧肌肽(下称肽b)42.51
29.注：在组合物为100ppm时，如肽a：肽b＝1：4，表示肽a为20ppm，肽b为80ppm。
30.实施例1细胞活性实验
31.1.1试剂与材料
32.噻唑蓝(mtt)(sigma)、二甲基亚砜(dmso)(sigma)、高糖培养基(dmem)(gibco)、胎牛血清(gibco)。
33.1.2仪器
34.酶标仪(美国md)、co2培养箱(上海一恒)、超净工作台(苏州净化)。
35.1.3细胞株
36.人角质形成细胞(hacat)购买自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。
37.1.4待测样品
38.给药组：
39.肽a，测试浓度分别为12.5ppm、25ppm、50ppm、100ppm；
40.肽b，测试浓度分别为12.5ppm、25ppm、50ppm、100ppm；
41.组合物1，测试浓度分别为12.5ppm、25ppm、50ppm、100ppm；
42.组合物2，测试浓度分别为12.5ppm、25ppm、50ppm、100ppm；
43.组合物3，测试浓度分别为12.5ppm、25ppm、50ppm、100ppm；
44.给药组采用0.5％dmso溶液溶解。
45.control组：0.5％dmso。
46.阳性对照组：2％dmso。
47.1.5实验方法
48.取冻存的hacat细胞培养，按照1：2传代至5代左右，选择长势较好的细胞作为实验对象。将细胞2000个/孔接种在96孔板中，待细胞贴壁后，按照倍比稀释法，分别加入给药组、control组和阳性对照组样品，补充培养基至200μl，置于37℃、5％co2培养箱中孵育72h。
49.之后每孔加入22μl 5mg/ml mtt，继续于37℃、5％co2培养箱中孵育4h。弃去原溶液，加入150μl/孔的dmso。5min后使用酶标仪读取490nm和630nm波长下的参比od值。
50.1.6结果
51.mtt法是一种检测细胞存活和生长的方法，以control组为参照比值，各样品由高到低设定4个给药浓度，在hacat细胞上开展细胞活性检测实验，测得的od值与细胞活性成正比。
52.图1为测试样品对hacat细胞活性影响结果图。结果显示，与control组相比，肽a浓度在50ppm以上时表现出明显的细胞毒性，肽b浓度在100ppm范围之内对细胞没有毒性。将肽a与肽b按照不同的复配比例分别得到组合物1(肽a：肽b＝1:4)、组合物2(肽a：肽b＝2.5:2.5)、组合物3(肽a：肽b＝4:1)。组合物1对hacat细胞没有毒性，并且在100ppm高浓度时能够显著地促进细胞增殖；而组合物2在100ppm时对hacat细胞产生了毒性，细胞活性显著降低；组合物3在50ppm、100ppm浓度下均具有细胞毒性。
53.由上可知，肽a与肽b通过不同比例组合之后，在两者的比例为1:4时，在100ppm范围内对hacat细胞的增殖促进作用呈剂量依赖性，可以规避肽a(五肽-34三氟乙酸盐)的细胞毒性，从而可以在满足安全性的情况下，通过提高组合物1的使用浓度而达到更优的技术效果。
54.实施例2抗氧化实验
55.2.1待测样品
[0056][0057]
肽a；肽b；组合物1。
[0058]
称取待测样品，用95％甲醇溶解至浓度为l mg/ml，再进行倍比稀释，稀释的体积为100μl，使得最终测试浓度分别为1ppm、10ppm、50ppm、100ppm、200ppm。
[0059]
2.2配制dpph体系
[0060]
称取12.5mg的dpph，用95％甲醇溶解移至50ml棕色容量瓶，定容，250μg/ml，避光保存。
[0061]
用95％甲醇稀释dpph至200μg/ml，稀释比例为(dpph:95％甲醇＝4:1)。
[0062]
2.3测量吸光值
[0063]
取100μl待测样品甲醇溶解液与100μl 200μg/ml的dpph标准混合液，避光反应90min，于490nm处测定吸光值abs
sampl
。以100μl甲醇与100μl 200μg/ml的dpph标准液作为对照品，于490nm处测定吸光值abs
control
。以100μl受试物与100μl甲醇作为空白对照，于490nm处测定吸光值abs
blank
。
[0064]
各样品的dpph清除能力按以下公式计算：
[0065]
清除率aravalue(％)＝(abs
control-abs
sampl
)/(abs
control-abs
blank
)*100％
[0066]
2.4测试结果
[0067]
dpph是一种自由基，溶液为蓝色，当dpph被还原时，则会变成黄色，因此可根据此来定量和定性分析测试样品的抗氧化性能，测试结果见下表1及图2。
[0068]
表1各样品在不同浓度下对dpph自由基清除结果(n＝4)
[0069]
结果显示，在10-200ppm范围内，在同一浓度下，组合物1具有比单一肽a、肽b更强的dpph自由基清除能力，且呈剂量依赖性。由此可知，采用肽a与肽b按照1:4的比例复配，可以发挥协同增效作用，组合物1具有更优的抗氧化作用。
[0070]
实施例3促细胞胶原蛋白生成实验
[0071]
3.1试剂与材料
[0072]
胎牛血清、dmem培养基、青霉素、链霉素、天狼星红染色试剂盒。
[0073]
3.2仪器
[0074]
荧光显微镜、co2培养箱。
[0075]
3.3细胞株
[0076]
hsf人皮肤成纤维细胞。
[0077]
3.4待测样品
[0078]
给药组：
[0079]
肽a，测试浓度分别为25ppm、50ppm；
[0080]
肽b，测试浓度分别为25ppm、50ppm；
[0081]
组合物1，测试浓度分别为25ppm、50ppm；
[0082]
给药组采用0.5％dmso溶液溶解。
[0083]
control组：0.5％dmso。
[0084]
3.5实验方法
[0085]
取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数1～4
×
105个/ml，制成细胞悬液。适当稀释取10000个/孔细胞悬液接种于96孔板上，待细胞长满至80％左右时，建立uv光老化模型。control组不进行uv照射；uv组和给药组加入适量pbs反复洗至无色后加入50μlpbs，以80j/cm
3 uv灯下照射，灯源和培养瓶间距15cm。经照射后，弃去pbs，uv组不加药，给药组加入培养液和倍比稀释药物至200μl。control组、uv组、给药组继续于37℃、5％co2培养箱中孵育24h。
[0086]
天狼星红染色：孵育后的细胞使用4％多聚甲醛固定15min后，pbs洗涤。使用天狼星红染色试剂盒按照操作说明分布加入染色a液和b液，pbs洗去浮色后，置于显微镜下观测。
[0087]
3.6结果
[0088]
天狼星红可以对细胞或组织的胶原蛋白进行染色，胶原蛋白可被染成红色，由于
皮肤成纤维细胞富含胶原蛋白，可对其进行胶原蛋白定性以及细胞形态分析。
[0089]
天狼星红染色细胞显微图像见图3。结果显示，control组细胞呈现明显的纤维状，排列规则，密集(如图3中深色部分所示)；uv辐射后，细胞密度大为降低。25ppm的肽a及肽b均可以在一定程度上改善经uv辐射后导致的细胞密度变稀的现象。25ppm的组合物1能够明显提高单位面积的细胞数量，促进细胞生成更多的胶原蛋白。50ppm的肽a没有表现出改善作用，甚至比uv组的细胞密度还要低。50ppm的肽b可以增加单位胶原蛋白含量，50ppm的组合物1更是显著提高了细胞密度，具有更强的促进细胞生成胶原蛋白的能力。
[0090]
综上所述，采用肽a与肽b按照1:4的比例复配，通过两者发挥协同增效作用，组合物1具有比单一肽a、单一肽b更优的抗光老化能力，能够明显促进胶原蛋白生成，有效改善肤质、减缓皮肤老化、修复老化皮肤。
[0091]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细的说明，但是不表示本发明的具体实施是局限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或是替换，都应视为属于本发明的保护范围。
[0092]
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494.
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[0095]
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