专利名称：一种半抗原化合物，合成方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及选择一种四面体结构的膦酸酯作为半抗原以及合成该化合物的方法和用途。
八十年代化学和免疫学领域中的一项重大发现-催化抗体(抗体酶)(Tramontano A.，Janda K.D.，Lerner R.A.Catalytic Antibodies.Science，1986，2341566-1570；Pollack S.J.，Jacobs J.W.，Schultz P.G.SelectiveChemical Catalysis by an Antibody.Science，1986，2341570-1573)，把抗体的极其多样性与酶的巨大的催化能力等特性结合在一起，为传统的化学和免疫学研究开辟了一个崭新的方向，利用经过特殊设计并合成的有机分子作为半抗原，联接载体蛋白后免疫动物并经细胞杂交技术，从筛选和分离的单克隆抗体中，成功地获得具有催化功能的抗体。至今已有五十多个反应能用催化抗体来催化(Schultz P.G.，Lerner R.A.，Benkovic S.J.Catalytic Antibodies.Chem.Eng.News.1990，May 28，P20-40；Ikeda S.，Janda K.D.Catalytic Antibody(触媒抗体)の最近の进步と应用いついて。有机合成化学协会志，1993，51284-297)，对某些反应(如Diels-Alder反应)，自然界不存在能催化它们的酶，也能用抗体来催化(Hilvert D.et al.Antibody Catalysis of a Diels-Alder Reaction.J.Am.Chem.Soc.1989，1119261-9262；Braisted A.C.，Schultz P.G.An Anti-body-Catalyzed Bimolecular Diels-Alder Reaction.J.Am.Chem.Soc.1990，1127430-7431)。因此，设计具有特异性的半抗原和催化抗体，在化学，生物学，医学等领域无疑将显示巨大的应用潜力。
本发明的目的是提供一种半抗原化合物。
本发明的目的还提供这种半抗原化合物的合成方法。
本发明的另一个目的是提供这种半抗原化合物的用途。
本发明提供的半抗原化合物是具有四面体结构的膦酸酯，具有如下的分子式 本发明的半抗原从6-甲氧基-β-萘乙酮(2)为原料，经过氧化、还原、卤代、Arbuzov重排反应生成膦酸酯、再经甲基化，甲醚水解得膦酸酯以及膦酸酯部分水解得半抗原1-(6-羟基-β-萘基)-乙基膦酸单甲酯或单乙酯(1)。 A氧化B还原C卤代DArbuzov重排E甲基化F甲醚水解G膦酸酯部分水解本发明的七步合成半抗原化合物(1)的方法进一步描述如下将6-甲氧基-β-萘乙酮(2)在极性溶剂和氧化剂存在下，加热反应5-20小时生成6-甲氧基萘甲酸(3)。所述的化合物(2)与氧化剂的克分子比为1∶1-10，反应温度50-120℃，反应温度可随不同的溶剂而有所变化，推荐采用次氯酸钠为氧化剂，在碱性条件下完成氧化反应。反应结束后可用还原剂除去过量的氧化剂，经溶剂萃取分离和浓缩以纯化产物。
在0℃至室温下，在溶剂中，化合物(3)与还原剂反应10-30小时，产生6-甲氧基-β-羟甲萘(4)，化合物(3)与还原剂的克分子比为1∶1-5。推荐采用氢化锂铝还原剂。反应后可用无机酸中和，有机极性溶剂萃取，浓缩纯化。化合物(4)也可用丙酮-石油醚结晶得针状晶体。
化合物(4)可用三溴化磷，在极性溶剂中和0至-50℃时反应1-10分钟，产生6-甲氧基-β-溴甲基萘(5)。化合物(4)与三溴化磷的克分子比为1∶0.8-5。反应物可经过滤，溶剂洗涤和浓缩，获白色固体化合物。
化合物(5)与分子式为P(OR)3的亚磷酸三甲酯或三乙酯在加热至50-90℃下反应0.5-2小时，发生Arbuzov重排生成1-(6-甲氧基-β-萘基)-甲基膦酸二甲酯或二乙酯(6)。化合物(5)与P(OR)3的克分子比为1∶1-10，其中R＝Me或Et，产物可用柱层析分离纯化。
化合物(6)在极性溶剂和室温至-80℃时，先与丁基锂反应0.5-10小时，继之与碘甲烷反应0.5-2小时，生成1-(6-甲氧基-β-萘基)-乙基膦酸二甲酯或二乙酯(7)，产物可用溶剂萃取，柱层析分离纯化。
化合物(7)在极性溶剂中与三溴化硼在-80℃至室温下反应0.5-2小时生成1-(6-羟基-β-萘基)-乙基膦酸二甲酯或二乙酯(8)，化合物(7)和三溴化硼的克分子比为1∶1-100。该反应可用饱和盐水萃灭反应。产物可用溶剂萃取，浓缩或用柱层析分离纯化。
化合物(8)在极性溶剂中与过量无机碱同流10-20小时，生成1-(6-羟基-β-萘基)-乙基膦酸单甲酯或单乙酯(1)。推荐采用氢氧化钠作为无机碱。产物可用无机酸或元机酸水溶液中和，再通过酸化后的阳离子交换树脂柱或硅胶柱分离；极性溶剂洗脱纯化。
本发明中所述的极性溶剂可以是甲醇，乙醇等低碳链醇、乙醚、醋酸、乙酸乙酯、氯或多氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、二氧六环和吡啶等。
本发明的半抗原化合物(1)可作为原料，用于制备适于动物免疫用的抗原体系，如用丁二酸酐或戊二酸酐作为桥梁，一个羧基与化合物(1)的6-羟基联接成酯，另一个羧基与载体蛋白上的氨基联接，得到适于动物免疫的抗原体系。
本发明的半抗原化合物，不仅合成方法简便，纯度较高，而且能应用于合成适于动物免疫的抗原体系。
通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容。实施例16-甲氧基萘甲酸的合成(化合物3)在18g NaClO的水溶液(25mmol，含Cl量为5％)中加入6.5mmolNaOH，1mL H2O，2.5mL二氧六环。搅拌下升温至55℃，加入5mmol原料6-甲氧基-β-萘乙酮(2)，再升温至80-90℃，搅拌反应12小时。冷却至室温后加入NaHSO4(1.8g，15mmo1)及10mL水，即有白色片状固体生成。以乙醚萃取四次，合并萃取液干燥浓缩回收原料。将水相用浓盐酸酸化至pH～5，有大量白色沉淀析出。然后以乙酸乙酯萃取四次，合并萃取液用无水硫酸钠干燥，浓缩得产物537mg，得率53％。用丙酮-石油醚重结晶得针状品体。
化合物(3)的1H NMR数据8.68(s，1H)，8.11(m，J＝8.71Hz，3H)，7.51(d，J＝2.56Hz，1H)，7.36(dd，J＝9.0Hz，1H)，4.08(s，3H)，3.57(m，1H).实施例26-甲氧基-β-羟甲萘的合成(化合物4)将6g化合物(3)溶于100mL THF中，在0℃下，缓缓加入含有3g氢化锂铝的THF溶液，然后室温下搅拌24小时，冷却下加入10％盐酸中和至pH～5，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析纯化得产物4.62g，产率为83％。以丙酮石油醚重结晶得针状晶体。
化合物(4)的1H NMR如下7.73(m，3H)，7.43(dd，1H)，7.25(s，1H)，7.12(s，1H)，4.82(s，2H)，3.92(s，3H)，1.67(s，1H).实施例36-甲氧基-β-溴甲基萘(化合物5)和1-(6-甲氧基-β-萘基)-甲基膦酸二甲酯或二乙酯的合成(化合物6)化合物(4)(710mg，38mmo1)溶于40mL无水乙醚中，冷却到-30至-40℃，在氮气氛下搅拌并滴加PBr3(1g，3.8mmol)的乙醚溶液，加完后5分钟反应即告完全，在反应液中加入潮湿的碳酸氢钠。然后用无水硫酸钠干燥，过滤，残渣用无水乙醚洗，合并乙醚相并浓缩得白色固体即为化合物(5)。
将上述产物与1mL P(OMe)3或P(OEt)3在氮气氛中于80-90℃下搅拌1小时，反应混合物直接通过柱层析纯化得无色液体即化合物(6)，产率56-60％。
化合物(6)(R＝Et)的1H NMR数据7.68(m，3H)，7.41(m，1H)，7.14(m，2H)，4.0(q，J＝7.1Hz，4H)，3.9(s，3H)，3.33(s，1H)，3.22(s，1H)，1.23(t，J＝7.1Hz，6H).实施例41-(6-甲氧基-β-萘基)-乙基膦酸二甲酯或二乙酯的合成(化合物7)将10.6mmol的化合物(6)在氮气氛下溶于50mL无水四氢呋喃(THF)，冷却至-70℃以下后慢慢滴加n-BuLi(2.0N，6.9mL)。搅拌半小时后逐渐升温至20℃，继续搅拌4小时，再降温至-70℃以下，滴加MeI(0.84mL，1.9g，13.7mmo1)，然后逐渐升温至20℃，以乙醚萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析分离得油状产物(7)，产率80％。
化合物(7)R＝Et时的1H NMR为7.70(m，3H，ArH)，7.45(d，J＝8.5Hz，1H，ArH)，7.12(d，J＝8.5Hz，2H，ArH)，4.06(q，J＝7.0Hz，4H，-(OCH2CH3)2)，3.89(s，3H，OCH3)，3.33(dd，J＝7.3，18.3Hz，1H，ArCH2CH3)，1.65(dd，J＝7.3，18.3Hz，3H，ArCH2CH3)，1.30(tJ＝7.0，6H，-(OCH2CH3)2).实施例51-(6-羟基-β-萘基)-乙基膦酸二甲酯或二乙酯的合成(化合物8)将化合物(7)(500mg，1.56mmok)溶于无水CH2Cl2中，氮气保护下冷却至-78℃，加入BBr3(1mL)，然后在室温下反应1小时，再在干冰冷却下加入冰水混合物，继续在室温下搅拌半小时，加饱和盐水萃灭反应，乙酸乙酯萃取四次，无水硫酸镁干澡后浓缩或/和柱层析分离得淡黄色固体，产率为93～95％。
化合物(8)R＝Et的1H NMR如下7.60(s，1H，ArH)，7.25(m，3H，ArH)，6.86(d，J＝8.0Hz，2H，ArH)，4.05(q，J＝7.0Hz，2H，-OCH2CH3)，3.94(q，J＝7.2Hz，3H，-OCH2CH3)，3.32(dd，J＝6.8，18.4Hz，1H，ArCHCH3)，1.66(dd，J＝6.8，18.4Hz，3H，ArCHCH3)，1.30(t，J＝7.0Hz，3H，-OCH2CH3)，1.16(t，J＝7.2Hz，3H，-OCH2CH3).实施例61-(6-羟基-β-萘基)-乙基膦酸单甲酯或单乙酯的合成(化合物1)化合物(8)(400mg)溶于无水乙醇(8mL)中，再加人NaOH(600mg)，然后回流16小时，薄层层析检测反应已完全。然后以10％HCl中和反应至pH＝8～9，将反应液通过酸化后的阳离子交换树脂柱层析，以乙醇洗脱，将洗脱液浓缩或/和硅胶柱层析分离，用乙醇-醋酸乙酯(1∶2)洗脱，浓缩得白色固体化合物(1)，产率88～90％。
化合物(1)R＝Et的1H NMR数据7.60(s，1H，ArH)，7.20(m，3H，ArH)，6.89(m，2H，ArH)，3.56(q，J＝17Hz，2H，-OCH2CH3)，1.66(dd，J＝6.8，18.0Hz，ArCHCH3)，1.08(t，3H，J＝1.7Hz，-OCH2CH3).实施例7免疫原的制备(化合物9)化合物(1)(227mg，0.8mmol)溶于2mL吡啶中，加人丁二酸酐或戊二酸酐(1.4mmol)和DMAP(100mg，0.8mmol)。在室温下搅拌过夜，薄层层析检测反应完全。硅胶柱层析分离，先用石油醚洗去吡啶，然后用乙酸乙酯淋洗，之后再用乙酸乙酯无水乙醇(1∶2)的混合溶剂淋洗，浓缩得白色产物160-170mg。
当R＝Et，采用丁二酸酐时，产物(9)的1H NMR7.86(s，1H，ArH)，7.83(d，J＝8.7Hz，1H，ArH)，7.73(d，J＝8.5Hz，1H，ArH)，7.64(d，J＝8.5Hz，1H，ArH)，7.25(d，J＝2.16Hz，1H，ArH)，7.21(dd，J＝8.7，2.16Hz，1H，ArH)，6.85(d，J＝7.4Hz，1H，OH)，4.02(q，J＝1.5Hz，2H，POCH2CH3)，3.62(q，J＝7.3Hz，2H，ArOCOCH2CH2COOH)，3.37(m，1H，ArCHCH3)，3.25(q，J＝7.3Hz，2H，ArOCOCH2CH2COOH)，1.77(dd，J＝7.2，16.6Hz，3H，ArCHCH3)，1.44(t，J＝1.5Hz，3H，POCH2CH3).MS381(M＋1)，335,319,303,280,265,171,102.实施例8动物免疫和多克隆抗体的制备用半抗原-载体蛋白体系免疫小鼠、兔、大鼠和豚鼠，半抗原-KLH体系优于半抗原-BSA体系，兔的免疫效果最好，一个月后取血，分离出抗全血清，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中抗半抗原的抗体滴度(O.D450值)，当血清稀释6400倍时，其抗体滴度仍为空白对照组的3.4倍。
兔血清经硫酸铵沉淀初步纯化，毛细管电泳显示非常复杂，进一步用离子交换层析(DE-52)分离除去其它血清蛋白后，得到免疫球蛋白(IgG)，毛细管电泳显示均一，此免疫球蛋白(多克隆抗体)能催化萘普生乙酯水解生成萘普生。
权利要求
1一种膦酸酯的半抗原化合物，其特征是具有如下分子式
2一种如权利要求1所述的半抗原化合物的合成方法，其特征是用下述步骤制得(1)6-甲氧基-β-萘乙酮(2)在极性溶剂和氧化剂存在下加热反应5-20小时生成6-甲氧基-β-萘乙酸(3)，化合物(2)与氧化剂的克分子比为1∶1-10，反应温度50-120℃，所述的氧化剂是NaClO，(2)化合物(3)与还原剂氢化锂铝在0℃至室温下反应10-30小时，生成6-甲氧基-β-羟甲萘(4)，化合物(3)与氢化锂铝的克分子比为1∶1-5，(3)在乙醚溶剂中，化合物(4)与PBr3的克分子比为1∶0.8-5，在0-50℃反应1-10分钟生成6-甲氧基-β-溴甲基萘(5)，(4)化合物(5)与P(OR)3在50-90℃下反应0.5-2小时，二者克分子比为1∶1-10，生成1-(6-甲氧基-β-萘基)-甲基膦酸二甲酯或二乙酯(化合物6)，其中R＝Me或Et，(5)化合物(6)在极性溶剂中，在室温至-80℃下，与丁基锂反应0.5-10小时，然后与碘甲烷反应0.1-2小时，生成1-(6-甲氧基-β-萘基)-乙基膦酸二甲酯或二乙酯(化合物7)，化合物(6)、丁基锂和碘甲烷的克分子比为1∶1-10∶1-10，(6)在极性溶剂中，化合物(7)与BBr3在-80℃至室温下反应0.5-2小时，得1-(6-羟基-β-萘基)-乙基膦酸二甲酯或二乙酯(化合物8)，其中R＝Me或Et。化合物(7)与BBr3的克分子比为1∶1.1-100，(7)化合物(8)在极性溶剂中与无机碱回流10-20小时，得1-(6-羟基-β-萘基)-乙基膦酸单甲酯或单乙酯(化合物1)，其中R＝Me或Et。
3一种如权利要求2所述的半抗原化合物的合成方法，其特征是在碱性条件下化合物(2)与氧化剂反应后，用还原剂除去过量的氧化剂，溶剂萃取和浓缩。
4一种如权利要求2所述的半抗原化合物的合成方法，其特征是所述的化合物(3)与还原剂反应后，用无机酸中和，溶剂萃取、浓缩。
5一种如权利要求2所述的半抗原化合物的合成方法，其特征是化合物(4)用丙酮-石油醚重结晶。
6一种如权利要求2所述的半抗原化合物的合成方法，其特征是化合物(6)、(7)、(8)或(9)用柱层析分离纯化。
7一种如权利要求2所述的半抗原化合物的合成方法，其特征是所述的极性溶剂是低碳链醇、乙醚、醋酸、乙酸乙酯、氯或多氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、二氧六环或吡啶。
8一种如权利要求1所述的半抗原化合物用途，其特征是动物免疫的抗原体系的原料。
全文摘要
本发明是关于一种作为半抗原的具有四面体结构的膦酸酯化合物1-(6-羟基-β-萘基)-乙基膦酸单甲酯或单乙酯，系由6-甲氧基-β-萘乙酮经氧化、还原、卤代、Arbuzov重排生成膦酸酯，甲基化、甲醚水解和膦酸二酯部分水解而成。合成方法简便、产物纯度高，且可用于制备供动物免疫的免疫原。
文档编号C07F9/38GK1119180SQ9511163
公开日1996年3月27日 申请日期1995年5月9日 优先权日1995年5月9日
发明者吴毓林, 赵河, 胡允金, 杨炳辉 申请人:中国科学院上海有机化学研究所