1.本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种制备恒温扩增混合酶系的方法。


背景技术：

2.冷冻干燥技术(冻干技术)是将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去的干燥方法。采用冷冻干燥技术制成的酶冻干粉可以在低温保存时避免反复冻融，是一种良好且通用的酶的保存方法。
3.恒温扩增技术是在核酸扩增过程中采用恒定温度进行反应的技术，由于不需要qpcr技术必须的qpcr仪，可以大幅度节省仪器成本，不需要精密控温的加热仪器也可以做成较小体积携带，极大方便恒温扩增技术的应用。重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymeraseamplification，rpa)是恒温扩增技术的一种，其反应高效、灵敏度高、特异性强的特点使其在核酸检测领域逐渐受到重视。
4.rpa反应通常用到5-8个单酶来启动反应，实验表明这5-8个单酶在混合配置成完整的rpa酶系后在-20℃下存放不稳定，因此采用将rpa酶系冻干的方法来实现配置好的酶系的低温长期储存。然而现有的冻干制备rpa混合酶系的方法存在酶活损失大、反应效率低的问题。
5.因此，本领域技术人员致力于开发能够获得避免rpa酶系中酶活损失的制备工艺。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种能够稳定制备恒温扩增酶系的方法。
7.本发明的第一方面，提供了一种制备恒温扩增混合酶系的方法，所述方法包括步骤：
8.(1)提供恒温扩增混合酶系所需要的单酶，各单酶相互独立地储存于各保存液中，各保存液中的甘油含量为约20％-70％(w/w)；
9.(2)将步骤(1)提供的单酶混合，制得混合酶液；
10.(3)对步骤(2)获得的混合酶液进行透析；和
11.任选地，
12.(4)对透析后的混合酶液进行浓缩处理。
13.在另一优选例中，所述恒温扩增混合酶系为rpa混合酶系。
14.在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
15.(5)对透析后或浓缩后的混合酶液进行冻干处理。
16.在另一优选例中，所述恒温扩增混合酶系所需要的单酶包括：重组酶、单链结合蛋白、和dna聚合酶。
17.在另一优选例中，所述恒温扩增混合酶系所需要的单酶还包括：装载蛋白。
18.在另一优选例中，所述恒温扩增混合酶系所需要的单酶还包括：核酸外切酶、和/
或肌酸激酶。
19.在另一优选例中，所述恒温扩增混合酶系所需要的单酶还包括选自下组的一种或多种组分：逆转录酶、核糖核酸酶阻抑蛋白、和无机焦磷酸酶。
20.在另一优选例中，所述装载蛋白为装载蛋白uvsy。
21.在另一优选例中，所述核酸外切酶为核酸外切酶iii(exonuclease iii，exo)。
22.在另一优选例中，所述重组酶为重组酶uvsx。
23.在另一优选例中，所述单链结合蛋白为单链结合蛋白gp32。
24.在另一优选例中，所述dna聚合酶为dna聚合酶bsu。
25.在另一优选例中，所述逆转录酶为逆转录酶mmlv。
26.在另一优选例中，步骤(3)中，透析所用透析液包括：20-80mm tris，200-400mm nacl，0.05-0.2mm edta，0.5-2dtt，并且所述透析液的ph为6.5-7.5；优选地透析所用透析液包括：50mm tris，300mm nacl，0.1mm edta，1mm dtt，ph为7.0。
27.在另一优选例中，步骤(3)中，透析所用透析袋为5-10kd透析袋。
28.在另一优选例中，步骤(3)中，透析温度为约0-10℃，优选为0-4℃；透析时间为5-24小时，优选为10-20小时。
29.在另一优选例中，步骤(3)中，透析所用透析液的体积是所述混合酶液体机的50-200倍，优选为100倍。
30.在另一优选例中，步骤(4)中，采用超滤管对对透析后的混合酶液进行浓缩处理。
31.本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括使用本发明第一方面所述的方法制备的恒温扩增混合酶系。
32.在另一优选例中，所述试剂盒还包括特异性引物和/或探针。
33.在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器具有使用本发明第一方面所述的方法制备的恒温扩增混合酶系。
34.在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器具有选自下组的一种或多种组分：磷酸肌酸、tris-hcl、atp、dtt、dntps、醋酸钾、和聚乙二醇。
35.在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器具有醋酸镁。
36.在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器具有水或缓冲液。
37.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
38.图1显示了实施例1中的检测结果。
具体实施方式
39.本发明人通过广泛而深入的研究，意外发现将已经配置好的含甘油的恒温扩增酶系通过透析的方式去除绝大部分甘油，然后采用超滤的方法对含微量甘油的酶系进行浓缩，实验表明通过此方法制备的恒温扩增微量甘油酶系的性能优于含甘油酶系。在此基础上，完成了本发明。
40.在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
41.除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
42.虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
43.酶通常需要在较低的温度下才能长期保存，由于反复冻融会影响酶的活性，通常会在储液中添加50％的甘油保证酶在-20℃下液态保存。但部分酶在-20℃下液态储存时仍然不稳定，或者酶本身在反应过程中需要避免甘油的添加，这些场景下采用50％的甘油储液不利于酶的保存。
44.本发明人研究发现恒温扩增(如rpa)酶系的储液，在冷冻状态下保存单酶的稳定性较差，且存在甘油时会让酶系凝固温度下降，导致冻干过程中酶系的冷冻效果差。可以在rpa各个单酶的制备过程去除甘油，获得储液不含甘油的各个单酶，但去除甘油的单酶无法在-20℃下的低温存放，而每个单酶在配置成完整的rpa酶系之前需要事先进行质量检测和浓度确定，这导致配置好的单酶会在0℃以上存放一段时间，而0℃以上的存放过程会造成酶活的损害，造成配置的完整rpa酶系效果下降。
45.本发明将已经配置好的含甘油的rpa酶系通过透析的方式去除绝大部分甘油，然后采用超滤的方法对含微量甘油的酶系进行浓缩，实验表明通过此方法制备的rpa微量甘油酶系的性能优于含甘油酶系。
46.重组酶聚合酶扩增技术
47.重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)是恒温扩增技术的一种。关于rpa方法的披露，包括美国专利文献us 7,270,981；us 7,399,590；us 7,666,598；us 7,435,561；美国专利公开us 2009/0029421；国际申请wo 2010/141940。
48.rpa体系的关键酶包括能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶。重组酶与引物结合形成的蛋白-dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动dna合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的dna链与ssb结合，防止进一步替换。
49.rpa反应启动时重组酶能配对与双链dna模板同源的寡核苷酸引物。存在核苷酸模板时，用2种或多种序列特异引物(如基因特异)即开始指数扩增反应。反应进展迅速，双链dna模板序列的特异扩增的结果是几分钟内dna模板从仅有几个拷贝扩增达到可检测的水平。
50.本发明在实时荧光rpa技术基础上加入了逆转录酶、核糖核酸酶阻抑蛋白和无机焦磷酸酶，在反应体系中同时采用逆转录酶和核糖核酸酶阻抑蛋白来启动和维持rna模板扩增反应的正常进行，加入无机焦磷酸酶显著提升了反应效率。
51.重组酶
52.用于rpa反应的重组酶(重组蛋白)可以来自原核生物、病毒或真核生物。典型的重
组酶包括uvsx和reca(如从任何物种获得的reca蛋白或uvsx蛋白)，和他们的片段或突变体，或者它们之间的任意组合。
53.reca和uvsx蛋白可以从任何物种获得，reca和uvsx片段或突变体蛋白也可以用合适的reca和uvsx蛋白，核苷酸序列和分子生物学技术产生(见如在美国专利第8,071,308号中描述的uvsx突变体的形成)。典型的uvsx蛋白包括那些源自肌病毒科噬菌体蛋白(myoviridae phages)，例如t4,t2,t6,rb69,aeh1,kvp40,不动杆菌噬菌体(acinetobacter phage)133，气单胞菌噬菌体(aeromonas phage)65，噬蓝藻体(cyanophage)p-ssm2，噬蓝藻体(cyanophage)pssm4，噬蓝藻体(cyanophage)s-pm2,rb14,rb32,气单胞菌噬菌体(aeromonas phage)25，弧菌噬菌体nt-1，phi-1,rb16,rb43,噬菌体31,噬菌体44rr2.8t,rb49,噬菌体rb3,和噬菌体lz2。其他典型的重组酶蛋白包括古细菌rada和radb蛋白和真核(如植物、哺乳动物和真菌)rad51蛋白(如rad51,rad51b,rad51c,rad51d,dmc1,xrcc2,xrcc3,and reca)(见例lin等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.103:10328-10333,2006)。
54.在本发明一个优选地实施方式中，所述重组酶为重组酶uvsx，典型的uvsx的氨基酸序列参见ncbi序列号np_049656.2。
55.单链结合蛋白
56.单链结合蛋白(单链dna结合蛋白)可以用来稳定核苷酸，一种或多种单链dna结合蛋白可以来源于或从各种物种中获得，如从原核生物、病毒或真核生物。典型的单链dna结合蛋白包括但不限于大肠杆菌ssb和那些源自肌病毒噬菌体的单链dna结合蛋白，例如t4,t2,t6,rb69,aeh1,kvp40,不动杆菌噬菌体133，气单胞菌噬菌体65，噬蓝藻体，弧菌噬菌体等。
57.本发明中，优选地单链结合蛋白为单链结合蛋白gp32。gp32蛋白在t4噬菌体的dna复制、重组和修复过程中起着关键作用，这其中最重要的是因为gp32蛋白具有紧密结合单链dna的特性，典型的gp32蛋白的氨基酸序列参见ncbi序列号np_049854。
58.dna聚合酶
59.dna聚合酶可以是真核的或原核生物的聚合酶。真核生物聚合酶的实施例中包括pol-alpha,pol-beta,pol-delta,pol-epsilon，和它们的突变体或片段，或它们的组合。原核生物聚合酶的实施例中包括大肠杆菌(e.coli)dna聚合酶i(如科莱诺(klenow)片段)，噬菌体t4 gp43 dna聚合酶，嗜热脂肪芽孢杆菌聚合酶i的大片段,phi-29 dna聚合酶，t7 dna聚合酶，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)pol i，金黄葡萄球菌(staphylococcus aureus)pol i，大肠杆菌dna聚合酶i，大肠杆菌dna聚合酶ii，大肠杆菌dna聚合酶iii,大肠杆菌dna聚合酶iv,大肠杆菌dna聚合酶v,和它们的突变体或片段，或它们的组合。
60.本发明中，优选地dna聚合酶为bsu dna聚合酶。一般而言，bsu dna聚合酶(bsu dna聚合酶大片段，bsu dna polymerase large fragment)来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus subtilis)，将bacillus subtilis dna聚合酶i基因的前296个密码子截去而得。该片段保留了bsu dna聚合酶5
′‑3′
聚合酶活性，但是缺失了5
′‑3′
核酸外切酶活性，同时该大片段自身缺失3
′‑5′
核酸外切酶活性。典型的bsu dna聚合酶的氨基酸序列参见ncbi序列号aar00931.1。
61.装载蛋白
62.装载蛋白可以是源自原核生物、病毒或真核生物。典型的装载蛋白包括大肠杆菌
reco,大肠杆菌recr,uvsy,和它们的突变体或片段，或它们的组合。典型的uvsy蛋白包括那些源自肌病毒噬菌体例如t4,t2,t6,rb69,aeh1,kvp40，不动杆菌噬菌体133，气单胞菌噬菌体65，噬蓝藻体p-ssm2，噬蓝藻体pssm4，噬蓝藻体s-pm2,rb14,rb32,气单胞菌噬菌体25，弧菌噬菌体nt-1，phi-1,rb16,rb43,噬菌体31,噬菌体44rr2.8t,rb49,噬菌体rb3,和噬菌体lz2。
63.本发明中，优选地装载蛋白为装载蛋白uvsy。典型的装载蛋白uvsy的氨基酸序列参见ncbi序列号np_049799.2。
64.核酸外切酶
65.核酸外切酶是指水解酶类中几种亚类酶的总称(ec3.1.11.13.14.15.16)，能够催化核酸链末端的磷酸二酯键水解而逐个切下核苷酸。按底物专一性分为dna外切酶、rna外切酶以及对dna和rna均可作用的核酸外切酶。
66.在本发明一个优选实施方式中，本发明的核酸外切酶为核酸外切酶iii(exonuclease iii)。典型的核酸外切酶iii的氨基酸序列参见ncbi序列号wp_000673937.1。
67.肌酸激酶
68.肌酸激酶(creatine kinase，ck)是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、atp再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与atp之间的转磷酰基反应。
69.肌酸激酶可选择兔肌激酶，鲤肌激酶，例如鲤肌激酶m1型(m1-ck)。典型的肌酸激酶的氨基酸序列参见ncbi序列号np_001075708.1。
70.逆转录酶
71.逆转录酶(reverse transcriptase)又称为依赖rna的dna聚合酶。该酶以rna为模板，以dntp为底物，trna(主要是色氨酸trna)为引物，在trna 3'-oh末端上，根据碱基配对的原则，按5'-3'方向合成一条与rna模板互补的dna单链，这条dna单链叫做互补dna(complementary dna，cdna)。
72.逆转录酶可用于合成第一链cdna、制作cdna探针、rna转录、测序和rna的逆转录反应。本领域常用的逆转录酶包括鼠白血病病毒(m-mlv)逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒(amv)逆转录酶。典型的肌酸激酶的氨基酸序列参见ncbi序列号aaa66622.1。
73.核糖核酸酶阻抑蛋白
74.核糖核酸酶阻抑蛋白(rnasin)是rna酶的蛋白质抑制剂(rnasin)。可以从大鼠肝或人胚盘中提取获得，或者采用基因重组的方式制备。rnasin是rna酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种rna酶结合，使其失活。典型的rnasin的氨基酸序列参见ncbi序列号p13489.2。
75.无机焦磷酸酶
76.无机焦磷酸酶(ipp)催化无机焦磷酸盐水解生成正磷酸盐。可以通过携带无机焦磷酸酶基因的重组e.coli菌株或酵母菌株制备无机焦磷酸酶。典型的无机焦磷酸酶的氨基酸序列参见ncbi序列号wp_000055072.1。
77.rt-rpa反应体系和检测方法
78.在优选地实施方式中，本发明的rt-rpa反应体系包括：
79.重组蛋白uvsx、装载蛋白uvsy、单链结合蛋白gp32、核酸外切酶iii、bsu dna聚合
酶、肌酸激酶ck、逆转录酶(mmlv)、rnasin、ipp酶、磷酸肌酸(pc)、tris-hcl(ph7.5)、atp、二硫苏糖醇(dtt)、dntps、醋酸钾(koac)、醋酸镁、聚乙二醇(如peg35000)。
80.在另一个优选地实施方式中，rt-rpa反应体系中各组分含量如下：
[0081][0082][0083]
优选地，rt-rpa反应体系中上游引物浓度为10-200nm、下游引物100nm、探针50-300nm、rna模板1-10μl。优选地，rt-qrpa体系总体积为15-50μl，不足的部分用双蒸水补充。
[0084]
反应程序：
[0085]
20-45℃恒温，持续反应10-40分钟。
[0086]
反应终点通过琼脂糖凝胶电泳、sybr green i或特异性探针进行监测。sybr green i监测时，反应体系增加终浓度为0.3-0.5x sybr green i。反应时间可在20-40min，每30s读取一次荧光。检测用仪器可使用abi7500，ftc-3000，bio-rad cfx miniopticon system，gendx恒温荧光检测仪gs8等。
[0087]
如采用特异性探针检测扩增体系，荧光标记探针终浓度10-500nm。荧光检测采用abiquantstudio 5，abi7500，ftc-3000，bio-rad cfx miniopticon system，gendx恒温荧光检测仪gs8等。
[0088]
本发明的主要优点在于：
[0089]
本发明提供的制备rpa混合酶系的方法，能够显著提高rpa混合酶系冻干样品的扩增效率。
[0090]
本发明的方法可以节省额外制备无甘油rpa酶系的成本，无需额外生产无甘油rpa单酶，提高了制备混合酶系的效率，同时实验证实此方法还可提升反应体系的性能。
[0091]
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0092]
实施例1
[0093]
将rpa酶系所需要的单酶，分别保存于保存液中，保存液为甘油含量为50％(w/w)的甘油水溶液。单酶为：重组蛋白uvsx、装载蛋白uvsy、单链结合蛋白gp32、核酸外切酶iii、bsu dna聚合酶、肌酸激酶ck、逆转录酶(mmlv)、rnasin、ipp酶。
[0094]
将rpa酶系所需要的9种单酶按照特定比例混合后制成rpa混合酶系(50ml)，由于8种单酶在含50％甘油的保存液中储存，因此配置出的rpa酶系储液同样含有50％甘油。
[0095]
配置去甘油酶系透析液，配方如下：50mm tris，300mm nacl，0.1mm edta，1mm dtt，ph 7.0。
[0096]
含甘油rpa酶系放入10kd透析袋中，透析袋两头密封后放入到500ml去甘油酶系透析液中，随后将透析液放在4℃下静置16小时以上。
[0097]
从透析袋中取出透析完成后的rpa酶系，含甘油的酶系在不含甘油的透析液中透析会导致酶系的体积变大，因此将透析后的酶系放入3kd的超滤管中，将超滤管放入离心机，设置转速为5000rpm，持续30分钟进行酶系的浓缩，最终得到的微量甘油混合酶系的体积和透析前的混合酶系体积相同。
[0098]
本实施例采用的rt-rpa反应体系中酶含量如下：
[0099]
组分含量重组蛋白uvsx500ng/μl装载蛋白uvsy228ngμl单链结合蛋白gp32919ng/μl核酸外切酶iii3ng/μlbsu dna聚合酶9.5ng/μl肌酸激酶ck1ng/μl逆转录酶(mmlv)5u/μlrnasin20u/μlipp酶1u/μl
[0100]
混合酶系的配制，按照上述比例进行。
[0101]
本实施例采用的rpa反应液如下：
[0102]
rpa基础反应液成分rpa反应液组分浓度磷酸肌酸(pc)1mmtris-hcl(ph7.5)10mmatp10mm二硫苏糖醇(dtt)2.7mmdntps25μm醋酸钾(koac)100mm
醋酸镁15mmpeg350003％
[0103]
按照表格所示内容将rpa基础反应液配置加入100nm反应上游引物、100nm反应下游引物、150nm反应探针和8μl不同浓度的反应用rna模板，后组成完整的rt-qrpa体系，总体系为20μl，不足20μl的部分用双蒸水补充到20μl。
[0104]
反应程序：
[0105]
42℃恒温，持续20分钟，检测通道为fam，每30秒检测一次荧光信号，检测在abi quantstudio 5定量pcr仪上开展。
[0106]
检测靶标为apob基因：
[0107]
cagtgtatctggaaagcctacaggacaccaaaataaccttaatcatcaattggttacaggaggctttaagttcagcatctttggctcacatgaaggccaaattccgagagactctagaagatacacgagaccgaatgtatcaaatggacattcagcaggaacttcaacgatacctgtctctggtaggccaggtttatagcacacttgtcacctacatttctgattggtggactcttgctgctaagaaccttactgactttgcagagcaatattctatccaagattgggctaaacgtatgaaagca(seq id no.1)
[0108]
上游引物：cagtgtatctggaaagcctacaggacaccaaaa(seq id no.2)
[0109]
下游引物：tgctttcatacgtttagcccaatcttggatag(seq id no.3)
[0110]
探针：
[0111]
attcagcaggaacttcaacgatacctgtctctg-thf-taggccaggtttatagca[c3-spacer](seq id no.4)
[0112]
第32个碱基为t，修饰成带fam荧光基团的碱基；
[0113]
第33个碱基和第34个碱基之间加入一个thf(四氢呋喃)位点；
[0114]
第34个碱基为t，修饰成带bhq1淬灭基团的碱基；
[0115]3’
端加入c3-spacer。
[0116]
将上述所示apob基因克隆至质粒中，然后通过pcr的方式在模板的5’端加入t7体外转录的启动子：taatacgactcactatagg(seq id no.5)，再通过t7 rna聚合酶识别启动进行转录，获得对应的apob rna模板，随后加入dnase消化dna模板，最后在80℃下加热2min灭活制得。
[0117]
检测结果如图1所示，扩增曲线分别代表测试组使用未经透析处理的混合酶系冻干品和经透析并浓缩处理后的混合酶系冻干品的测试结果，其中透析并浓缩后酶系测试组的ct值为8.697，透析处理前酶系测试组的ct值为10.749，结果表明本制备方法不仅将酶系的甘油含量由50％降低至1％以下，同时反应体系的扩增效率也得到了显著地提升。
[0118]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。