一株卡特拉链霉菌yy-2s及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，涉及一种卡特拉链霉菌，具体地说，涉及一株对多种植物病原菌具有广谱抗性的卡特拉链霉菌yy-2s的分离鉴定及其在促进花生生长和防治花生致病真菌上的应用。


背景技术：

2.花生病害的逐年增加严重影响花生的品质和产量，在整个生育期花生会受到多种病原菌的危害，病害严重威胁花生生产，导致花生减产20％以上。花生上的病原菌以真菌为主，包括白绢病、菌核病等花生土传性真菌病害，以及网斑病、花生轮斑病等花生叶部病害，这些病害严重影响花生的健康生产，导致全球粮食作物和经济作物的严重损失。
3.目前病害的防治方法主要为化学防治，然而长期使用化学农药严重影响土壤结构、生态平衡和人畜安全，在此背景下，花生病害生物防治方面的研究越来越多，尤其是高效拮抗生防菌的筛选与应用成为研究的热点。
4.其中，链霉菌广泛存在于自然环境中，很多链霉菌种类能够产生生物活性物质，是一类具有极大应用价值的微生物资源。链霉菌可以产生多种对植物病原菌具有拮抗效果的次级代谢产物，将其制备成活细胞菌剂，可用于防治由多种真菌引起的病害，如镰刀菌、丝核菌等引起的病害，具有较好的应用前景。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一株卡特拉链霉菌yy-2s及其应用，该菌株yy-2s能够促进花生的生长，同时能够作为生防菌株应用在防治花生病害上，具有无毒、无残留、环境友好、防病持效期长等优点。
6.本发明的技术方案是：
7.本发明提出了一株卡特拉链霉菌yy-2s，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23530。
8.进一步的，其16s rdna的核苷酸序列如seq id no：1所示。
9.本发明还提供了卡特拉链霉菌yy-2s在防治花生真菌病害中的应用。
10.进一步的，所述花生真菌病害包括白绢病、菌核病、网斑病和轮斑病，所述花生致病真菌包括白绢病菌、核盘菌、网斑病菌和轮斑病菌。
11.本发明提供了卡特拉链霉菌yy-2s制备的生防菌剂，所述生防菌剂的活性成分包括卡特拉链霉菌yy-2s菌悬液、无菌发酵液或挥发性气体中的任一种。
12.本发明还提供了卡特拉链霉菌yy-2s在促进花生生长上的应用。
13.进一步的，菌株yy-2s在促进花生生长上的应用方式为采用菌株yy-2s的有菌发酵液灌根。
14.生物材料样品保藏信息：
15.卡特拉链霉菌(streptomyces katrae)yy-2s，保藏于中国微生物菌种保藏管理委
员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2021年09月30日，保藏编号为cgmcc no.23530。
16.本发明的有益效果：
17.本发明所提供的卡特拉链霉菌yy-2s，能够促进花生的生长；将其应用于花生病害的防治上，摒弃了化学农药在防治花生病害方面的种种弊端，提高了花生对白绢病、菌核病、网斑病和轮斑病的抗性，同时其作为生防菌株，还具有无毒、无残留、环境友好、防病持效期长等优点。
18.本发明采用卡特拉链霉菌yy-2s防治花生真菌病害，安全有效，防治效果显著，有利于花生的绿色健康生产，提高了经济效益。该方法属于生物防治的范畴，安全、快速、有效，有利于花生的绿色健康生产，为花生病害的综合防治提供技术支撑。
附图说明
19.图1为菌株yy-2s在lb培养基上的菌落形态示意图；
20.图2为菌株yy-2s基于16s rdna构建的系统发育树；
21.图3为菌株yy-2s菌悬液对4种病原菌的拮抗作用结果分析；
22.图4为菌株yy-2s发酵液对4种病原菌抑菌能力的测定结果分析；
23.图5为菌株yy-2s挥发性气体对4种病原菌抑菌能力的测定结果分析；
24.图6为菌株yy-2s次级代谢产物胞外酶的情况；
25.图7为菌株yy-2s有菌发酵液对花生生长的影响。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.为了进一步理解本发明，将结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
28.实施例1 卡特拉链霉菌yy-2s的分离鉴定
29.(1)菌株yy-2s的分离：
30.于公园中的野蒜根际周围，称取距离地表5～10cm深处的土壤样品约100g，带回实验室，4℃保存。取土壤样品10g加到90ml无菌水中，28℃，140rpm振荡15min，静置5min，取上清液，采用10倍系列稀释法，依次稀释到10-2
、10-3
、10-4
和10-5
，每个浓度吸取100μl 分别涂于lb固体培养基上，每个浓度重复3次，28℃暗培养。待培养基上出现细菌菌落时，喷施花生冠腐病菌(a.niger)孢子悬浮液。培养2d后，选取周围出现明显抑菌圈的菌落，用移菌环挑取单菌落，在lb固体培养基上进行纯化培养。我们挑选了一株抑菌圈明显且菌落较小的菌株，菌体呈淡黄色，边缘整齐，表面湿润，不透明，如图1所示，命名为yy-2s。菌株yy-2s单菌落用lb液体培养基摇菌后，加入甘油，于-80℃保存。
31.(2)卡特拉链霉菌yy-2s的菌种鉴定：
32.根据提取细菌基因组的试剂盒“transgenbacteria genomic dnakit”提取 yy-2s的基因组dna。分别利用16s rdna通用引物27f(5’agagtttgatcmtggctcag 3’)
(seq id no：2)和16s-r(5’aaggaggtgatccagccgca 3’)(seq id no：3)对菌株yy-2s的基因组进行pcr扩增。pcr产物送北京擎科生物科技有限公司测序。16s rdna 序列全长为1401bp，序列如seq id no：1所示。
33.所获得的序列提交到genbank数据库进行blast分析比对，根据16s rdna序列用 mega6.06软件构建系统发育树，如图2所示。结果表明菌株yy-2s与卡特拉链霉菌 streptomyces katrae在同一分支上，16s rdna序列相似性分别达到99.50％，说明菌株yy-2s 为卡特拉链霉菌。菌株yy-2s保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23530。
34.实施例2菌株yy-2s菌悬液对4种花生病原菌菌丝生长的抑制作用
35.菌悬液制备：将菌株yy-2s的单菌落放入液体lb培养基中，28℃振荡培养2d，静置5 min，弃大部分上清。
36.病原菌的活化：分别取花生白绢病菌、核盘菌、网斑病菌和轮斑病菌的菌饼接种到pda 培养基中央，25℃暗培养7d，备用。
37.lb固体培养基中央接种直径为5mm的病原菌的菌饼，菌饼两侧约20mm处用yy-2s 的菌悬液划2组粗壮的平行线，以不接种菌悬液作为对照，每个处理重复6次，25℃恒温培养。对菌丝生长情况进行测量，采用菌丝生长速率法计算抑菌率。抑菌率(％)＝(对照菌落增长直径－处理菌落增长直径)/对照菌落增长直径
×
100。
38.结果发现菌株yy-2s对四种病原菌均具有显著的抑菌效果，如图3所示，a为yy-2s对 4种花生病原菌的拮抗效果图；b为病原菌的菌落生长情况统计(注：**差异在0.01水平差异极显著)；c为yy-2s对4种花生病原菌的抑菌率统计，yy-2s对白绢病菌、核盘菌、网斑病菌和轮斑病菌的菌丝生长抑制率分别为82.84％、96.42％、79.75％、75.14％。
39.实施例3菌株yy-2s无菌发酵液对4种花生病原菌菌丝生长的抑制作用
40.用牙签挑取菌株yy-2s的单菌落放入盛有100ml液体lb培养基的三角瓶中，28℃振荡培养4d，高速离心后收集上清液，用0.22um滤膜过滤得到无菌发酵液。将无菌发酵液以1:10 的比例与加热冷却至约50℃的lb固体培养基混合倒平板，在平板中央接入直径为5mm病原菌的菌饼，以添加等量lb液体培养基的平板作为对照，每个处理设6个重复，25℃培养，对菌丝生长情况进行测量，计算抑菌率。结果如图4所示，与相应对照相比，菌株yy-2s的无菌发酵液极显著的降低了白绢病菌、核盘菌、网斑病菌和轮斑病菌菌丝的生长，图4中， a为yy-2s对4种花生病原菌的拮抗效果；b为4种病原菌的菌落生长情况统计(注：**差异在0.01水平差异极显著)；c为yy-2s对4种花生病原菌的抑菌率统计，菌丝生长抑制率分别为18.77％、85.56％、18.81％和25.46％。
41.实施例4菌株yy-2s挥发性气体对4种花生病原菌菌丝生长的抑制作用
42.采用双皿对扣法测定挥发性气体的抑菌活性。用牙签蘸取菌株yy-2s的菌悬液，于lb 平板上均匀划线，另一lb平板中央接入直径为5mm病原菌的菌饼。以空白lb平板作为对照，，每个处理设6个重复，对菌丝生长情况进行测量，计算抑菌率。结果如图5所示，菌株 yy-2s的挥发性气体极显著的降低了白绢病菌、核盘菌、网斑病菌和轮斑病菌菌丝的生长，图5中，a为yy-2s挥发性气体对4种花生病原菌的拮抗效果；b为4种病原菌的菌落生长情况统计(注：**差异在0.01水平差异极显著)；c为yy-2s对4种花生病原菌的抑菌率统计，菌丝生长抑制率分别为62.02％、89.31％、69.72％和16.14％。
43.实施例5菌株yy-2s次级代谢产物胞外酶的产生情况
44.取10μl yy-2s菌悬液分别接种于蛋白酶培养基、纤维素酶和淀粉酶培养基培养基平板， 28℃，培养，观察有无透明圈，每个处理3个重复。通过选择性培养基测定了yy-2s胞外酶的活性，结果如图6显示，yy-2s在3种选择性培养基上均能产生降解圈，但是在淀粉酶培养基上的降解圈最大，说明该菌株能够产生蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶，其中淀粉酶活性较高。由此推断，yy-2s可能通过产生蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等水解酶降解病原菌的细胞壁，从而抑制病原菌菌丝的生长。
45.实施例6菌株yy-2s有菌发酵液对花生生长的影响
46.花生品种晋花10号播种于花盆中，2周后用菌株yy-2s的有菌发酵液灌根(2ml/株)， 4周后再次用yy-2s的有菌发酵液灌根，以接种等量lb培养基为对照。对照和处理各3盆，重复3次，8周后处理花生，称量植株总鲜质量，烘干后称量植株总干质量。结果统计发现，如图7所示，同对照相比，菌株yy-2s的有菌发酵液能够极显著增加晋花10号植株的鲜质量和干质量，比对照分别增加24.17％和30.64％(图中**表示在p《0.01水平下，差异极显著)。
47.上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。