基因smlac1及在调控原花青素合成中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程及分子生物学技术领域，具体为基因smlac1及在调控原花青素合成中的应用。


背景技术：

2.原花青素对于植物具有抗紫外线、抗病、抗虫、清除自由基、调节种子休眠和萌发等生理功能，并影响作物的适口性、可消化性、保健价值等品质性状。原花青素提取物就有多方面的医疗价值，可用于抗衰老、防治心血管疾病、防治肿瘤等，由于其保健和医疗作用，目前已广泛应用于食品、药品和化妆品领域。
3.原花青素是黄烷-3-醇单体的低聚物或高聚物，如儿茶素和表儿茶素。每分子原花青素由一个起始单元和一个或多个延伸单元构成。根据聚合单体的多少，原花青素分为二聚体、三聚体和四聚体等低聚体和五聚体以上的多聚体。b型原花青素单体间仅有一个内黄烷键，通过c
4-c8或者c
4-c6链接。虽然原花青素的聚合的机理已经研究了50多年，但仍存在争议。目前，人们公认的假设是原花青素聚合是通过非酶缩合形成的。然而，其他一些科学家提出，原花青素的聚合可以由氧化酶催化，如多酚氧化酶、漆酶和过氧化物酶。所以，原花青素的聚合机制的研究依然处于起步阶段。
4.研究发现丹参漆酶基因smlac1在花中高表达并受mir397a调控，在过表达mir397a丹参花中，smlac1的表达显著降低。smlac1可以催化黄烷-3醇单体聚合产生原花青素。
5.因此，如何对丹参漆酶基因smlac1应用于合成花青素中是本领域技术人员亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供利用丹参漆酶基因smlac1调控原花青素合成的方法，以解决上述背景技术中提出的黄烷-3-醇生物合成途径已经基本明确，但是pa聚合机制的全面了解仍处于起步阶段，尤其是对pa氧化聚合的机制还不清楚的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.一种丹参中漆酶基因smlac1，所述丹参中漆酶基因smlac1的序列如seq id no.1所示。
9.一种丹参中漆酶smlac1蛋白，所述smlac1蛋白的序列如seq id no.2所示。
10.丹参漆酶基因smlac1在调控原花青素合成中的应用，其中，所述原花青素包括原花青素b1,b2,b3二聚体。
11.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护利用丹参漆酶基因smlac1调控原花青素合成的方法，过程为通过提高丹参漆酶smlac1的表达量，提高生物体内原花青素的产量；其中，所述提高丹参漆酶基因smlac1的表达量为通过携带smlac1的表达载体转化至生物体内；所述生物体包括微生物和植物。
12.作为上述技术方案优选的技术方案，过程包括：
13.1)微生物中导入并表达smlac1基因，培养含有表达smlac1基因的微生物；
14.2)然后从菌体中提取smlac1蛋白进行体外酶活反应，或者从菌体中直接反应提取原花青素。
15.作为上述技术方案优选的技术方案，smlac1蛋白在体外生产或制备原花青素的方法为采用smlac1蛋白催化黄烷-3-醇，反应体系中含有100mm醋酸缓冲液，20-50μg纯化的蛋白，底物黄烷-3-醇浓度为100-200μm，反应条件为28℃，120rpm，振荡反应2-4h后取出加入等体积的甲醇终止反应。
16.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护丹参漆酶基因smlac1在制备原花青素合成含量高的转基因植物以及在原花青素合成含量高的转基因植物育种中的应用。
17.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护含有丹参漆酶基因smlac1的生物材料在制备提高原花青素产量的转基因植物中的应用，所述原花青素为原花青素b1,b2,b3二聚体，所述生物材料包括表达盒、载体、宿主细胞或工程菌。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
19.本发明公开了丹参中漆酶基因smlac1及其编码蛋白，以及用于生产或提高原花青素含量的方法，该基因是首次从丹参植物中克隆得到，该编码的蛋白能够催化黄烷-3-醇聚合成原花青素，在生产有效的活性物质方面具有应用价值，为大规模生产原花青素提供新的途径，也为工业生产其他相关的原花青素奠定了坚实的基础。
附图说明
20.图1为采用荧光定量pcr检测转pbi121-ptr-mir397a的丹参转基因株系中mir397的相对表达水平的变化图；
21.图2为过表达ptr-mir397a的7个丹参株系中的原花青素b1,b2和b3的升降图；
22.图3为smlac1在野生型植物花中和转基因植株中表达升降图；
23.图4为在smlac1催化体系中，儿茶素和表儿茶素被催化是否产生了原花青素对比图。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
26.实施例1：
27.过表达mir397丹参花原花青素含量的变化：
28.采用冻融法分别将表达载体pbi121-ptr-mir397a转化至农杆菌gv3101中，共得到
7个转基因株系，采用荧光定量pcr检测转pbi121-ptr-mir397a的丹参转基因株系中mir397的相对表达水平的变化(如图1)，结果表明，与野生型丹参植株相比，转pbi121-ptr-mir397a的过表达丹参植株mir397的表达量显著提高；
29.采用丙酮提取法提取原花青素，提取剂：70％丙酮和0.5％的乙酸，0.1g的丹参花液氮研磨，加入提取剂，室温下冰水中超声30分钟，10000rpm离心5分钟，沉淀再次提取两次，上清合并，沉淀保存用于分析不溶原花青素，在上清液中加入等体积的氯仿，涡旋30s，10000rpm离心5分钟，氯仿萃取上清液两次后，再用己烷萃取上清液两次，所得水相冻干后溶于50％甲醇中，滤膜过滤后上样，进行uplc分析；
30.总的可溶原花青素分析：在2提出的上清液中加入dmaca(0.2％w/v dmacainmethanol/hcl(1:1,v/v))，用分光光度计在640nm检测其吸收峰，用儿茶素作为对照；
31.不可溶原花青素的提取：采用丁醇-盐酸法，丁醇盐酸加入2中的沉淀中，在冰水中超声1小时，然后煮沸1小时，冷至室温，10000rpm离心8分钟，用分光光度计在550nm检测其吸收峰，用原花青素b1作为对照；
32.色谱条件：超高液相色谱条件：采用acquitybeh-c18(1.7μm,2.1
×
100mm)色谱柱，以0.1％甲酸水(a)，0.1％甲酸甲醇(甲醇中含有0.1％的甲酸)作为流动相，梯度洗脱(0.01-1.50min,10％-20％b；1.50-3.00min,20％-20％b；3.00-7.00min,20％-40％b；7.00-9.50min,40％-90％b；9.50-12.00min,90％-100％b)流速为0.2ml.min-1,柱温为环境温度，进样体积2μl。检测波长为278nm；
33.结果与分析
34.与野生丹参植株相比，过表达ptr-mir397a的7个丹参株系中的原花青素b1,b2和b3的含量显著降低，总的可溶原花青素和不可溶原花青素的含量降低，而儿茶素和表儿茶素的含量显著升高(图2)；
35.采用hisat2将转基因丹参花与野生丹参花的rna-seq数据比对至丹参基因组，利用cufflinks计算基因的表达量(fpkm)，进一步筛选出在特异表达漆酶基因；
36.结果与分析
37.通过转录组数据分析，发现18个mir397靶基因漆酶基因的表达降低，其中smlac1降低的最为显著，与原花青素的含量呈正相关，smlac1在野生型植物花中表达量最高，在转基因植株中表达下调最显著(图3)，我们选择smlac1进行进一步分析，以证实smlac1在pa聚合中的作用，并阐明pa聚合的潜在机制；
38.实施例2
39.克隆丹参漆酶smlac1基因和构建大肠杆菌表达载体：
40.首先对过表达mir397丹参和野生丹参花的转录组进行深度测序，然后，根据花中差异表达基因的筛选确定在花中表达明显下降的靶基因漆酶基因，通过体外酶活鉴定确定了候选基因的功能；
41.原核表达载体采用酶切连接的方法构建，利用primer premier 5.0(pp5)设计引物，根据pp5软件推荐设计，设计引物时在smlac1全长的两端引物各自加上了酶切位点(用下划线表示)；
42.f：gcggccgcatggagcgctctttgatgttttcagcatg，如seq id no.3所示；
43.r：ggatccgcacttgggaaaatcagccggcggcgg，如seq id no.4所示；
44.smlac1基因的克隆
45.以丹参花为材料，按照rna提取试剂盒的说明书提取丹参花的总rna，使用反转录试剂盒进行反转录得到丹参花的cdna；
46.以cdna为模板，进行扩增反应，获得smlac1的全长基因atggagcgctctttgatgttttcagcatgggttttggctcttttggtttgtttgtcgtcatttgcttccgctgctatcgtggagcacacatttcacgtgaaaaatcttacagtgaacaaattatgcagaaatcaagttataacggcagtaaatggtagtctcccagggcccactcttcgagtgcacgagggtgataccttagtcgttcatgtgtttaacaagtcgccgtataacctaactattcattggcacgggattttccaaatccttagcgggtgggctgacgggccggagttcgctacccaatgcccgatccgacccggtcagagctacacctacagatttaacataacaggtcaagagggaactctttggtggcatgcacacgtcggatggctccgagccacagtttacggagccttggtaatccgacccagatccggtcactcattcccatttccaaagccacacagagaaatccccattgtccttggggagtggtggaatgctaatgttattgacgtagaaaaccaagccttagccacgggtgccgcacctaacttatccgatgcttacactattaatggccatcccggaaatctctacccgtgctcatcaaacgatacgttcagactaacagtggtgcacggaaagacatatctcctacgcataatcaacgctgcactcaacaatcaactttttttcaaaatagcgaatcataacctcaccgtagttgcggtggacgcctcctacacgaacccctacaccaccgacgtggtgttggtggcgccggggcagaccaccgacgtcctcctcactgccgaccaaacgccggcgagatactacatggcggcgagcgcctaccaaagtgccgccggcgtcccgttcgacaacaccacgaccaccgggatcgtggcctacagcggaacgacgccgtccgcgccgatcatgcccctcctgccggccttcaacgacacgccgacggcccacagattcttcagcaacctaaccgcattagtctcgagccgattttgggcccccgttccccgccacgtggatgagcgcatgttcgttacaatcgggctgggcctgtcggcctgcgacctcccccagtgtcagggcccgttcgggctgaagttggccgccagcatgaacaacgcgtctttccagttcccgacgaggctgtccatgctggaggccttctttagaggcgtcggcggtatttacaccgccgactttcccgataacccgccggtgcgattcgactacaccaactctagcaatagcctcaaccaggcgctgctgaatacgacgaaatcgaccaaggtgaagaaggtcaggttcaattcgacggtggaggtggtgctgcagaacacggcgttcctcggagtggaaaatcaccccattcatttgcacggattcaatttctatgttttggctcaaggttttggcaattataaccctgcacttgatactaggaagttcaattttgtgaatccgcaggagaggaacaccatcggcgttccggtcggtggatgggccgtgataaggtttcgcgccaataatccaggtgtgtggttgattcactgtcacctggatgtgcacttgccgtggggtctagcaacggctttcgtggtggagaacgggcctacgccagcgacaacgctacctccgccgccggctgattttcccaagtgctaa；如seq id no.1所示；
47.蛋白序列：
48.merslmfsawvlallvclssfasaaivehtfhvknltvnklcrnqvitavngslpgptlrvhegdtlvvhvfnkspynltihwhgifqilsgwadgpefatqcpirpgqsytyrfnitgqegtlwwhahvgwlratvygalvirprsghsfpfpkphreipivlgewwnanvidvenqalatgaapnlsdaytinghpgnlypcssndtfrltvvhgktyllriinaalnnqlffkianhnltvvavdasytnpyttdvvlvapgqttdvlltadqtparyymaasayqsaagvpfdnttttgivaysgttpsapimpllpafndtptahrffsnltalvssrfwapvprhvdermfvtiglglsacdlpqcqgpfglklaasmnnasfqfptrlsmleaffrgvggiytadfpdnppvrfdytnssnslnqallnttkstkvkkvrfnstvevvlqntaflgvenhpihlhgfnfyvlaqgfgnynpaldtrkfnfvnpqerntigvpvggwavirfrannpgvwlihchldvhlpwglatafvvengptpattlppppadfpkc，如seq id no.2所示。
49.pcr反应体系：cdna1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，taqmix
50.10μl，ddh2o8μl；
51.pcr的设定程序是：1)98℃，5min；2)98℃，30s；3)60℃，45s；4)72℃，1min；5)72℃，10min，循环从2)到4)，循环数30个；
52.pcr扩增结束后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，分别获得了1701bp的基因全长，连接t载体，测序；
53.smlac1基因的原核表达
54.将测序正确的克隆子和pet30a使用质粒提取试剂盒提取质粒dna，测定质粒dna的浓度，之后进行酶切反应；
55.酶切反应：反应为40μl体系，质粒20μl，10xfastdigest缓冲液4μl；37℃温育4h，酶切产物使用胶回收试剂盒回收，测定回收产物的浓度，之后进行连接反应；
56.连接反应：反应为10μl体系，5μl酶切后的pcr产物和3μl酶切后的质粒dna，加入1μl 10x t4 dnaligase缓冲液，加入0.5μl连接酶，16℃连接过夜。
57.将上述反应产物转化大肠杆菌dh5α，将菌液涂布在含有50mg/l的卡那霉素的lb固体培养基上，37℃培养箱中过夜培养，次日挑取单克隆进行菌落pcr验证以及酶切验证，得到质粒pet30a-smlac1；
58.实施例3
59.在原核体系中验证smlac1蛋白可催化黄烷-3-醇的功能：
60.在原核大肠杆菌中表达smlac1基因
61.将原核表达载体pet30a-smlac1用化学转化的方法转入大肠杆菌rosetta2(de3)菌株中，得到含有目的基因的大肠杆菌菌株，同时转化含有空质粒作为阴性对照，在含有100mg/l的卡那霉素的lb固体培养基上37℃生长过夜，挑选阳性克隆用于后续实验；
62.然后挑取阳性单克隆在2ml含有100mg/l的卡那霉素的lb液体培养基中37℃下生长过夜，再接种到50ml含有100mg/l的卡那霉素的lb液体培养基中，37℃下培养od600至0.5，加入终浓度为0.1-0.5mm的iptg进行诱导，20℃-25℃，150-180rpm，诱导8-12h后，将诱导培养的菌液置于4℃冰箱过夜，将诱导的菌液离心取菌体沉淀进行蛋白纯化，并利用bca蛋白试剂盒测定其浓度，微生物包括但不限于大肠杆菌、农杆菌等细菌以及酵母、霉菌、蕈菌等真菌；
63.纯化的smlac1蛋白在体外按照以下反应进行体外功能验证：80-120mm醋酸缓冲液(ph4.5-5.5)，20-50μg纯化的蛋白，50-80mm儿茶素/表儿茶素/儿茶素和表儿茶素，25℃-30℃反应3-6h，用甲醇终止反应后混匀过0.22μm滤膜，用于uplc分析；
64.利用uplc检测其化学成分，仪器型号：waters，进样量2μl，色谱柱：watersacquitybehc18column(1.7μm，100
×
2.1mm)，柱温为环境温度，色谱条件：流动相：(a)：0.1％甲酸水，(b)：0.01-2.00min,5％-20％b；2.00-3.00min,20％-20％b；3.00-7.00min,20％-40％b；7.00-9.50min,40％-90％b；9.50-12.00min,90％-100％b；
65.q-tof-ms/ms条件：esi离子源，负离子扫描，样品锥30v，源温度100℃；去空温度20℃；去空气体(n2)流量900l/h；锥形气体(n2)流量，50l/h。通过mse质心分析，在分辨率为30,000时检测化合物，扫描时间为1s；
66.结果表明：在体外反应体系中，结果(如图4)，以pet30a空载为对照，儿茶素、表儿茶素、儿茶素和表儿茶素混合物为底物，不能产生新的产物；而在smlac1催化体系中，儿茶素，表儿茶素被催化产生了b类原花青素，结果说明smlac1能够催化黄烷-3-醇生成原花青
素。
67.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明；因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
68.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。