型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒的方法。现如今，单独检测这两种病毒的常用方法包括酶联免疫吸附试验、间接血凝抑制试验、血清中和试验、免疫荧光技术、琼脂扩散试验以及rt-pcr技术等，而这些技术不仅难以支持快速鉴别乙脑病毒和盖他病毒及区分乙脑病毒基因型，而且存在操作复杂、时间长、成本高、敏感性差等缺点。因此我们开发了一种可快速、灵敏、准确的鉴别基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的基于taqman探针的多重rt-qpcr检测技术，这将使这两种病毒的快速检测、临床诊断以及流行病学调查等的效率大大提高，对乙脑病毒和盖他病毒的防控具有重要意义。
5.基于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.为克服临床上缺少对基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒鉴别的方法，本发明提供一种基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的鉴别方法以及引物和探针，该方法利用rt-qpcr的方法定量检测基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒，并包括四组特异性强、重复性好、灵敏度高的引物和探针。其可以有效鉴别乙脑病毒和盖他病毒，具有较高特异性和灵敏度的优点，可以为乙脑病毒和盖他病毒基因型的快速检测、临床诊断以及流行病学调查提供更好的方法支持。
7.为实现以上目的，本发明采用的技术方案是：
8.一种鉴别基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的方法，其是通过设计基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的引物对和taqman探针进行的多重rt-qpcr进行检测，其包括基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的taqman探针，其中基因ⅰ型的taqman探针jev-g1-p的核酸序列如seq id no:1所示，基因ⅲ型的taqman探针jev-g3-p的核酸序列如seq id no:2所示；基因
ⅴ
型的taqman探针jev-g5-p的核酸序列如seq id no:3所示；盖他病毒的taqman探针getv-p的核酸序列如seq id no:4所示。
9.所述的基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的taqman探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团，每种病毒使用不同的荧光信号进行区别，其中用于检测基因ⅰ型乙脑病毒的探针的报告荧光基团为fam；检测基因ⅲ型乙脑病毒的探针的报告荧光基团为vic；检测基因
ⅴ
型乙脑病毒的探针的报告荧光基团为cy5；检测盖他病毒的探针的报告荧光基团为hex，所述的淬灭荧光基团均为bhq-1。
10.如上所述的鉴别基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的方法，其包括基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的pcr扩增引物对，基因ⅰ型和ⅲ型乙脑病毒共用一对pcr扩增引物对，其中正向引物jev-g1/3-f序列如seq id no：5所示，反向引物jev-g1/3-r序列如seq id no：6所示；基因
ⅴ
型乙脑病毒的引物对中正向引物jev-g5-f序列如seq id no：7所示，反向引物jev-g5-r序列如seq id no：8所示；盖他病毒的引物对中正向引物getv-f序列如seq id no：9所示，反向引物getv-r序列如seq id no：10所示。
11.如上所述的鉴别基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的方法，是以本发明的引物和taqman探针进行的多重rt-qpcr检测方法。其具体包括下述步骤：
12.多重rt-qpcr检测反应体系及反应程序的确定：配置rt-qpcr反应体系，该方法的反应体系包括基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的正向引物各0.4μl、基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的反向引物各0.4μl、基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病
毒的taqman探针各0.4μl、样本2μl、taqman mix 10μl和无rna酶水4μl；其反应程序如下：95℃1min；95℃40s，60℃20s，40个循环。在每个循环结束时收集荧光信号。
13.2)按照步骤1)的多重rt-qpcr检测反应体系及反应程序对阳性对照病毒质粒分别绘制基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒检测的标准曲线；
14.3)按照步骤1)的多重rt-qpcr检测反应体系及反应程序对待测样本进行鉴定，并按照如下判定标准判定样本是否为阳性，根据样本扩增曲线判定病毒种类。
15.上述方法中，结果判定标准如下：ct值＞35或无数值的样品为阴性；各通道ct值≤30且出现典型扩增曲线的样本为阳性；30＜ct值＜35的样本进行重做，重做ct值为none为阴性，否则为阳性。
16.进一步，上述检测方法的质控标准如下：(1)阴性对照的ct值应为none；(2)阳性对照出现典型的扩增曲线；(3)阳性对照的ct值应≤30，否则此实验视为无效；应同时满足上述3项条件，否则试验无效。
17.进一步的，使用本发明构建的多重rt-qpcr反应方法绘制基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒检测的标准曲线。其中病毒检测的标准曲线的制作方法为：构建含有基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒prm/m基因保守区以及盖他病毒e2基因保守区的重组质粒，分别为pmd-jev-gⅰ、pmd-jev-gⅲ、pmd-jev-g
ⅴ
和pmd-getv；以此为标准品，测量其浓度并依据公式计算拷贝数，而后分别进行10倍倍比稀释得到10
10
～100copies/μl的标准品；各取2μl作为反应模板，进行rt-qpcr反应，得到用于检测基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的标准曲线。
18.本发明还请求保护一种用于鉴别基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的试剂盒，其包括：
19.a)基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的正向引物各0.4μl；
20.b)基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的反向引物各0.4μl；
21.c)基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的taqman探针各0.4μl、
22.d)taqman mix 10μl
23.e)无rna酶水4μl。
24.上述所述的用于鉴别基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的试剂盒的使用方法，将试剂盒中组分混合配置rt-qpcr反应体系，活体取样后进行处理后得到待测样本，取待测样本2μl加入到rt-qpcr反应体系中，按照反应程序95℃1min；95℃40s，60℃20s，40个循环；在每个循环结束时收集荧光信号；按照如下判定标准对样本进行判断：ct值＞35或无数值的样品为阴性；各通道ct值≤30且出现典型扩增曲线的样本为阳性。
25.对本发明构建的多重rt-qpcr反应方法进行特异性和重复性试验，实验结果证明本发明中检测基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的4对引物探针具有良好的特异性，与其他病原没有交叉反应，且彼此间也没有交叉反应；具有良好的重复性和较高的稳定性。
26.本发明可以实现在实时荧光pcr仪上进行基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的快速检测，并可通过不同的荧光信号对这几种病毒样品进行鉴别，在能够快速得到准确结果的同时，还能减少传统样品检测的工作量，真正实现便捷、快速、灵敏、准确。
附图说明
27.图1为基因ⅰ型乙脑病毒标准品拷贝数与扩增循环ct值的标准曲线。
28.图2为基因ⅲ型乙脑病毒标准品拷贝数与扩增循环ct值的标准曲线。
29.图3为基因
ⅴ
型乙脑病毒标准品拷贝数与扩增循环ct值的标准曲线。
30.图4为盖他病毒标准品拷贝数与扩增循环ct值的标准曲线。
31.图5不同病毒的多重rt-qpcr特异性试验扩增曲线。
具体实施方式
32.下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但下述实施方式并不以任何方式限定本发明专利保护范围。
33.实施例1引物和探针的设计
34.(1)设计引物和探针根据拟研究病毒基因名称基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒，在genebank中找到相应的全基因序列，运用dnastar软件进行同源性分析，分别在基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒的prm/m基因和盖他病毒的e2基因的保守区设计引物和探针。对设计好的引物和探针序列进行blast序列分析，证明这4组引物和探针均具有高保守性和高特异性，可以用于本发明对基因ⅰ型、ⅲ型、
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型乙脑病毒和盖他病毒的检测。
35.(2)选择荧光素使用仪器为美国biorad公司的cfx96 real-time system，检测基因ⅰ型乙脑病毒的探针的报告荧光基团为fam；检测基因ⅲ型乙脑病毒的探针的报告荧光基团为vic；检测基因
ⅴ
型乙脑病毒的探针的报告荧光基团为cy5；检测盖他病毒的探针的报告荧光基团为hex。淬灭基团均为bhq-1，每种病毒使用不同的荧光信号进行区别。
36.(3)引物及探针由擎科生物(上海)合成。稀释到10μm/l的工作液，稀释所用水为无rna酶水，4℃冰箱避光保存。
37.实施例2质粒标准品的制备
38.本发明采用基因合成方式合成并提取阳性质粒样品，合成基因为引物设计过程中筛选出的高保守区前后分别延长50～70bp的片段，将合成产物克隆至pmd-19-t载体，得到的基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒质粒分别命名为pmd-jev-gⅰ、pmd-jev-gⅲ、pmd-jev-g
ⅴ
和pmd-getv。
39.实施例3绘制标准曲线
40.根据双链dna拷贝数的计算公式“拷贝数浓度(copies/μl)＝6
×
10
23
×
dna浓度(ng/μl)
×
10-9
/660
×
目的基因碱基数”，并以及实施例2中得到的几种病毒原液的浓度，计算得到基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒阳性质粒原液的dna拷贝数分别为3.17
×
10
11
copies/μl、2.30
×
10
11
copies/μl、4.79
×
10
11
copies/μl、6.29
×
10
11
copies/μl。使用无rna酶水分别进行10倍倍比稀释最终得到10
10
～100copies/μl的质粒标准品。
41.将10倍稀释好的pmd-jev-gⅰ、pmd-jev-gⅲ、pmd-jev-g
ⅴ
和pmd-getv质粒dna标准品作为模板，以seq id no：1～10分别为检测基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的引物和探针进行rt-qpcr反应，建立标准曲线。
42.标准品检测的反应体系如下：20μl体系中，上下游引物及探针各0.4μl；2
×
taqman mix 10μl；阳性样品2μl；无rna酶水4μl。反应程序如下：95℃1min；以下参数循环40次：95℃40s、60℃采集荧光20s。
43.根据所得ct值与其对应标准品拷贝数的对数值分别绘制基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型乙脑病毒和盖他病毒的标准曲线，如图1～4，其标准曲线的r2均为0.999，表明该方法的可信度较高。其中图1为基因ⅰ型乙脑病毒标准品拷贝数与扩增循环ct值的标准曲线；图2为基因ⅲ型乙脑病毒标准品拷贝数与扩增循环ct值的标准曲线；图3为基因
ⅴ
型乙脑病毒标准品拷贝数与扩增循环ct值的标准曲线；图4为盖他病毒标准品拷贝数与扩增循环ct值的标准曲线。
44.实施例4特异性试验
45.为验证建立的多重rt-qpcr方法的几对引物和探针的特异性，用建立的方法对基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型的乙脑病毒(jev)、盖他病毒(getv)、经典猪瘟病毒(csfv)、蓝耳病毒(prrsv)、非洲猪瘟病毒(asfv)、猪细小病毒(ppv)、猪伪狂犬病毒(prv)等毒株进行同时检测。不同病毒的多重rt-qpcr特异性试验扩增曲线。
46.上述实验结果表明，利用本发明所设计的基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型的乙脑病毒和盖他病毒的检测引物和探针与其他病毒之间无交叉反应，且因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型的乙脑病毒和盖他病毒彼此之间也无交叉反应，说明本发明构建的检测方法特异性高。
47.实施例5重复性试验
48.乙脑病毒和盖他病毒多重rt-qpcr检测方法的重复性试验为：对jpmd-jev-gⅰ、pmd-jev-gⅲ、pmd-jev-g
ⅴ
和pmd-getv阳性质粒分别进行10倍稀释，各取2μl作为模板，采用上述多重rt-qpcr反应体系进行荧光定量pcr检测。每份样品重复平行试验3次，计算变异系数(cv)。重复性分析结果见表1。基因ⅰ型、ⅲ型、
ⅴ
型的乙脑病毒和盖他病毒的重复测定其变异系数cv值分别小于1.5％、5.4％、5.2％和1.3％，说明本发明所建立的多重rt-qpcr方法重复性良好，具有较高稳定性。
49.表1：重复性试验结果
50.