1.本发明属于恩拉霉素工程菌技术领域，具体涉及一种高产恩拉霉素的杀真菌素链霉菌工程菌及其在恩拉霉素合成领域的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.链霉菌是放线菌中的一个重要的属，它产生大多数已知抗生素及其他生物活性物质，自然界约70％的抗生素是由链霉菌及其近缘放线菌产生的。恩拉霉素(enramycin)是链霉菌分泌一种由不饱和脂肪酸与十几种氨基酸结合的多肽类抗生素。其抗菌作用机理是抑制细菌细胞壁的合成。细菌细胞壁主要是维持外形、保持渗透压稳定，其主要成分为粘肽，在革兰氏阳性菌，粘肽占细胞壁总量65％～95％。恩拉霉素能阻止粘肽的合成，使细胞壁缺损，导致细胞内渗透压升高，细胞外液渗入菌体，使细菌变形肿大，破裂而死亡。主要作用于细菌的裂殖阶段，不仅杀菌，而且溶菌。主要成分为恩拉霉素a和恩拉霉素b，还含有少量的恩拉霉素c和d。恩拉霉素对革兰氏阳性菌有良好的抗菌作用，特别是对肠内的有害梭状芽孢杆菌抑制力很强。因其能起到良好的促生长作用，目前作为词料添加剂使用于畜禽养殖业。
4.由于恩拉霉素独特的优点，成为新型抗生素的重要来源，具有广阔的市场前景。为了获得满足工业生产应用的菌株，本领域将杀真菌素链霉菌(streptomyces fungicidicus)作为出发菌株构建了恩拉霉素高产的突变体，但目前提供的突变体恩拉霉素产量提高程度有限，通常无法超过20％。并且野生型杀真菌素链霉菌的发酵周期较长，限制了将杀真菌素链霉菌作为工程菌的生产应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种恩拉霉素产量高的杀真菌素链霉菌菌株，通过基因工程手段来提高杀真菌素链霉菌恩拉霉素产量，实现提高恩拉霉素产量及缩短培养周期的目的。
6.发明人的在先研究中，提供了一种密码子优化后的血红蛋白基因vgbl，该基因在杀真菌素链霉菌中表达能够提高恩拉霉素的产能。本发明进一步的研究中，针对上述突变体开展了进一步的基因修饰，包括对上述vgbl序列的优化获得vgbl-f2(如seq idno:1所示)，制备了一种杀真菌素链霉菌vgbl-f2突变株，相比优化前进一步提高了恩拉霉素的产能。另外，本发明还尝试改善突变菌株的链霉素抗性，从而增加降低阳性转染菌株的筛选难度。通过在上述杀真菌素链霉菌vgbl-f2突变株中导入b基因(seq idno:2所示)构建了一种vgbl-f2-b突变菌株，经测定，该vgbl-f2-b突变菌株在链霉素抗性具有一定的提高，并且发酵周期显著缩短，菌株稳定性更好。
7.基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：
8.本发明第一方面，提供一种高产恩拉霉素的杀真菌素链霉菌工程菌，所述工程菌与野生型菌株相比，具有增强的透明颤菌血红蛋白表达，所述透明颤菌血红蛋白与seq idno:3所示氨基酸序列具有85％以上的相似性。
9.应当明确的是，本发明第一方面所述透明颤菌血红蛋白为本发明进一步优化后的氨基酸序列，所述相似性包括seq idno:3所示氨基酸序列增添、缺失或替换后还具有相同或相似生理活性的序列。进一步优选的方案中，所述相似性为90％以上，更进一步的，为95％以上。
10.本发明效果较好的一种实施方式中，所述透明颤菌血红蛋白具有seq idno:3所示的氨基酸序列。
11.进一步的，本发明还提供用于编码seq idno:3所示的氨基酸序列的核苷酸序列。所述核苷酸序列包括由于密码子简并性能够翻译得到上述氨基酸序列的核苷酸序列。所述编码核酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。
12.一种具体的实施方式中，所述核苷酸序列如seq id no:1所示(vgbl-f2)。
13.本发明第一方面又一种优选的实施方式中，所述工程菌与野生型相比，具有增强的b蛋白表达，所述b蛋白与seq idno:4所述氨基酸序列具有85％以上的相似性。
14.进一步的，所述相似性为90％以上，更进一步的，为95％以上，具体的实例如96％、97％或98％。效果较好的一种实施方式中，所述b蛋白具有seq idno:4所述的氨基酸序列。
15.b蛋白位于杀真菌素链霉菌p染色体，经本发明研究证实，在链霉菌中对b蛋白进行过表达能够辅助提高恩拉霉素的产量，并且过表达b蛋白能够有效提高突变株的链霉素抗性。
16.对应的，本发明还提供编码b蛋白的核苷酸序列，优选的实施方式中，所述核苷酸序列如seq id no:2所示。第一方面优选的一种实施方式中，所述高产恩拉霉素的杀真菌素链霉菌工程菌中，同时具有增强的透明颤菌血红蛋白表达及b蛋白表达。
17.另外，本发明第一方面的工程菌，所述出发菌株还可以为其他链霉菌属的菌株，为包括但不限于天蓝色链霉菌、变铅青链霉菌、阿维链霉菌、灰色链霉菌、红色糖多孢菌或珍贵橙色束丝放线菌中的一种。
18.本发明第二方面，提供一种表达框，所述表达框包括seq idno:1和/或seq idno:2所示的氨基酸序列。
19.本发明第三方面，提供一种重组载体，所述重组载体中含有第二方面所述表达框。
20.优选的，所述重组载体具体实例包括：本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
21.本发明第四方面，提供一种提高杀真菌素链霉菌中恩拉霉素产量的试剂盒，所述试剂盒中包括第二方面所述的表达框和/或第三方面所述的重组载体。
22.本发明第五方面，提供一种恩拉霉素的生产方法，所述生产方法包括采用第一方面所述高产恩拉霉素的杀真菌素链霉菌工程菌进行发酵。
23.以上一个或多个技术方案的有益效果是：
24.本发明以杀真菌素链霉菌(streptomyces fungicidicus)作为出发菌株，构建一种vgbl-f2-b突变菌株，经测定，该vgbl-f2-b突变菌株恩拉霉素产能显著提高，相比野生型提高了70％左右，并且该菌株生长速度快，发酵周期短，应用于工业生产对于提高恩拉霉素的产能具有重要意义。
附图说明
25.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
26.图1是本发明的基因改造方法流程图。
27.图2是实施例1中所述链霉菌vgbl-f2-b株的生长曲线。
具体实施方式
28.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
29.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
30.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。以下实施例中所述基因合成、引物设计、插入载体及测序验证由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
31.实施例1
32.1、构建vgbl-f2过表达杀真菌素链霉菌菌株
33.本实施例针对杀真菌素链霉菌(streptomyces coelicolor)的vgbl基因进行了优化获得vgbl-f2(核苷酸序列如seq idno:1)所示，将合成后的vgbl-f2的dna片段插入pib139载体，获得pib139-vgbl-f2。
34.杀真菌素链霉菌的培养：
35.取3ml两级培养后的tsb的杀真菌素链霉菌atcc21013菌丝体接种于30ml的tsb-0.5％甘氨酸培养基中，30℃，200r/min摇瓶培养48h左右收集菌液，10000rpm，4℃离心10min，弃上清获得菌体。
36.用20ml 10.3％的蔗糖溶液吹打洗涤一次，10000rpm，4℃离心10min，弃上清；加入10ml的改进p缓冲液吹打洗涤，10000rpm，4℃离心10min，弃上清。重新加入10ml改进p缓冲液充分悬浮菌体，再加入300ul溶菌酶(50mg/ml)使其终浓度为1.5mg/ml，温和吹打混合后置30℃水浴锅中保温约40min，吹吸2-3次，镜检观察菌体酶解状况，酶解较为完全即可；将酶解后的菌液转移到已灭菌处理的孢子过滤器，过滤两次，滤液即已去除细胞壁的原生质体，将滤液在室温下3800rpm离心7min。
37.加入适量的改进p缓冲液缓温和吹吸重悬原生质体，然后将其分装到无菌离心管
(50μl/管)中，-70℃中冻存。
38.杀真菌素链霉菌原生质体的转化：向50ul杀真菌素链霉菌原生质体中添加50μl纯化回收后的vgbl-f2 dna片段稍微混匀，立即加入200μl peg-t缓冲液；缓慢吹吸充分混合后，转化液均匀涂布于无抗的r3m平板上。在30℃的恒温培养箱中培养约24h，加入含抗生素(thio的终浓度为30μg/ml,apr的终浓度为125μg/ml)的无菌水进行筛选，30s℃恒温培养箱中培养3-5d。
39.转化子筛选与验证：把含硫连丝菌素抗性的转化子挑取至含r3m硫链丝菌素抗性平板上进行划线培养，30℃恒温培养3d，挑取菌体生长连续抗性强的转化子，接种至5ml含thio的tsb液体培养基中进行进一步培养2-3d。收集1ml菌体，去离子水洗涤，最后重悬于400ul ddh2o中，微波法提取基因组(中火微波1min，离心，留存含基因组的上清)，获得重组vgbl-f2基因的杀真菌素链霉菌命名为杀真菌素链霉菌vgbl-f2。
40.2、vgbl-f2-b突变菌株的构建
41.以上述杀真菌素链霉菌vgbl-f2作为出发菌株，以b基因(seq idno:2所示)为模板扩增获得基因序列插入pib139载体，获得pib139-vgbl-f2-b。将重组载体转入杀真菌素链霉菌vgbl-f2中，通过抗性筛选获得vgbl-f2-b突变菌株。
42.二、性能测定
43.1、恩拉霉素产量测定
44.将过表达vgbl的链霉菌f25-vgbl(专利cn110106191a中制备)、上述杀真菌素链霉菌vgbl-f2、杀真菌素链霉菌vgbl-f2-b株的斜面孢子配制成107/ml，按照10％的接种接种至种子培养基中进行发酵培养，30℃、转速200r/min，发酵12d。分别于第3d、第6d和第12天通过hplc测定发酵瓶中恩拉霉素的产量。测定方法如下：
45.取2ml发酵液，加入18ml预先配制好的甲醇浸提液(甲醇:2m盐酸:水＝20:1:21)，使用超声波震荡40分钟后，离心，取上清液，经过的滤膜过滤后，注射到hplc系统中。
46.色谱柱：c
18
反向色谱柱,4.6
×
150mm，φ＝5μm。
47.流速：1.0ml/min。
48.检测波长：267nm。
49.流动相乙腈:50mm磷酸二氢钠＝3:7，ph4.5，使用磷酸调节值。
50.根据分析得到各组分面积，计算改造后菌株发酵液中的恩拉霉素产量。
51.表1野生型和突变株杀真菌素链霉菌的恩拉霉素产量
[0052][0053]
从上述摇瓶发酵结果来看，导入优化后基因片段的突变菌株在恩拉霉素产量方面具有显著的提升效果。链霉菌vgbl-f2、链霉菌vgbl-f2-b相比野生型的产量提升分别达到
了65.5％、71.5％，显著超过优化前的技术方案。其中，链霉菌vgbl-f2-b突变株具有较快的生长速度(生长曲线如附图2所示)，在第6天发酵时恩拉霉素浓度已经能够达到49.4mg/l，证明该突变株具有更快的发酵速度，能够有效缩短发酵周期。
[0054]
2、链霉素抗性测定
[0055]
制备2-32μg/ml系列浓度的链霉素抗性浓度梯度培养基，将将野生型、链霉菌f25-vgbl、链霉菌vgbl-f2、链霉菌vgbl-f2-b株孢子涂布于培养上，30℃培养7d。
[0056]
表2野生型及突变型菌株抗性测定效果
[0057][0058][0059]
上述抗性测定结果中，野生型链霉菌在2μg/ml浓度环境中能够较为良好的生长，但是在4μg/ml的浓度下已无法生长。实施例1中优化后的突变株在链霉素抗性方面相比优化前的突变株都具有显著的提升，其中，链霉菌vgbl-f2-b在18μg/ml浓度下依然能够良好生长，抗性相比野生型提高了近十倍之多。
[0060]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。