1.本发明涉及微生物领域与医药领域，更具体地， 涉及一株可以产细菌素的冻盐晶嗜冷杆菌，所述冻盐晶嗜冷杆菌的发酵方法，细菌素提取方法及其应用，适用于食品防腐剂、饲用生物添加剂领域。
背景技术：
2.随着人民生活水平的提高和对营养健康需求的不断提升，对新鲜果蔬的需求越来越旺盛。为了满足上述实际需求，新鲜果蔬在采摘后经过筛选、清洗及切片等处理后成为鲜切果蔬,是一种轻度加工的产品越来越受到广大消费者的欢迎和喜爱。这种即食型果蔬虽然迎合了健康饮食的消费者理念,但加工处理过程中产品极易受污染,为通过食品传播的病原菌和腐败菌提供了良好的生长条件。为延长鲜切果蔬产品货架期,目前唯一的手段就是对于低温保藏环境的保证。但是在这个过程中，很多病原菌可以在冷冻储藏温度下、酸性ph及高含盐量(达10%)的环境中生存、繁殖,从而严重威胁人类的健康。免疫力低弱人群(如婴幼儿、孕妇及老年人)易感染上述致病菌后其临床症状表现包括败血症、脑膜炎、晚期流产,严重时甚至可引起死亡。
3.为了解决上述问题，很多生产厂家在新鲜果蔬的冷藏处理过程中添加大量的抗生素，但是但是近年来，由于抗菌药物的广泛使用，滥用抗菌药物现象日趋严重，致使目前常见致病菌对各种抗菌药物的耐药性问题愈发严重，常见的多数致病菌均出现了程度不同的多重耐药性，并且已经出现了无药可用的超级细菌。目前新药的研发速度已经跟不上细菌产生耐药性的速度。细菌对抗生素的耐药性是全世界健康领域急需解决的主要问题之一，因此，寻找具有广泛来源、安全高效、可广泛应用等特点的新型抗生素替代品迫在眉睫。
4.细菌素是细菌在生长代谢过程中产生的一类天然大分子蛋白或小分子短肽，由其细胞内的核蛋白体合成并分泌到细菌细胞外的具有抗菌活性的蛋白质或肽类物质，可以抑制或妨碍某些微生物的生长且不易产生抗药性，对人体或动物体不产生致病作用。同时，细菌素不同于抗生素，属于蛋白质类物质，可以被一些酶类降解，具有安全、高效、无残留等多重优势。然而，已有的产细菌素细菌存在菌种资源有限、抑菌特性差、抑菌适用条件较单一等问题。而且由于目前大多数研究仅关注乳杆菌属(lactobacillus)和芽孢杆菌属(bacillus)的产细菌素细菌，对于其他类群的产细菌素细菌关注较少，而且筛选到的能分泌细菌素的菌株多属于在常温环境或者次高温（》40℃）条件下才能高效发酵生物素实现抗菌效果的菌株，在对果蔬的冷藏保存（一般为低于10℃，甚至低于4℃）中难以发挥有效地抗菌作用。由于上述技术上局限性，阻碍了人们对产细菌素细菌资源的挖掘和认识。
技术实现要素：
5.本发明提供了一株冻盐晶嗜冷杆菌及其在蔬菜冷藏保鲜中的应用。
6.本发明所述的冻盐晶嗜冷杆菌为冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4，分离于本技术单位的果蔬冷库中。
7.发明冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4的筛选方法为：取自本公司蔬菜冷藏冷库样品(温度4℃)，在2～10℃、150rpm/min下富集12～20d，期间不断补充培养基，待菌液的od600值达到0.5以上后，梯度稀释并接种于固体培养基上，在2～10℃下培养5～7d，选取典型的单一菌落进行纯化培养。再接种到液体培养基中进行常规培养，分离发酵上清液细菌素的粗提物验证对常见的大肠杆菌、单增李斯特菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌的生长抑制作用，筛选到一株抑菌活性最强，抑菌圈直径最大的菌株进行进一步的筛选和分离。通过形态学标准和16s rdna序列扩增，将获得片段用于测序，确定与嗜冷菌模式菌株psychrobacter cryohalolentis k5t的相似性为99.8％，鉴定为嗜冷菌psychrobacter cryohalolentis，最终命名为psychrobacter cryohalolentis sdwf2-4，并进一步对其进行生物保藏，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年2月19日，保藏编号为cgmcc no.20830。
8.进一步的，本发明所述的冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4可以发酵制备细菌素，本发明的嗜冷菌所产细菌素具有明显的抗菌活性，抑菌谱宽，热稳定性好，可以耐低温，耐酸碱能力强，ph适应范围广。
9.进一步的，本发明公开了所述细菌素的发酵方法为：将实施例1中筛选保藏的单菌落出发，挑取该菌单个菌落接种于lb培养基内，分别于5-25℃震荡培养4-24h，将培养液离心，除去菌体，保留上清液，用氢氧化钠上清液调至与蒸馏水ph值一致，然后经0.22 μm滤膜过滤后备用；将过滤后的清液置于烧杯中，加入充分研磨后的硫酸铵，反应后静置透析，获得冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4细菌素粗提液，将粗提液干燥后加入不同的复配剂制备成抑菌剂，分装待用。
10.进一步的，本发明提供利用所述的冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4或者上述细菌素提取方法得到的细菌素制备得到的抑菌剂。
11.所述抑菌剂能够抑制革兰阳性菌和革兰阴性菌。具体地，可抑制单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌、大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、宋内志贺氏菌、都柏林沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、粪肠球菌。
12.实验证明，本发明中的抑菌剂本身无毒，所产细菌素具有明显的抗菌活 性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等抑制效果较好，抑菌谱较宽，热稳定 性较好，耐酸碱能力强，可以用于饲料添加剂、食品抑菌剂等，具有进一步开发利用的前景。
13.进一步的，所述的抑菌剂中的有效成分主要为前述的冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4、发酵制备的细菌素、或其组合物。优选地，所述抑菌剂还可以包括相配合的其他特定病原菌的抑制剂。
14.可选地，上述抑菌剂的剂型可以为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂、冻干剂。
15.可选地，所述抑菌剂中还包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述药物组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂和口服剂
型(例如，水性溶液、悬浮液和乳液、丸剂、胶囊、粒剂)和其他中间剂型，如冻干剂。
16.进一步的，本发明提供冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4、细菌素、抑菌剂在蔬菜冷藏保鲜中的应用。
17.有益效果本发明的冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4具有耐低温的特性，由于其可以在低温环境下发酵产生具有广谱抗菌活性的细菌素，而可以直接应用在低温食品冷藏领域中，增加了其适用范围。除了对果蔬的储藏提供帮助外，还可以对储藏环境，储藏装置等进行致病病原菌的消毒和抑制，具有更广泛的应用前景。
18.本发明的冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4所产细菌素具有明显的抗菌活性，抑菌谱宽，热稳定性好，可以耐低温，耐酸碱能力强，ph适应范围广。本发明涉及的冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4及其细菌素都是从自然界中获得，易于进行工业化生产，由上述冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4或者细菌素制备的药物或消毒剂不仅可降低成本；而且无需考虑药物残留问题，能够作为一种具有安全、高效生物消毒剂和药物进行广泛应用。
附图说明
19.图1为冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4的菌落示意图。
20.图2为本发明冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4的pcr扩增结果。
具体实施方式
21.下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这 里阐述的实施方式所限制。
22.实施例1冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4的筛选取自本公司蔬菜冷藏冷库中长期储藏但并没有出现霉变或者腐坏的果蔬样品(温度4℃)，于超净工作台上利用无菌水对其进行表面冲洗，在10℃、150rpm/min下富集20d，期间不断补充lb培养基，待菌液的od600值达到0.5以上后，梯度稀释并接种于固体培养基上，在10℃下培养6d，选取典型的单一菌落进行纯化培养。
23.其中，由于筛选靶标菌未知，因此使用4种本领域内常见的筛选培养基，分别为：lb 营养培养基，乳酸细菌培养基(lactic acid bacteria culture medium，mrs)，牛肉膏蛋白胨培养基(beef extract peptonemedium，na)，哥伦比亚血琼脂培养基(columbia blood agar medium，ca)。
24.将获得的单菌落培养液以1%的接种量接种于装液量为200ml的无菌锥形瓶中，于10℃、150r/min恒温摇床培养24h，利用对应细菌筛选液体培养基将其菌液稀释至1.0
×
106cfu/ml，取稀释液4℃、12000r/min离心10min，弃沉淀、收集上清。通过0.22μm的微孔滤膜去除菌体细胞，得到不同菌株的无细胞培养液(无菌体发酵液)，密封放置于4℃冰箱中备用。
25.利用本领域常用的牛津杯双层平板法筛选，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌2 种病原指示菌株有拮抗作用的产细菌素细菌进行初选，通过观察有无透明抑菌圈确定候选菌株。然后筛选出的候选菌株进一步进行大肠杆菌、单增李斯特菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、白边青霉的生长抑制试验。用游标卡尺准确测量并记录抑菌圈直径，具有抑菌
效果的菌株确定为产细菌素细菌，进行下游实验。以等量的各菌株对应高温灭活的无细胞培养液作为对照。然后，对初选获得的产细菌素细菌再进行3 次独立重复实验，以进一步通过复选确认其抑菌效果。
26.最终筛选到一株抑菌活性最强，抑菌圈直径最大的菌株（见表1），并对其进行进一步的形态学验证和分子生物学验证。
27.表1嗜冷菌sdwf2-4抑菌性能的试验结果指示菌抑菌圈直径/mm单核细胞增生李斯特菌32.57金黄色葡萄球菌27.58肠出血性大肠杆菌17.21大肠埃希氏菌19.28伤寒沙门氏菌15.24铜绿假单胞菌24.10阪崎肠杆菌9.97宋内志贺氏菌11.20都柏林沙门氏菌9.53痢疾志贺氏菌19.28粪肠球菌25.12点青霉13.25扩展青霉14.29米曲霉9.98黑曲霉12.87黑根霉16.47植物乳杆菌-弯曲乳杆菌-由表中的数据可以明显看出，本技术所筛选到的这种抑菌菌株的发酵上清液对单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌和痢疾志贺氏菌等细菌，及其点青霉、扩展青霉、米曲霉、黑曲霉和黑根霉等数种常见食品腐败霉菌都有显著的生长抑制作用，而且对冷藏食品中常见的致病菌都有明显的抑制作用，可以广泛的应用在抑菌领域。
28.进一步的研究发现，该菌株的形态学特性为：该菌为革兰阳性链状杆菌，短杆或近球状，无鞭毛，不产芽孢，单个或呈链状排列；该菌种能在lb琼脂培养基上生长，菌落呈乳白色，圆形，规则，中央凸起，表面光滑，质地均匀（见图1），而且在挑取菌体时有一定的黏性；它能利用葡萄糖、蔗糖、甘露糖、半乳糖、乳糖和麦芽糖，不能利用鼠李糖、棉籽糖、阿拉伯糖，吲哚形成和甲基红试验和vp试验均为阴性。该菌的最适生长温度为10～20℃，能在4℃生长，兼性厌氧，在ph值2～10生长，最适ph值6.0左右。
29.通过形态学标准和16s rdna序列扩增（图2），将获得片段用于测序，确定与嗜冷菌模式菌株psychrobacter cryohalolentis k5t的相似性为99.8％，鉴定为嗜冷菌psychrobacter cryohalolentis，最终命名为psychrobacter cryohalolentis sdwf2-4，
并进一步对其进行生物保藏，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年2月19日，保藏编号为cgmcc no.20830。
30.实施例2冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4发酵制备细菌素将实施例1中筛选保藏的单菌落出发，挑取该菌单个菌落接种于lb培养基内，分别于5-25℃震荡培养4-24h，将培养液离心，除去菌体，保留上清液，用氢氧化钠上清液调至与蒸馏水ph值一致，然后经0.22 μm滤膜过滤后备用；将过滤后的清液置于烧杯中，加入充分研磨后的硫酸铵，反应后静置透析，获得冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4细菌素粗提液，将粗提液干燥后加入不同的复配剂制备成抑菌剂，分装待用。
31.利用本领域常用的牛津杯双层平板法筛选，以金黄色葡萄球菌作为指示物筛选最优发酵参数，最终确定最优参数为：细菌培养：挑取该菌单个菌落接种于lb培养基内，15℃震荡培养18h，将培养液8000 r
∙
min-1
的速度离心10 min，除去菌体，保留上清液；如有必要，可以进行多级扩大培养，实现大规模培养；细菌素的纯化和分离：用氢氧化钠将上清液调至ph中性，然后经0.22 μm滤膜过滤后备用；将过滤后的清液置于1000ml烧杯中，按饱和度75％称取研磨后的硫酸铵，用玻璃棒缓慢匀同向搅拌，边搅拌边加入硫酸铵，整个添加过程需要保证在20分钟以上，以保证添加速度和沉淀充分，于4℃冰箱中静置过夜，用去离子水按发酵液1/5体积的量复溶沉淀。分装入截留分子量为3000d的预处理透析袋中，4℃去离子水透析48h，透析物即得冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4细菌素粗提液。
32.包装：将上述粗体物冷冻干燥后制备成独立包装。
33.实施例3细菌素的性质检测将实施例2所获得的细菌素粗提液分装后进行如下实验：（1）热稳定性检测将上述分装的粗体液分别于5℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，水浴中作用20min、40min、60min，每个温度设两个平行组。采用双层平板法以金黄色葡萄球菌为指示菌测定细菌素的抑菌活性。
34.结果可见细菌素在5-60℃范围内都具有一定的活性，但是活性有高有低，具体而言，在20-30℃的活性最强，5℃、10℃、40℃和50℃作用1h后基本保持原活性，可以实现抑菌活性的稳定保持；60℃作用下会有效果的减弱，20min处理后开始下降，至1h后下降明显，但是仍然保持一定的抑菌活性；在70℃及80℃的高温作用下，抑菌活性下降明显，这主要是因为细菌素为一种蛋白多肽的混合物，在温度升高的情况下可能会发生蛋白失活，从而降低了其生物活性。试验结果说明本发明冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4细菌素的热稳定性很好，可以提供在5-60℃范围内的生物活性，可以耐受相对较高高温和相对较低的低温环境。
35.(2) ph稳定性检测取无菌试管中加入不同ph值(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14)的lb培养基5ml，各三支，置于37℃的水浴锅中，待温度稳定之后，各加入500μ上述实施例获取的冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4细菌素，混匀30℃水浴作用1h、2h、3h。作用结束之后，向混合液中加入适量的hcl或者naoh使混合液的ph值约为7，采用双层平板法以金黄色葡萄球菌为指示菌测定
细菌素的抑菌活性。
36.结果可见在ph3-12范围内冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4细菌素的抑菌活性几乎没变，而且随着处理时间的加长也并没有显著的降低，但是在ph为2或者13等较强的酸碱条件下，处理一段时间后发现抑菌活性有显著的下降，甚至明显失活，完全丧失抑菌活性，可见该噬菌体对ph的适应范围较广，可以耐受ph3-12的较宽范围，但是不适应于极端酸碱条件。
37.实施例4 冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4细菌素的果蔬保藏模拟试验普通丰水梨，从市场买回，挑取无病、无虫和无伤且成熟度色泽一致的丰水梨按照市场包装方式进行保鲜。分设10个组，每组30个果，各组按表1所示处理，贮存3个月，期间测定其失重率、总糖、总酸、维生素c(vc)、硬度和可溶性固形物的含量等理化指标，每隔10d测一次，每次测两个果。记录其色泽、气味、肉质、口感等感官指标，以及腐烂率、好果率等。
38.表1各组处理方法
组别处理方式具体配制方法1阴性对照大豆蛋白5％，羧甲基纤维素钠1％，氯化钙2％，海藻糖2%，余量为蒸馏水。2冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4发酵菌体干燥物实施例2中的方法发酵菌体，活菌数达2
×
10
11
cfu/ml之后直接离心后冷冻干燥。菌体干燥物30%，大豆蛋白5％，羧甲基纤维素钠1％，氯化钙2％，海藻糖2%，余量为蒸馏水。3冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4发酵菌体干燥物如组2，菌体干燥物60%。4冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4发酵细菌素实施例2中的方法发酵菌体，活菌数达2
×
10
11
cfu/ml之后按照所述分离方法获得细菌素，直接离心后冷冻干燥。细菌素干燥物10%，大豆蛋白5％，羧甲基纤维素钠1％，氯化钙2％，海藻糖2%，余量为蒸馏水。5冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4发酵细菌素如组4，细菌素干燥物30%。
从失重率记录表（表2）可知，随着时间的变化，梨的失重率越来越大。与阴性对照相比，处理组的效果要明显好于阴性对照组，其中，第5组的效果最好，失重率要明显低于其他组别，在时间上可以延迟相当于10天以上，甚至在后期可以实现延长30d以上保鲜期的效果，而且从外观看，梨较饱满，口感脆度较好，色泽较好，显著增加保藏期和货架期。第3组与第4组的效果次之，但是两者相差不大，可以看出对发酵物进行细菌素的粗提可以有效的提升对水果的保鲜效果。虽然第2组的效果较上述三种较差，有部分果皮失水皱缩，感官较差，口感脆度下降，但是相较于阴性对照，也可以有显著的提升。
39.表2 梨失重率（%）记录表组别10d20d30d40d50d60d70d80d90d平均值11.92.53.85.97.99.410.812.714.27.6821.22.12.94.46.98.39.21112.46.49311.52.44.35.57.28.29.810.25.5740.91.62.34.15.26.989.910.45.4750.41.123.14.76.27.78.39.54.78由表3可知，总糖含量随着时间的变化有曲折下降的趋势。3-5组变化幅度较对照组及其他组较小，较平稳。且用药组总糖含量较大，说明无论是菌体还是细菌素都在一定程度上抑制了梨的呼吸强度，减缓了淀粉转化为糖的速度。各组在储藏后期达到较大值，推测可能是贮存温度在4℃左右，呼吸跃变时间较晚，第60-70d，甚至是第80d才产生呼吸跃变，
糖含量在呼吸跃变之后又呈下降趋势。
40.表3 总糖含量组别10d20d30d40d50d60d70d80d90d平均值15.588.956.433.419.147.125.353.414.986.0426.125.198.426.844.18.498.26.013.286.2935.935.268.077.254.258.018.577.266.576.846.285.347.817.054.958.268.178.497.257.0756.415.27.926.985.028.148.28.67.347.09从第90d的感官评价中（表4）可知，从色泽看，第4，5，6组即乳酸菌、芽孢菌、酵母菌组较好，都表现为鲜黄色，而第1、2、3和8组色泽较差，呈现暗黄色，色泽暗淡无光，果皮褐变较严重；从好果率看，贮藏100d后，第4组乳酸菌组最高，为100％，硬度较硬，果肉脆度较好，果皮未发生皱缩现象。第9组果皮色泽次之，果肉脆度较好，但随着时贮存时间的延长，果实发病率较高，尤其是蒂腐病发病率较高。整体比较0、4、5组色泽、手感最好；9组次之；2、6较好；3、7、8、1果皮褐变严重，手感较软。
41.表4感官评价
组别色泽烂果率（%）好果率（90d）果皮外观口感1暗黄19.880.23.41大量黑斑，出现明显的褶皱，肉眼明显可见果肉发黄，变透明，果肉变软，尤其在果蒂处更为明显发面，不脆，而且有明显的发酸2明黄3.396.76.84个别黑色斑点，果皮较新鲜水果有差别，但不明显，果体较硬，较新鲜水果没有明显的改观较脆，但是水分不足，没有水头3鲜黄01007.25有个别果有个别斑点，果皮较新鲜水果无差别，果体较硬脆生，有水头4鲜黄01007.05几乎无斑点，果皮较新鲜水果无差别，果体较硬脆生，有水头5鲜黄01006.98无斑点，果皮较新鲜水果无差别，果体较硬脆生，有水头
综上所述，从梨的保鲜试验结果知：无论是冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4还是其发酵制备的细菌素对梨的vc含量、果肉硬度、水分含量及脆度都具有一定的保护作用，而且效果与所使用的量有直接关系，但是具体的使用方法和使用量需要进一步的研究进行验证，同时可以与其他的抑菌剂或者保鲜剂联用，预期可以取得更好的技术效果。而且上述产品都可以显著抑制梨的腐烂及防治果皮的褐变，抑制梨的失重率，保持采后梨的品质和风味，处理后对果实原有风味未产生任何不良影响，并可减少梨的总酸的消耗。 由上述结果可以得出，利用本技术的冻盐晶嗜冷杆菌sdwf2-4还是其发酵制备的细菌素进行生物防治保鲜，不但可以防治果皮褐变，且降低果实发病率，又可以适当减少果实水分挥发，抑制梨的新陈代谢，延长梨的保鲜期。
42.以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽 性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更 都是显而易见的。