筑波链霉菌sclx0001及其在发酵生产他克莫司中的应用
技术领域
1.本发明涉及一株筑波链霉菌及其在发酵生产他克莫司中的应用。属于微生物发酵技术领域。


背景技术：

2.他克莫司，又名fk506，作为一种新型的大环内脂类免疫抑制剂，以其免疫抑制活性强、肾毒性小等优势广泛应用于临床治疗，可有效减少急性应激排斥反应，提高肾脏移植的成功率和肾脏功能，并在整个免疫抑制类药物市场中占有重要地位。在发现他克莫司之前，临床上常用环孢素a（csa）作为免疫抑制剂来治疗器官移植后的排斥反应。csa也是一种can抑制剂，免疫抑制机制与他克莫司类似，但他克莫司的作用效果是csa的100倍左右，且临床优势更多。目前，全世界范围内由于肝病、肾病等原因需要移植器官的患者数量逐年增加。中国每年需要器官移植的患者人数大概约有30万人。
3.fk506（tacrolimus，他克莫司）是从链霉菌属（streptomyces）中分离出的发酵产物，它是一种很有效的 23 元大环内酯类新型免疫抑制剂。许多链霉菌如streptomycestsukubaensis， streptomycestacrolimicus， streptomyces sp. atcc 53770 ， streptomyces sp. ma6949， streptomyceskanamyceticus kcc-s0436 ，streptomyces glaucescens，streptomyces clavuligerus ckd1119 等都可生产 fk506。它的分子式是 c
44h69
no
12
，相对分子质量为 804.02，fk506化学结构式如下所示。
4.fk506在常温下为无色晶体，难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂。熔点为 127~129℃，在不同贮存条件下稳定性都较高。
5.在fk506生物合成过程中，依据其21号碳位r基团的不同，还存在两种结构十分相近的类似物，即fk520(子囊霉素)和fk506d(双氢他克莫司)。上述两种副产物对进一步提升fk506产量造成了困难。目前fk506的产量普遍很低，严重限制了它的医学应用和工业化生产，尽管已有科学家从菌种筛选发酵过程控制方面优化fk506的生产，但对fk506的高产机
制缺乏理解，都存在成本高、周期长、操作复杂、效果不明显和不易进行工业化放大等缺点，fk506工业上生产水平仍低于市场需求。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一株高产他克莫司的筑波链霉菌sclx0001及其应用，为进一步提高他克莫司的产量提供支撑。
7.本发明解决上述问题的技术方案如下：筑波链霉菌（streptomyces tsuknbaenis）sclx0001，保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏日期2021年10月21日，保藏编号：cctcc no:m 20211303，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072。
8.本发明的另外一个目的是提供上述筑波链霉菌sclx0001在发酵生产他克莫司中的应用。
9.本发明的还一个目的是提供上述筑波链霉菌sclx0001在发酵生产他克莫司中的方法。
10.利用上述筑波链霉菌scl0001发酵生产他克莫司的方法，包括以下步骤：将筑波链霉菌sclx0001接种至发酵培养基，在28~32℃、500~700 rpm下发酵培养120~250 h，获得含有他克莫司的发酵液，然后将发酵液分离纯化，获得他克莫司。
11.作为上述技术方案的优选，通气量4~8 l/min、罐压0.04~0.06 mpa，发酵过程中，通过控制搅拌转速和通气量使罐内溶氧保持在20%~30%。
12.作为上述技术方案的优选，所述初始发酵培养基组成为：淀粉50~70 g/l，糊精25~50 g/l，葡萄糖5~15 g/l，酵母粉15~20 g/l，蛋白胨1~3 g/l，（nh4）2so
4 1~2 g/l，mgso
2 0.5~1 g/l，caco
3 4~8 g/l，溶剂为水，ph 6.8~7.2。
13.作为上述技术方案的优选，所述初始发酵培养基组成为：淀粉50~60 g/l，糊精30~50 g/l，葡萄糖7~15 g/l，酵母粉15~20 g/l，蛋白胨1~2 g/l，（nh4）2so
4 1~1.5 g/l，mgso
2 0.5~0.8 g/l，caco
3 5~8 g/l，溶剂为水，ph 6.8~7.2；且115℃灭菌30min。
14.作为上述技术方案的优选，所述初始培养基组成为：淀粉60 g/l，糊精40 g/l，葡萄糖12 g/l，酵母粉20 g/l，蛋白胨3 g/l，（nh4）2so
4 2 g/l，mgso
2 1 g/l，caco
3 8 g/l，溶剂为水，ph 7.0。
15.与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明选择用筑波链霉菌作为出发菌株进行诱变获得高产菌株，筑波链霉菌sclx0001合成他克莫司能力强，诱变出发菌株摇瓶发酵产量为50mg/l，经过多轮诱变后，最终获得他克莫司高产筑波链霉菌，摇瓶发酵产量为127.3 mg/l，产量提高154%。在5l的发酵罐上进行优化过后，产量达到174.8 mg/l，相比摇瓶发酵提高了37.3%。通过此方法能够筛选出高产他克莫司的筑波链霉菌，能够缓解目前工业生产他克莫司产量低的问题。
具体实施方式
16.为了使本技术领域的人员更好地理解本技术中的技术方案，下面将结合本技术具体实施例，对本技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。只要在权利要求的范围内，都将受到专利法的保
护。
17.实施例1：一、出发菌株的筛选（1）初筛：将单菌落接到种子液中，培养48h后菌液用生理盐水稀释10、102、103、104和105倍体积后，均匀涂布在含有30μg/ml 2、5-二硝基苯甲酸的gym固体培养基中，28℃培养3~4天，观察菌落颜色，表面结构特征，筑波链霉菌菌落呈圆形突起，表面像花瓣，颜色呈现出红色，将其进行发酵培养，在28℃下培养6~8天所得菌株发酵后经液相检测他克莫司产量，筛选出高产他克莫司筑波链霉菌。gym固体培养基组成：麦芽提取物10 g/l，葡萄糖4 g/l，酵母提取物4 g/l，琼脂粉20 g/l，碳酸钙2 g/l，溶剂为水，ph 7.0。
18.（2）复筛：将步骤（1）中筛出的筑波链霉菌菌株接至种子液培养基，28℃培养48 h，获得种子液：将种子液以体积浓度5%的接种量接种至装有50 ml初始发酵培养基的500 ml摇瓶中，28℃、200 rpm摇床中培养168 h，获得发酵液。利用hplc法测定他克莫司产量，进一步挑取出产量高的筑波链霉菌菌株。
19.初始发酵培养基组成：淀粉60 g/l，糊精40 g/l，葡萄糖12 g/l，酵母粉20 g/l，蛋白胨3 g/l，（nh4）2so
4 2 g/l，mgso
2 1 g/l，caco
3 8 g/l，溶剂为水（蒸馏水或自来水），ph 7.0。
20.（3）他克莫司产量的测定：采用hplc法测定，取步骤（2）1ml发酵液，按发酵液：甲醇=1:1的体积比混合，在50℃下震荡2.5h，6000rpm离心10min，取上清用0.22μm有机过滤膜后通过高效液相色谱（hplc）检测他克莫司峰面积，根据他克莫司标准曲线，获得他克莫司浓度，挑选出他克莫司产量高的作为筑波链霉菌出发菌株，产量127.3 mg/l。
21.他克莫司标准曲线：取他克莫司标品，溶于甲醇，配制成不同浓度的标品溶液（25mg/l、50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l），采用hplc检测。以峰面积为纵坐标，他克莫司浓度（mg/l）为横坐标，绘制标准曲线。
22.hplc具体测定条件如下：色谱柱为c18柱（250 x 4.6mm，5μm），流动相：纯乙腈：含0.1%磷酸的水溶液=65:35；检测柱温：60℃，检测流速：0.9ml/min，进样量10μl，色谱保留时间25min，检测波长为210nm。他克莫司的出峰时间为22.5min。
23.二、筛选高产他克莫司的筑波链霉菌菌株对实施例1筑波链霉菌出发菌株进行紫外诱变处理，涂布至平板，培养3-4天，得诱变处理突变株，具体方法如下：1、以 600μg/ml 2、5-二硝基苯甲酸作为抗性筛选剂（1）将上述筛选的筑波链霉菌的出发菌株，接种至活化培养基，28℃培养 2~3d，获得筑波链霉菌活化菌株；挑取单菌落接种至种子培养基中，28℃培养48h，获得种子液。所述活化培养基组成为：麦芽提取物10g/l，葡萄糖4g/l，酵母提取物4g/l，琼脂粉20g/l，碳酸钙2g/l，溶剂为水，ph7.0。种子培养基组成为：甘油25 g/l，淀粉10 g/l，葡萄糖1.5 g/l，酵母提取物10 g/l，caco31 g/l，溶剂为水，ph 7.0。
24.（2）将紫外诱变仪器（uv8ac18h 赛百奥）操作室用酒精棉擦拭，18w 紫外照射30min灭菌。吸取1ml 步骤（1）种子液置于洁净无菌平皿中，放置在紫外诱变操作台，18w紫外照射60s，将处理后的菌液涂布在抗性培养基上，30 ℃培养 3-4 d。所述抗性培养基终浓度组成：麦芽提取物10 g/l，葡萄糖4 g/l，酵母提取物4 g/l，琼脂粉20 g/l，碳酸钙2 g/l，
溶剂为水，ph7.0。2、5-二硝基苯甲酸600 μg/ml，溶剂为水，ph 值自然。
25.（3）在步骤（2）抗性平板中挑取较大的诱变菌株单菌落，接种至种子培养基中，28 ℃培养48 h，获得诱变菌株种子液；种子培养基组成为：甘油25 g/l，淀粉10 g/l，葡萄糖1.5 g/l，酵母提取物10 g/l，caco31 g/l，溶剂为水，ph 7.0。
26.（4）将步骤（3）诱变菌株种子液以体积浓度5%的接种量接种至50 ml初始发酵培养基，在转速200 rpm/min、28 ℃发酵培养168 h；初始发酵培养基组成：淀粉60 g/l，糊精40 g/l，葡萄糖12 g/l，酵母粉20 g/l，蛋白胨3 g/l，（nh4）2so
4 2 g/l，mgso
2 1 g/l，caco
3 8 g/l，溶剂为水（蒸馏水或自来水），ph 7.0。
27.（5）取1ml步骤（4）发酵液，按发酵液：甲醇=1:1的体积比混合，在50℃震荡2.5 h，6000 rpm离心10 min，取上清用0.22 μm有机过滤膜后，滤液采用高效液相检测，获得他克莫司浓度；从100株突变株中挑取他克莫司产量最高的菌株，得到了突变菌株s0101，他克莫司的产量为55.2 mg/l。
28.他克莫司标准曲线：取他克莫司标品，溶于甲醇，配制成不同浓度的标品溶液（25mg/l、50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l），采用hplc检测。以峰面积为纵坐标，他克莫司浓度（mg/l）为横坐标，绘制标准曲线。
29.hplc具体测定条件如下：色谱柱为c18柱（250 x 4.6mm，5μm），流动相：纯乙腈：含0.1%磷酸的水溶液=65:35；检测柱温：60℃，检测流速：0.9ml/min，进样量10μl，色谱保留时间25min，检测波长为210nm。他克莫司的出峰时间为22.5min。
30.（6）突变菌株s0101进行多轮诱变将步骤（5）获得的菌株s0101重复步骤（1）-步骤（5）操作，筛选得到突变株s0210，他克莫司产量为61.1mg/l；将突变株s0210重复步骤（1）-步骤（5）操作，筛选得到突变株s0314，他克莫司产量为63.1mg/l；将突变株s0314重复步骤（1）-步骤（5），筛选得到突变株s0407，他克莫司产量为68.8mg/l，将突变株s0407重复步骤（1）-步骤（5）操作，筛选得到突变株s0520，他克莫司产量为72.4mg/l；将突变株s0520重复步骤（1）-步骤（5），筛选得到突变株s0632，他克莫司产量为76.9mg/l。
31.2、以300μg/ml链霉素作为抗性筛选剂将步骤（2）抗性培养基中的2、5-二硝基苯甲酸替换为300μg/ml链霉素，将步骤（6）中突变株s0632重复步骤（1）-步骤（5）操作，筛选得到突变株s0701，他克莫司产量为86.9mg/l；将突变株s0701重复步骤（1）-步骤（5），筛选得到突变株s0802，他克莫司产量为93.4mg/l；将突变株s0802重复步骤（1）-步骤（5），筛选得到突变株s0910，他克莫司产量为105.4mg/l；将突变株s0910重复步骤（1）-步骤（5），筛选得到突变株sclx0001（即cctcc no:m 20211303），他克莫司产量为130.3mg/l（这个不能小于前面提高的127.3）。
32.3、高产菌株稳定性检测通过诱变筛选得到的菌株由于人为引起的菌株遗传性能的改变，在传代培养过程中菌株通过自身修复能力可能导致菌种出现退化的现象。本实验为了避免菌种退化情况的出现，对筛选到的高产菌株sclx0001进行连续10代培养并进行他克莫司产量的检测。经过连续10代传代培养，菌株sclx0001在传代过程中，从第1代到第3代他克莫司产量在130.1 mg/l左右，第4代和第6代产量约为129.2 mg/l，第7代到第8代产量在128.4 mg/l左右，第9代到第10代产量约为127.3 mg/l。经过后续的传代培养实验，菌株sclx0001产他克莫司能
力稳定。
33.三、他克莫司筑波链霉菌sclx0001在5l发酵罐中的生产（1）将上述诱变的筑波链霉菌sclx0001菌种接种至活化培养基，28℃培养3-4天，获得筑波链霉菌活化菌株；所述活化培养基组成为：麦芽提取物10g/l，葡萄糖4g/l，酵母提取物4g/l，琼脂粉20g/l，碳酸钙2g/l，溶剂为水，ph7.0。种子培养基组成为：甘油25 g/l，淀粉10 g/l，葡萄糖1.5 g/l，酵母提取物10 g/l，caco31 g/l，溶剂为水，ph 7.0。
34.（2）挑取步骤（1）单菌落接种至种子培养基中，28℃培养48h，获得种子液。种子培养基组成为：甘油25 g/l，淀粉10 g/l，葡萄糖1.5 g/l，酵母提取物10 g/l，caco31 g/l，溶剂为水，ph 7.0。
35.（3）将种子液以体积浓度10%的接种量接种装有2l发酵培养基的5l发酵罐中，控制发酵罐内温度28℃、ph7.0、搅拌转速400-600rpm/min、通气量4-8l/min，罐压0.05mpa，发酵过程中通过在发酵24h后，补加2 g/l的赖氨酸和组氨酸。发酵过程中，每隔12h取样测定他克莫司产量和生物干重，结果（表1）显示，发酵培养168h，他克莫司产量最高，为174.8 mg/l。
36.发酵培养基组成：淀粉60 g/l，糊精40 g/l，葡萄糖12 g/l，酵母粉20 g/l，蛋白胨3 g/l，（nh4）2so
4 2 g/l，mgso
2 1 g/l，caco
3 8 g/l，赖氨酸 2 g/l，组氨酸2 g/l，溶剂为水（蒸馏水或自来水），ph 7.0、115℃灭菌30min。
37.表1：不同发酵时间下他克莫司产量和生物干重