1.本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种人类线粒体全基因组短片段叠瓦式扩增检测试剂盒。


背景技术：

2.20世纪中叶，研究人员首次分离并鉴定出细胞核外的线粒体基因组(mitochondrial genome，mtgenome)。人类线粒体基因组序列于1981年首次公布，并于2001年修正，称作修正版剑桥参考序列(revised cambridge reference sequence，rcrs)，它是一个长度为16569bp的环状遗传物质，按照功能可分长度为1122bp的控制区(control region，cr)和长度为15447bp的编码区(coding region，codr)，其中在控制区内包含3个高变区(hypervariable segments，hvs)，具有良好多态性。线粒体dna在人类起源进化研究和法医身份识别领域具有重要作用。一方面，由于线粒体dna的特征是母系遗传并且不发生重组，其单倍型可以稳定地遗传给后代，故可利用其遗传特征进行人类起源进化研究，如推断起源时间和地点、迁徙过程等；另一方面，线粒体dna与核dna相比，具有拷贝数高、环状结构稳定、双层膜保护等特点，使其在恶劣条件下(如高温、潮湿等)仍能得以最大限度的保存，故应用于法医身份识别中具有其独特优势，尤其是针对疑难陈旧检材(如古代残骸、白骨化尸体等)和高度降解检材(如火灾、爆炸、空难、海难、恐怖袭击等大规模灾难现场的尸体或部分人体组织)的鉴定。
3.起初，法医遗传学家在第一代测序(桑格尔测序，sanger sequencing)技术基础上建立了线粒体基因组的检测系统。首先，通过对线粒体dna进行pcr长片段扩增，片段间部分重叠，使之覆盖整个基因组。接着，在每个长片段内再进行短片段测序，片段间部分重叠，使之覆盖对应长片段。最终，在测序仪上电泳分离，检测荧光信号进行定序。然而，应用sanger测序检测线粒体基因组并未被很好地推广，原因如下(1)对检材要求高：需要数量较多质量较好的检材，以保证扩增出符合测序要求的长片段产物，不适合疑难陈旧检材和高度降解检材的分析；(2)成本较高，通量较低：sanger测序最佳的读长约为600bp，每个测序反应只能检测单个短片段，覆盖线粒体基因组至少需要同时进行60个反应，以最大通量为96个反应的abi 3730xl测序仪为例，一次仅能检测1
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2个样品；(3)数据分析复杂：为了得到线粒体基因组信息，需人工对各短片段序列进行拼接，对多个样品进行同时分析时，常出现人为原因导致拼接错误；(4)特殊区域测序效果不佳，导致基因组遗传信息流失：如同聚物(homopolymers)，插入/缺失(indels)，异质性(heterozygosity)等，难以进行判读，通常对该部分区域分型进行忽略处理。总体上来说，sanger测序线粒体基因组检测系统的整体流程是比较费时费力昂贵的，因此限制了它在法医身份识别领域的应用。
4.2005年，454生命科学公司发表在《自然》杂志上的学术论文标志着第二代测序(next generation sequencing，ngs)技术——高通量测序(massively parallel sequencing,mps)技术革命的开端，是对第一代测序技术颠覆性地改变。随着mps技术的发展和成熟，线粒体基因组测序越来越多地应用于法医遗传学领域。新兴技术从科学研究到
9947a线粒体sanger测序结果一致性比较图(a：高通量测序；b：sanger测序)。
具体实施方式
24.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
25.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
26.一种基于高通量测序技术的人类线粒体全基因组短片段叠瓦式扩增检测试剂盒，步骤如下：
27.1、引物组合物：本发明提供引物组1、2合物用于扩增线粒体基因组，一方面要根据中国人群多态性特征，设计相应的兼并引物(如30af-30ar和30bf和30br)，保证引物结合的成功率；另一方面需扩增片段间部分重叠，保证覆盖整个线粒体基因组(图1所示)。该引物组1合物的序列seq id no：1-seq id no：65如表1所示。该引物组2合物的序列seq id no：66-seq id no：130如表2所示。
28.表1：引物组1合物
29.30.[0031][0032]
*兼并引物
[0033]
表2：引物组2合物
[0034]
[0035]
[0036][0037]
*兼并引物
[0038]
2、短片段叠瓦式扩增检测试剂盒：本发明还提供一种含有上述引物组1、2合物的基于高通量测序的检测试剂盒，其用于扩增上述的引物组1、2合物的目标片段(mix1和mix2)。
[0039]
(1)反应体系：总体积为50μl，组分如下：
[0040][0041][0042]
优选地，所述样本基因组dna采集于血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)、毛发、组织等人体生物检材；或者，可选的，所述样本基因组dna为标准品dna，如女性标准品dna 9947a、
男性标准品dna 2800m等。
[0043]
(2)反应条件：
[0044][0045]
3、文库构建及高通量测序
[0046]
(1)对步骤2中的扩增产物mix1和mix2进行纯化和定量，稀释到0.2ng/μl，等比例(1:1)混合为mix。
[0047]
优选地，所述步骤3(1)中的纯化采用磁珠完成，所述步骤3(1)中的定量可采用qubit或qpcr方式。
[0048]
(2)以步骤3(1)中的mix为对象，以连接接头和标签的方式，建立包含多个样品的线粒体基因组文库。
[0049]
(3)对步骤3(2)制备的文库在高通量测序平台完成测序。通过桥式pcr或油包水pcr在芯片上制备单克隆模板；利用边合成边测序的策略，加入带标记的底物核苷酸，在测序酶的作用下使底物核苷酸与测序文库中的模板进行结合，同时收集该过程中产生的荧光信号或离子信号并确定所测位点的碱基信息，当上一轮测序完成后，重复测序过程，实现高通量测序。优选地，所述步骤3(3)中的高通量测序平台包括miseq fgx或者ion torrent。
[0050]
4、数据分析
[0051]
借助服务器及配套软件实时生成原始文件，采用自行编写的manifest文件和bed文件对步骤3(3)获取的测序文件进行二次分析。优选地，所述步骤4中manifest文件为针对fastq格式测序信息进行结果分析(图2)；bed文件为针对bam格式测序信息进行结果分析(图3)。
[0052]
manifest文件格式如下：
[0053]
[0054][0055]
bed文件格式如下：
[0056][0057]
[0058][0059]
实施例1
[0060]
本实施例为采用本试剂盒检测3例陈旧血痕样本线粒体全基因组。
[0061]
无关个体陈旧血痕样本：由志愿者提供，实验室保存10年以上。
[0062]
样本dna提取：采用磁珠法或其他提取方法获得基因组dna。
[0063]
样本dna定量：采用实时荧光定量pcr方法或其他定量基因组dna方法。
[0064]
单倍群分型：采用emma或haplogrep2软件。
[0065]
样本检测结果：采用本发明提供的试剂盒检测3例陈旧血痕样本(定量结果分别为246pg、280pg、120pg)线粒体全基因组突变信息及单倍群分型见下表：
[0066]
[0067][0068]
本实施例结果表明，3例陈旧血痕样本均检测出线粒体全基因组序列信息，这一信息采用电泳线粒体snp检测技术无法获知。例如，陈旧血痕样本1采用电泳试剂盒检测后仅得到16个突变，单倍群分型为d4e；采用本试剂盒及高通量测序后结果如图2所示，可得到38个突变，较前者提升137％，且单倍群分型为d4e3，较前者更加准确。同样，陈旧血痕样本2和3中采用电泳试剂盒检测可获得的突变个数较少，出现单倍群分型错误的情况。高通量测序技术显然为线粒体全基因组分析提供了更为科学及全面的一种检测手段。这种测序结果的获得对于常见母系鉴定案件及复杂疑难案件提供了更多的遗传证据。
[0069]
实施例2
[0070]
本实施例为采用本试剂盒检测微量检材(以50pg标准品dna 9947a为例),与经典sanger测序结果一致性比较。
[0071]
样本dna定量：采用实时荧光定量pcr方法或其他定量基因组dna方法。
[0072]
样本检测结果如图4所示：93g,195c,214g,263g,309.1c,309.2c,315.1c,750g,1438g,4135c,4769g,7645c,7861y,8448c,8860g,9315c,13572c,13759a,15326g,16311c，16519c；单倍群为:h11b1。
[0073]
本实施例结果表明，50pg标准品dna 9947a即可检测出线粒体全基因组序列信息，且突变信息与1ng标准品dna 9947a的sanger测序结果完全一致。虽然本实施例在高通量测序与sanger测序中使用相同引物对标准品进行扩增检测，但是dna起始模板量仅为sanger测序方法的1/20，且高通量测序仅需要2个pcr反应，而sanger测序则需要62个pcr反应。本
实施例为线粒体全基因组测序提供了更为简单、经济、准确、自动化的一种检测手段，更适用于微量检材的检测。
[0074]
实施例3
[0075]
本实施例为采用本发明所提供试剂盒对线粒体基因组突变异质性的检测。
[0076]
如图4结果所示，采用本发明的高通量测序方法可对线粒体基因组第7861个碱基突变异质性直接判读为7861y，而采用sanger测序方法，该碱基被误读为不存在突变(t7861)，需要人工判读加以修正。
[0077][0078][0079]
实施例4
[0080]
本实施例为采用本发明所提供试剂盒对标准品dna 9947线粒体基因组检测灵敏度的评估。
[0081]
样本dna定量：采用实时荧光定量pcr方法或其他定量基因组dna方法。
[0082]
样本检测结果：采用本发明提供的试剂盒对不同起始模板量的标准品dna 9947a检测线粒体全基因组突变信息及单倍群分型见下表：
[0083][0084][0085]
本实施例结果表明，标准品dna 9947a在起始模板量50-1000pg下均可检测出线粒体全基因组序列信息；在起始模板量10pg下，第309碱基到第315个碱基之间出现缺失。尽管如此，并没有影响到单倍群正确划分。本实施例为线粒体全基因组测序提供了最佳检测范围，灵敏度可低至50pg，可适用于量小体微检材的检测。
[0086]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。