1.本发明属于沙棘籽精细加工领域，具体涉及一种从沙棘籽粕中高效制备高纯度低聚原花青素的方法。


背景技术：

2.沙棘(hippophaerhamnoides l.)，是胡颓子科沙棘属多年生落叶灌木或小乔木。沙棘的主要价值部分是沙棘果，沙棘的果肉、叶及种子中含有丰富的生物活性物质，如氨基酸、黄酮、多酚、原花青素、萜类等；目前，研究表明沙棘籽中含有原花青素的 4 种单体和 8 种二聚体，单体分别为儿茶素、表儿茶素、没食儿茶素和表没食子儿茶素，沙棘籽约占沙棘果渣重量46.9％，是沙棘产业中产量较大的资源性副产物，每年仅沙棘制品产生的沙棘籽高达数万吨，从沙棘籽中高效提取低聚原花青素不仅具有重要的理论价值，同时对于延长沙棘产业链、环境保护、资源有效利用也有重要意义。
3.原花青素(proanthocyanidins，pc)是植物中广泛存在的一大类多酚化合物的总称，按聚合度分，二至四聚体称为低聚原花青素（oligomericproanthocyanidins, opc），五聚体以上称为高聚原花青素（polymeric proanthocyanidins, ppc）；其中抗氧化性：二聚体》三聚体》四聚体》高聚体；opc已被报道具有抗氧化、抗菌消炎、抗癌、皮肤保健等作用；在体内，opc的抗氧化能力是ve的50倍，是vc的20倍，opc的水溶性较好，近年来在保健食品和化妆品得到广泛应用，年销售额高达上亿美元；ppc的水溶性差，酚羟基的活性受空间位阻限制，难以被人体吸收利用，只能作为低附加值产品进行利用，同时由于在植物提取中原花青素以高聚体为主，为了提高沙棘籽提取物的生物活性及水溶性，其中高聚原花青素的降解势在必行。
4.现有文献已报道了多种提取沙棘籽原花青素的方法，专利cn102432578b通过采用超声法提取和真空微波干燥技术干燥所提取的物质仅为沙棘籽原花青素的粗提物，专利cn105440003a采用室温闪式提取、低温负压热泵、温负压带式干燥三项技术提取沙棘籽中的原花青素方法。专利cn109111420a公开了一种低成本的低聚原花青素的制备方法，通过提取、浓缩、大孔树脂吸附、再浓缩、水溶、降聚、喷雾干燥得到低聚原花青素。
5.上述相关方法虽能够得到沙棘籽原花青素，但仍存在的缺点：（1）通过上述手段仅简单地将沙棘籽中原花青素的高聚体、低聚体提取出来；（2）大孔树脂的品种、规格繁多、操作复杂、技术要求高，在确定工艺条件时，需要优选；用一种树脂在同一条件下，较难提取多种化学成分；（3）上述手段中涉及原花青素高聚体的降解，但中间环节会降低低聚原花青素活性和提取率。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本技术提供一种从沙棘籽粕中高效制备高纯度低聚原花青素的方法，本工艺路线利用超高压设备、分子印迹、分子筛等分离技术，得到了三种平均聚合度《 5的低聚原花青素，具备工艺简单、反应时间短、提取率高等特点，以期望进一步的增
强原花青素在抗氧化等方面的效果。
7.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种从沙棘籽粕中高效制备高纯度低聚原花青素的方法，具体步骤如下：s1：干燥粉碎：首先将沙棘籽脱脂后，干燥粉碎过筛，得到 20~100 目沙棘籽粕粉；s2：沙棘原花青素的解聚与提取：利用超高压设备（60-100mpa）对沙棘籽粕进行前处理，然后在超声辅助的条件下分别采用ph 1.00~6.00的50%~90%乙醇对沙棘籽粕粉进行梯度提取，重复上述步骤2~6次，混合后得到原花青素提取液；s3：离心分离：将提取液放入低速离心机，在2000~10000r/min的条件下，离心5~30min，分离得到滤渣和滤液；s4：减压浓缩：将滤液放入真空旋转蒸发仪中减压回收乙醇，得到浓缩液；s5：分子印迹分离原花青素二聚体：在s4中浓缩液中，加入 1g 印迹材料，于水浴恒温振荡器中振荡吸附，待吸附达平衡后，过滤，得滤液a与吸附后的印迹材料，将吸附后印迹材料用蒸馏水洗涤并置于水浴恒温振荡器中振荡解吸，解吸结束后，得到原花青素二聚体溶液，而滤液a将进行s6操作，滤液a为吸附原花青素二聚体的混合液；s6：分子筛分离三聚体：称取1~20 g孔道为0.2~3.0nm的吸附剂，加入s5中滤液a，涡旋1~10min，以3000~10000r/min离心5~20 min得滤液b以及吸附后的分子筛材料；取脱附剂对吸附后分子筛进行脱吸附，进而得到原花青素三聚体溶液，而滤液b则进行s7操作，滤液b为吸附原花青素三聚体之后的混合液；s7：分子筛分离四聚体：称取1~20 g孔道为3.0~10.0nm的吸附剂，加入s6中滤液b，涡旋1~10min，以3000~10000r/min离心5~20 min得滤液c以及吸附后的分子筛材料；取脱附剂对吸附后的分子筛进行脱吸附，进而得到原花青素四聚体溶液，滤液c为原花青素高聚体溶液，平均聚合度≥5；s8：冷冻干燥：将s5~s7中原花青素二聚体、三聚体、四聚体溶液分别预冻至
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80℃，放入冷冻干燥机中，在
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40℃~-56℃中冷冻干燥 2~12h，进而得到沙棘籽粕原花青素二聚体、三聚体、四聚体粉末；s9：将沙棘籽粕原花青素二聚体、三聚体、四聚体粉末按不同比例进行复配，以提高沙棘籽原花青素的抗氧化性能。
8.进一步地，所述步骤s1中沙棘籽粕为超临界萃取沙棘籽油后，通风处避光晾干或低温干燥，并粉碎过40~80目筛后得到沙棘籽粕粉。
9.进一步地，所述步骤s2中利用超高压设备对沙棘籽粕进行前处理，其中超高压压力为30~100mpa、超高压温度为20~80℃，超高压时间为5~55min。然后采用超声辅助乙醇溶剂梯度提取，其中超声功率100~500w、加热功率100~600w；其中乙醇提取料液比为1:5~1:55（g/ml），温度为20~80℃，提取时间5~55min的条件下进行重复2~6次。乙醇溶剂为50~90%的乙醇中添加酸调节ph 1.00~6.00，其中酸可以用盐酸、磷酸、亚硫酸等无机酸以及甲酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸等有机酸；以达到在解聚中提取制备低聚原花青素的目的。
10.进一步地，所述步骤s4中减压浓缩条件为真空度0.95mpa，温度28~40℃，剩余体积为原体积的0.25~0.5。
11.进一步地，所述步骤s5中分子印迹材料为mip-p4vp/sio2，解吸溶液为 0.1~1 mol/l hcl，恒温水浴为20~30℃。
12.进一步地，所述步骤s6中分子筛为sapo-34、mcm-22、mcm-41、5
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、sapo-11等，孔道为0.3~3.0nm，脱附剂为乙醇与乙酸配比为9:1或8:2或7:3或6:4或5:5的酸性溶液。
13.进一步地，所述步骤s7中分子筛为sba-15、sba-15-4.2、al-sba-15、kit-6、10x等，孔道为3.0~9.5nm，脱附剂为乙醇与乙酸配比为9:1或8:2或7:3或6:4或5:5的酸性溶液。
14.进一步地，所述步骤s8中浓缩液要在-80℃下预冻，冷冻干燥真空度为5~20pa，温度-40℃~-50℃。
15.进一步地，所述步骤s9中通过二聚体、三聚体、四聚体的不同配比研究其抗氧化性能，比例为8:1:1或7:2:1或6:2:2或6:3:1或5:3:2或5:4:1或4:3:3或4:4:2，将不同平均聚合度的原花青素提取物复配在某些方面具有良好的促进效果。
16.与现有技术相比，本工艺取得的有益效果如下：（1）利用超高压设备对沙棘籽进行前处理，并采用梯度提取的方式制备低聚原花青素（平均聚合度《 5），提高原花青素的提取率、缩短反应时间；同时，粉碎目数、温度、时间等因素的合理选择，将进一步促进特定成分的溶出和提取效率的提高；（2）利用分子印迹和分子筛技术对原花青素进行吸附分离，有效降低其他物质对原花青素分析的干扰，具有耗时短、节省溶剂、操作简便等优势；通过改进低聚原花青素的分离方式，进一步增强原花青素低聚体的分离效果；（3）工艺过程操作简单，且不影响低聚花青素的活性，提高提取效率；（4）通过研究不同聚合度的原花青素的组合，得到二聚体的抗氧化性强于三聚体和四聚体，证明平均聚合度越低其抗氧化性越强效果更优。
具体实施方式
17.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
18.实施例 1一种从沙棘籽粕中高效制备高纯度低聚原花青素的方法，步骤如下：s1：干燥粉碎：首先将沙棘籽脱脂后，干燥粉碎过筛，得到100目沙棘籽粕粉；s2：沙棘原花青素的解聚与提取制备：利用超高压设备（60-100mpa）对沙棘籽粕进行前处理，然后在超声波辅助，ph 2.50左右的50%~90%乙醇溶液对沙棘籽粕粉进行梯度提取，重复上述步骤3次，初步得到原花青素提取液，其中利用乳酸调节ph，取沙棘籽粕粉50g，按料液比为1:15(g/ml)，加入750ml ph 2.50的乙醇溶液，超声时间12min，超声温度45℃；s3：离心分离：将提取液放入低速离心机，在4000r/min的条件下，离心15min，分离得到滤渣和滤液；s4：减压浓缩：将滤液放入真空度为 0.08mpa、温度35℃的真空旋转蒸发仪中减压回收乙醇，得到浓缩液；s5：分子印迹分离原花青素二聚体：在s4中浓缩液中，加入 1g 印迹材料，于水浴恒温振荡器中振荡吸附。待吸附达平衡后，过滤，得滤液a与吸附后的印迹材料。将吸附后的印迹材料用蒸馏水洗涤并置于水浴恒温振荡器中振荡解吸，解吸结束后，得到原花青素二聚体溶液，而滤液a将进行s6操作，滤液a为吸附原花青素二聚体的混合液；s6：分子筛分离三聚体：称取1g分子筛sapo-11，加入s5中滤液a，涡旋3min，以5000r/min离心10min得滤液b及吸附后分子筛材料；取脱附剂对吸附后的分子筛进行脱吸
附，进而得到原花青素三聚体溶液，而滤液b则进行s7操作，滤液b为吸附原花青素三聚体之后的混合液；s7：分子筛分离四聚体：称取1g的分子筛10x，加入s6中滤液b，涡旋3min，以5000r/min离心10min得滤液c及吸附后分子筛材料；取脱附剂对吸附后的分子筛进行脱吸附，进而得到原花青素四聚体溶液，滤液c为原花青素高聚体溶液，平均聚合度≥5；s8：冷冻干燥：将上述步骤s5~s7中原花青素二聚体、三聚体、四聚体溶液分别预冻至
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80℃，放入冷冻干燥机中，在
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40℃℃中冷冻干燥8h，进而得到沙棘籽粕原花青素二聚体、三聚体、四聚体粉末；s9：将沙棘籽粕原花青素二聚体、三聚体、四聚体粉末按6:3:1的比例进行配比，其dpph、abts、frap的抗氧化性分别为2.078mmol trolox/g dw、1.063mmol trolox/g dw、1.173mmol trolox/g dw。
19.实施例2一种从沙棘籽粕中高效制备高纯度低聚原花青素的方法，步骤如下：s1：干燥粉碎：首先将沙棘籽脱脂后，干燥粉碎过筛，得到60目沙棘籽粕粉；s2：沙棘原花青素的解聚与提取制备：利用超高压设备（60-100mpa）对沙棘籽粕进行前处理，然后在超声波辅助下，用ph3.55 的50%~90%乙醇溶液，对沙棘籽粕粉进行梯度提取，重复上述步骤3次，初步得到原花青素提取液，其中利用柠檬酸调节ph，取沙棘籽粕粉25g，按料液比为1:15(g/ml)，加入375ml ph3.55的乙醇溶液，超声时间28min，超声温度56℃；s3：离心分离：将提取液放入低速离心机，在4000r/min的条件下，离心15min，分离得到滤渣和滤液；s4：减压浓缩：将滤液放入真空度为 0.08mpa、温度35℃的真空旋转蒸发仪中减压回收乙醇，得到浓缩液；s5：分子印迹分离原花青素二聚体：在s4中浓缩液中，加入 1g 印迹材料，于水浴恒温振荡器中振荡吸附。待吸附达平衡后，过滤，得滤液a与吸附后的印迹材料。将吸附后的印迹材料用蒸馏水洗涤并置于水浴恒温振荡器中振荡解吸，解吸结束后，得到原花青素二聚体溶液，而滤液a将进行s6操作，滤液a为吸附原花青素二聚体的混合液；s6：分子筛分离三聚体：称取5g的分子筛sapo-34，加入s5中滤液a，涡旋6min，以8000r/min离心10 min得滤液b及吸附后分子筛材料；取脱附剂对吸附后分子筛进行脱吸附，进而得到原花青素三聚体溶液，而滤液b则进行s7操作，滤液b为吸附原花青素三聚体之后的混合液；s7：分子筛分离四聚体：称取5g的分子筛sba-15，加入s6中滤液b，涡旋8min，以3000r/min离心18 min得滤液c及吸附后分子筛材料；取脱附剂对吸附后分子筛进行脱吸附，进而得到原花青素四聚体溶液，滤液c为原花青素高聚体溶液，平均聚合度≥5；s8：冷冻干燥：将s5~s7中原花青素二聚体、三聚体、四聚体溶液分别预冻至
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80℃，放入冷冻干燥机中，在
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45℃中冷冻干燥6h，进而得到沙棘籽粕原花青素二聚体、三聚体、四聚体粉末；s9：将沙棘籽粕原花青素二聚体、三聚体、四聚体粉末按4:4:2的比例进行配比，其dpph、abts、frap的抗氧化性分别为1.460mmol trolox/g dw、0.604mmol trolox/g dw、
0.799mmol trolox/g dw。
20.对比例1一种从沙棘籽粕中高效制备高纯度低聚原花青素的方法，步骤如下：s1：干燥粉碎：首先将沙棘籽脱脂后，干燥粉碎过筛，得到100目沙棘籽粕粉；s2：沙棘原花青素的解聚与提取制备：利用超高压设备（60-100mpa）对沙棘籽粕进行前处理，然后在超声波辅助，ph 2.50左右的50%~90%乙醇溶液对沙棘籽粕粉进行梯度提取，重复上述步骤3次，初步得到原花青素提取液，其中利用乳酸调节ph，取沙棘籽粕粉50g，按料液比为1:15(g/ml)，加入750ml ph 2.50的乙醇溶液，超声时间12min，超声温度45℃；s3：离心分离：将提取液放入低速离心机，在4000r/min的条件下，离心15min，分离得到滤渣和滤液；s4：减压浓缩：将滤液放入真空度为 0.08mpa、温度35℃的真空旋转蒸发仪中减压回收乙醇，得到浓缩液；s5：吸附分离：在s4中浓缩液中，加入大孔树脂ab-8，于水浴恒温振荡器中振荡吸附，待吸附达平衡后，选择梯度的洗脱方式，以5~20%的乙醇溶液进行洗脱，然后以25~45%的乙醇溶液洗脱，最后再以50~70%的乙醇溶液洗脱，洗脱液的用量为10倍柱体积，洗脱时的流速为2bv/h；s6：将三个梯度的洗脱液分别预冻至
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80℃，放入冷冻干燥机中，在
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45℃中冷冻干燥6h，进而得到三种梯度的原花青素粉末；按6:3:1进行配比，其dpph、abts、frap的抗氧化性分别为0.884mmol trolox/g dw、0.501mmol trolox/g dw、0.561mmol trolox/g dw。
21.同实施例1的不同之处在于，采用大孔树脂ab-8对步骤s4中浓缩液进行吸附分离，选择梯度的洗脱方式，首先以5~20%的乙醇溶液进行洗脱，然后以25~45%的乙醇溶液洗脱，最后再以50~70%的乙醇溶液洗脱；洗脱液的用量为10倍柱体积，洗脱时的流速为2bv/h；其dpph、abts、frap的抗氧化性有明显的降低。
22.对比例2一种从沙棘籽粕中高效制备高纯度低聚原花青素的方法，步骤如下：s1：干燥粉碎：首先将沙棘籽脱脂后，干燥粉碎过筛，得到60目沙棘籽粕粉；s2：沙棘原花青素的解聚与提取制备：利用超高压设备（60-100mpa）对沙棘籽粕进行前处理，然后在超声波辅助下，用ph3.55 的50%~90%乙醇溶液，对沙棘籽粕粉进行梯度提取，重复上述步骤3次，初步得到原花青素提取液，其中利用柠檬酸调节ph，取沙棘籽粕粉25g，按料液比为1:15(g/ml)，加入375ml ph3.55的乙醇溶液，超声时间28min，超声温度56℃；s3：离心分离：将提取液放入低速离心机，在4000r/min的条件下，离心15min，分离得到滤渣和滤液；s4：减压浓缩：将滤液放入真空度为 0.08mpa、温度35℃的真空旋转蒸发仪中减压回收乙醇，得到浓缩液；s5：吸附分离原花青素：在s4中浓缩液中，加入大孔树脂d101，于水浴恒温振荡器中振荡吸附，待吸附达平衡后，选择梯度的洗脱方式，首先以5~20%的乙醇溶液进行洗脱，然后以25~45%的乙醇溶液洗脱，最后再以50~70%的乙醇溶液洗脱。洗脱液的用量为10倍柱体积，洗脱时的流速为2bv/h；
s6：将三个梯度的洗脱液分别预冻至
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80℃，放入冷冻干燥机中，在
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45℃中冷冻干燥6h，进而得到三种梯度的原花青素粉末。按4:4:2进行配比，其dpph、abts、frap的抗氧化性分别为0.608mmol trolox/g dw、0.233mmol trolox/g dw、0.435mmol trolox/g dw。
23.同实施例2的不同之处在于，采用大孔树脂d101对步骤s4中浓缩液进行吸附分离，选择梯度的洗脱方式，首先以5~20%的乙醇溶液进行洗脱，然后以25~45%的乙醇溶液洗脱，最后再以50~70%的乙醇溶液洗脱。洗脱液的用量为10倍柱体积，洗脱时的流速为2bv/h，其dpph、abts、frap的抗氧化性分明显降低。