一种维吉霉素m1的核酸适配体及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种维吉霉素m1的核酸适配体及其制备方法与应用。


背景技术：

2.维吉霉素m1(viginiamycin m1)属于抗生素，常被用于兽药和饲料中以预防动物疾病。抗生素作为禽饲料添加剂在动物体内的残留可通过动物可食组织进入人体，进而危害人类的健康，我国严格规定了此类药物的最高残留限量。目前，对viginiamycin m1常用的检测方法有酶联免疫法及色谱法。色谱法是使用最广泛的一种检测方法，此方法灵敏高、重现性好，但是仪器昂贵，操作繁琐。免疫法的缺点则表现为操作过程繁琐耗时，得到的抗体存在批次差异，也不够稳定。因此，需要开发成本低、特异性高、灵敏度好的检测方法。
3.基于适配体(aptamer)的检测是一种新的检测技术，因操作简单、高灵敏度化、小型化、容易自动化等优点，已广泛应用于细胞生理学、药物筛选及靶向、食品安全检测、疾病诊断等领域。适配体是从随机寡核苷酸文库中通过配体指数富集系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，selex)的体外进化过程筛选出的功能性单链dna或rna片段。适配体被视为“化学抗体”，通过标准方法化学合成，能够识别具有高亲合力和特异性的目标，类似于抗体，但优于抗体，如具有更高的亲和力与特异性，无免疫原性，能够化学合成，成本低，可进行标记我，稳定性好等优点。毛细管电泳-配体指数富集的系统进化技术(capillary electrophoresis-systematic evolution of ligand by exponential enrichment，ce-selex)被认为是一种更有效的适配体筛选方法，与传统的selex相比，具有高效、高灵敏度和更低成本的优点，还可以直接用来测定亲合常数，有助于监测每一轮选择中ssdna的富集程度。


技术实现要素：

4.本发明第一方面的目的，在于提供一种维吉霉素m1的核酸适配体。
5.本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体的筛选方法。
6.本发明第三方面的目的，在于提供一种维吉霉素m1的核酸适配体衍生物。
7.本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体或本发明第三方面的维吉霉素m1的核酸适配体衍生物在制备维吉霉素m1传感器中的应用。
8.本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体或本发明第三方面的维吉霉素m1的核酸适配体衍生物在制备维吉霉素m1检测试剂中的应用。
9.本发明第六方面的目的，在于提供本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体或本发明第三方面的维吉霉素m1的核酸适配体衍生物在制备维吉霉素m1检测试剂盒中的应用。
10.本发明第七方面的目的，在于提供本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体或
本发明第三方面的维吉霉素m1的核酸适配体衍生物在检测维吉霉素m1中的应用。
11.本发明第八方面的目的，在于提供本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体或本发明第三方面的维吉霉素m1的核酸适配体衍生物在分离与纯化维吉霉素m1中的应用。
12.本发明第九方面的目的，在于提供一种维吉霉素m1的检测方法。
13.本发明第十方面的目的，在于提供一种维吉霉素m1检测试剂盒。
14.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
15.本发明的第一个方面，提供维吉霉素m1的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.10中任一条序列所示。
16.优选地，所述核酸适配体的核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.4中任一条序列所示。
17.进一步优选地，所述核酸适配体的核苷酸序列如seq id no.1所示。
18.优选地，所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、巯基化、氟化或同位素化。
19.优选地，所述核酸适配体的两端任选地进行氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修饰。
20.以上不论是经部分取代还是经过修饰后的核苷酸序列，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可用于与维吉霉素m1特异性的结合。
21.本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：将初始ssdna文库与维吉霉素m1混合，孵育，分离得到与维吉霉素m1结合的ssdna文库，测序，即得到维吉霉素m1的核酸适配体；所述ssdna文库为5'gtctatatgatctgtaactc n
40 ccagcagtgagtcatcagat 3'，所述n
40
指40个不同碱基，所述碱基为a、t、c和g中任一碱基。
22.优选地，所述初始ssdna文库与维吉霉素m1混合前用水溶解。
23.进一步优选地，所述初始ssdna文库溶液的浓度为2～5μmol/l。
24.优选地，对所述初始ssdna文库溶液进行变性和冷却处理。
25.进一步优选地，所述变性的条件为90～95℃变性10～15min。
26.进一步优选地，所述冷却的条件为以0.5℃/s缓慢冷却至25℃。
27.优选地，所述维吉霉素m1与初始ssdna文库混合前用甲醇溶解。
28.进一步优选的，所述维吉霉素m1溶液的浓度为35～45μg/ml。
29.优选地，所述维吉霉素m1与初始ssdna文库混合的体积比为1:(3～5)。
30.优选地，所述孵育的条件为30～40℃孵育55～70min。
31.进一步优选地，所述孵育的条件为37～40℃孵育60～70min。
32.优选地，所述分离的方法为微孔板、磁珠、芯片、亲和层析、毛细管电泳和膜截留中任一种。
33.优选地，所述分离的方法为毛细管电泳。
34.进一步优选地，所述分离条件为：进样条件为0.5～1psi压力下注射10～15s，分离电压为25～30kv，分离温度为25～30℃。
35.优选地，对所述测序前分离得到与维吉霉素m1结合的ssdna文库进行扩大处理与重复筛选。
36.优选地，所述与维吉霉素m1结合的ssdna文库扩大的方法为pcr扩增反应。
37.进一步优选地，所述pcr扩增反应中退火温度为46～58℃。
38.更进一步优选地，所述pcr扩增反应中退火温度为52～58℃。
39.进一步优选地，所述pcr扩增反应中扩增循环数为16～24cycle。
40.更进一步优选地，所述pcr扩增反应中扩增循环数为22～24cycle。
41.优选地，对所述pcr扩增反应得到的产物进行纯化和浓缩。
42.进一步优选地，所述纯化包括以下步骤：将pcr产物于10～12％的尿素page胶中电泳分离，切出含目的条带的凝胶装入透析袋，置于tbe电泳液中进行电透析。
43.进一步优选地，所述浓缩的方法为离心浓缩。
44.优选地，对所述浓缩后的pcr产物进行变性处理得到次一级ssdna文库。
45.优选地，所述变性处理包括以下步骤：将浓缩后的pcr产物与醋酸钠溶液、氯化镁溶液、线性丙烯酰胺和乙醇混合，放置，离心，得到次一级ssdna文库。
46.进一步优选地，所述浓缩后的pcr产物、醋酸钠溶液、氯化镁溶液和乙醇的体积比为100：(10～12)：(1～5)：(95～100)。
47.进一步优选地，所述放置的条件为：-25～-20℃放置7～13h。
48.进一步优选地，所述离心的条件为20000～30000g，离心20～30min。
49.优选地，对所述次一级ssdna文库进行重复筛选。
50.优选地，所述重复筛选步骤为：以次一级ssdna文库作为初始文库，重复核酸适配体的筛选方法过程中测序步骤之前的步骤。
51.优选地，所述次一级ssdna文库与维吉霉素m1混合前，利用缓冲溶液溶解。
52.进一步优选地，所述缓冲溶液包括tris-hcl、甘氨酸和kh2po4。
53.更进一步优选地，所述缓冲溶液包括20～25mm tris-hcl、190～200mm甘氨酸、5～10mm kh2po4。
54.进一步优选地，所述溶解后的次一级ssdna文库溶液的浓度为1～3μmol/l。
55.进一步优选地，对所述次一级ssdna文库溶解后进行变性处理。
56.更进一步优选地，所述变性的条件为90～99℃变性10～15min。
57.进一步优选的，所述次一级ssdna文库变性处理后立即冰浴8～15min，随后室温放置10～15min。
58.优选地，所述重复筛选的次数通过筛选得到的与维吉霉素m1结合的ssdna文库和维吉霉素m1的亲和力的大小确定。
59.进一步优选地，所述与维吉霉素m1结合的ssdna文库和维吉霉素m1的亲和力大小通过ce-uv测定。
60.进一步优选地，所述与维吉霉素m1结合的ssdna文库和维吉霉素m1的亲和力大于40％时结束重复筛选。
61.本发明的第三个方面，提供一种维吉霉素m1的核酸适配体衍生物，所述所述核酸适配体衍生物是本发明第一方面的核酸适配体的核酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是本发明第一方面的核酸适配体改造成的相应锁核酸或肽核酸。
62.以上不论是衍生出的核酸适配体还是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构性质和功能，即都可用于与维吉霉素m1特异性结合。
63.本发明的第四个方面，提供本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体或本发明第三方面的维吉霉素m1的核酸适配体衍生物在制备维吉霉素m1传感器中的应用。
64.本发明的第五个方面，提供本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体或本发明第三方面的维吉霉素m1的核酸适配体衍生物在制备维吉霉素m1检测试剂中的应用。
65.本发明的第六个方面，提供本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体或本发明第三方面的维吉霉素m1的核酸适配体衍生物在制备维吉霉素m1检测试剂盒中的应用。
66.本发明的第七个方面，提供本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体或本发明第三方面的维吉霉素m1的核酸适配体衍生物在检测维吉霉素m1中的应用。
67.本发明的第八个方面，提供本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体或本发明第三方面的维吉霉素m1的核酸适配体衍生物在分离与纯化维吉霉素m1中的应用。
68.本发明的第九个方面，提供一种维吉霉素m1的检测方法，将本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体或本发明第三方面的维吉霉素m1的核酸适配体衍生物与待测样品混合，检测待测样品与本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体或本发明第三方面的维吉霉素m1的核酸适配体衍生物的结合情况。
69.将本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体或本发明第三方面的维吉霉素m1的核酸适配体衍生物与纳米金混合，孵育，与待测样品混合，加入盐溶液，观察溶液的颜色变化。
70.本发明的第十个方面，提供一种维吉霉素m1检测试剂盒，包括本发明第一方面的维吉霉素m1的核酸适配体或本发明第三方面的维吉霉素m1的核酸适配体衍生物。
71.优选地，所述试剂盒还包括纳米金。
72.本发明的有益效果是：1、本发明的核酸适配体可以高亲合力、高特异性地结合维吉霉素m1，具有稳定性好、易于合成、易于修饰、序列长度较短和成本低等优点，有利于大规模工业化生产及应用。
73.2、本发明通过ce-selex技术筛选得到维吉霉素m1的核酸适配体，在核酸适配体筛选过程中选用了ssdna随机库进行筛选，在库的设计上，两边固定区引入限制性酶切位点，尽量避免可能的dimer、hairpin、loop等的形成，进而避免造成pcr扩增产生非特异性和效率降低的现象；中间随机区长度设为40个碱基，尽可能增加了库容，满足实验要求；同时，本发明在分离与维吉霉素m1结合及未结合的核酸时选用的毛细管电泳的方法，该方法筛选效率高，仅需3～4轮就可完成筛选，且亲和力评价方法简便，采用ce-uv方法可以在筛选的同时达到检测的目的，并且可以根据公式直接计算出解离系数kd值，另外，ce本身具有样品量用量少，样品分析速度快，重复性高等优势；进一步在3'引物中间进行spacer 9(三甘醇间隔臂)修饰以及对pcr扩增条件进行优化，避免了非特异性扩增和引物二聚体的产生，得到较高产量和特异性的目的dsdna。
74.3、本发明维吉霉素m1的核酸适配体具有易修饰特性，可以通过修饰信号物质，将维吉霉素m1的紫外吸收信号转化为其他信号(如荧光等)，从而实现维吉霉素m1的高灵敏检测。
75.4、将本发明制备得到的维吉霉素m1核酸适配体用于建立hrp-tmb竞争性酶联适配体的可视化检测方法，该方法的检测限为5.1ng/ml，够满足维吉霉素m1的定量检测分析的要求；同时，该方法可在其它干扰物(如环丙沙星、克伦特罗和甲硝唑等抗生物素)存在的情
tris-hcl、192mm甘氨酸、5mm kh2po4，ph 8.3)结合缓冲液中，配制成浓度为2μmol/l的ssdna文库；置于95℃条件下变性10min，立即冰浴10min，随后室温(25～30℃)放置10min平衡，以使文库中大量的ssdna折叠形成复杂多样的三维结构，随后再与靶标物质(维吉霉素m1)混合孵育。每次筛选应当评估ssdna的亲和力，直到得到包含有与维吉霉素m1高亲和力和高特异性结合的核酸适配体的核酸文库。
103.5.筛选轮数确定
104.每一轮子库ssdna的亲和力评估方法如下：以5μl 40μg/ml的维吉霉素m1与20μl 2μmol/l ssdna混合后溶液的ssdna峰面积变化表征每轮筛选后亲和力的变化，通过利用毛细管电泳-紫外可见检测法(capillary electrophoresis-ultraviolet，ce-uv)测定单独ssdna的峰面积(i0)，与维吉霉素m1混合后峰面积(i1)，计算峰面积变化百分比(ra)，计算公式为：ra(％)＝(i0－i1)/i0×
100％，ra越大，说明ssdna与维吉霉素m1的亲和力越强。结果如图2所示，从第一轮至第三轮，次级子库与维吉霉素m1的亲和力随筛选轮次的增加而增加，筛选至第四轮时，结合比例有所降低，亲和力不再提高，可见，只进行4轮筛选，即可得到具有高亲和力的子库ssdna，因此，筛选在第4轮终止。
105.6.克隆测序
106.将第3轮筛选得到的ssdna进行pcr扩增，切胶回收纯化后，送至生物工程有限公司进行高通量测序，结果如表1所示，获得的富集程度较高的10条核酸适配体序列。
107.表1高通量测序获得的富集程度较高的10条核酸适配体序列
[0108][0109]
实施例3维吉霉素m1的核酸适配体的亲和力表征与特异性分析
[0110]
对测序结果中获得的富集程度较高的前四条核酸适配体序列(seq id no.1～seq id no.4)进行平衡解离常数kd测定。具体步骤如下：在2μmol/l ssdna中加入不同浓度维吉霉素m1(使反应体系中维吉霉素m1的浓度为0μmol/l、0.35μmol/l、0.71μmol/l、1.00μmol/l、
1.40μmol/l和1.66μmol/l)，混匀后，利用ce-uv测定ssdna的峰面积，并计算ssdna的峰面积的变化百分数(ra)，计算公式如下：ra(％)＝(i0－i1)/i0×
100％，其中，i0为2μmol/l ssdna的峰面积，i1为加入不同浓度维吉霉素m1后的ssdna峰面积；ra越大，表示靶标物质与ssdna的相对亲和力越强。利用软件graphpad prism 6对ra随维吉霉素m1浓度变化的非线性饱和曲线拟合，求得解离常数(kd)，如图3所示，四种核酸核酸适配体的解离常数分别为47
±
25nm、160
±
17nm、259
±
36nm和101
±
15nm，可见，核酸适配体候选序列seq id no.1的解离常数明显小于其他三种，表明其亲和力是上述四条核酸适配体序列中最高的。
[0111]
基于适配体识别-纳米金变色效应的检测方法，对候选序列的特异性进行评估。具体步骤如下：分别取40μl纳米金加入4个离心管中，然后在每个管中加入20μl 200nmol/l核酸适配体，振荡混匀，室温孵育40min；每个试管中分别加入5μl相同浓度(1μg/ml)的环丙沙星(ciprofloxacin)、克伦特罗(clenbuterol)、维吉霉素m1(virginiamycin m1)、甲硝唑(methronidazole)，室温孵育60min；分别在每个离心管中加入35μl 80mmol/l氯化钠溶液，振荡混匀，利用紫外-可见分光光度计扫描450～800nm波长处的光谱，计算a
656nm
/a
522nm
的比值，同时放置40min后观察溶液颜色变化。a
656nm
/a
522nm
的比值越大，表明结合能力越强。从图4可以看出，维吉霉素m1的a
656nm
/a
522nm
的比值显著大于其他三种抗生素(环丙沙星、克伦特罗、甲硝唑)的a
656nm
/a
522nm
的比值，该现象在四条候选序列中呈现一致性，其中候选序列seq id no：1的a
656nm
/a
522nm
的比值最大，表明核酸适配体seq id no.1的特异性最好。
[0112]
综上，得到最佳的维吉霉素m1的核酸适配体的序列(seq id no：1)如下：
[0113]
5'-gtctatatgatctgtaactcgcagagggacagggaagatgtagacatctgt gctcttcgcccagcagtgagtcatcagat-3'。
[0114]
利用mfold软件对本发明的核糖核酸适配体进行二级结构模拟，其二级结构模拟后的结构示意图如图5所示。
[0115]
实施例4基于hrp-tmb竞争性酶联适配体的可视化检测方法的建立
[0116]
利用实施例2得到的核酸适配体(seq id no：1)建立基于hrp-tmb竞争性酶联适配体的可视化检测方法，具体步骤如下：
[0117]
1.链酶亲和素(streptavidin，sa)包被
[0118]
使用包被液(35mmol/l nahco3，15mmol/l na2co3，ph 9.6)将sa稀释到10μg/ml，将稀释后的sa溶液加入到微孔板中，每孔200μl，放置在摇床(温度为37℃，转速为100rpm/min)上孵育2h；倒掉微孔板中的溶液，并将微孔板放置洗板机上用pbst洗涤3次，每孔300μl，洗涤完成后用吸水纸将微孔板拍干。
[0119]
2.bsa封闭
[0120]
在微孔板内加入20mg/ml的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)进行封闭，每孔200μl，放置摇床(温度为37℃，转速为100rpm/min)上孵育2h；倒掉微孔板中的溶液，并将微孔板放置洗板机上用pbst洗涤3次，每孔300μl，洗涤完成后用吸水纸将微孔板拍干。
[0121]
3.加入带有生物素标记的适配体
[0122]
在微孔板中加入100nm带有生物素标记的适配体(biotin-seq 1)，每孔加入100μl；将微孔板放置在摇床(温度为37℃，转速为100rpm/min)上孵育1h；倒掉微孔板中的溶液，并将微孔板放置洗板机上用pbst洗涤3次，每孔300μl，洗涤完成后用吸水纸将微孔板拍干。
[0123]
4.加入带有生物素标记的适配体互补链
[0124]
在微孔板中分别加入5μl不同浓度的维吉霉素m1(维吉霉素m1的浓度分别为0.03125μg/ml、0.0625μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml)，每个浓度3个复孔，同时每孔中加入100μl15nm带有生物素标记的适配体互补链；将微孔板放置在摇床(温度为37℃，转速为100rpm/min)上孵育1h；倒掉微孔板中的溶液，并将微孔板放置洗板机上用pbst洗涤3次，每孔300μl，洗涤完成后用吸水纸将微孔板拍干。
[0125]
5.在微孔板中加稀释倍数为800倍的链酶亲和素-hrp，每孔100μl；将微孔板放置在摇床(温度为37℃，转速为100rpm/min)上孵育45min；倒掉微孔板中的溶液，并将微孔板放置洗板机上用pbst洗涤3次，每孔300μl，洗涤完成后用吸水纸将微孔板拍干。
[0126]
6.每孔加入100μl tmb显色液，放置恒温箱(37℃)避光孵育15min。
[0127]
7.显色后，每孔加入体积50μl浓度为2m硫酸终止液进行终止反应，10min内使用酶标仪测定波长为450nm处的吸光度值；并以维吉霉素m1浓度为横坐标，吸光度值(a
450nm
)为纵坐标，绘制标准曲线。
[0128]
通过基于hrp-tmb竞争性酶联适配体建立维吉霉素m1的可视化检测方法，从图6中a可知，维吉霉素m1浓度在0.03125μg/ml～0.5μg/ml范围内具有良好的线性关系，其线性曲线方程为：y＝-1.006x+3.065，r2＝0.9780，检测限为5.1ng/ml，表明本发明所建立的竞争性酶联适配体的可视化检测方法能够满足维吉霉素m1的定量检测分析的要求，实现维吉霉素m1的快速检测。
[0129]
为了验证上述检测方法的特异性，防止假阳性现象的发生，应用所构建的方法对相同浓度(1μg/ml)的环丙沙星、克伦特罗、甲硝唑和维吉霉素m1同时进行检测，从图6中b可知，维吉霉素m1样品孔的吸光度值显著低于其他三种抗生素样品孔的吸光度值(p＜0.001)，表明该核酸适配体可有效用于竞争性酶联适配体检测m1方法中，且该方法具有较高的特异性，可用于m1的特异性检测。
[0130]
实施例5基于适配体识别和纳米金变色效应的检测方法的建立
[0131]
取40μl纳米金加入离心管中，分别在每个管中加入20μl 300nmol/l核酸适配体(seq id no：1)，振荡混匀，室温(25～30℃)孵育40min；分别加入5μl不同浓度的维吉霉素m1(维吉霉素m1的浓度分别为0.03125μg/ml、0.0625μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml和1μg/ml)，振荡混匀，室温孵育60min；分别在每个离心管中加入35μl 75mmol/l氯化钠溶液，振荡混匀，利用紫外可见分光光度计扫描溶液450～800nm波长处的光谱(图7中a)，同时将离心放置40min后观察溶液颜色变化；以656nm和522nm的吸光度比值(a
656nm
/a
522nm
)作为纵坐标，以维吉霉素m1浓度为横坐标绘制标准曲线。
[0132]
通过基于适配体识别和纳米金变色效应建立维吉霉素m1的检测方法，由图7可知，随着维吉霉素m1浓度的增加，a
656nm
/a
522nm
的比值越大，在0.03125μg/ml～1μg/ml范围内具有良好的线性关系，其线性曲线方程为y＝0.4986x+0.1969，r2＝0.9849，检测限为55ng/ml，表明本发明所建立的检测方法能够用于维吉霉素m1的快速检测。
[0133]
为了验证基于适配体识别和纳米金变色效应的检测维吉霉素m1在实际应用中的可行性，用市售的牛奶进行加标回收实验。向牛奶中加入维吉霉素m1标准溶液，加标的牛奶中维吉霉素m1的浓度分别为0.03125μg/ml、0.0625μg/ml、0.125μg/ml，每个浓度做3组平行对照，使用基于适配体的纳米金显色方法检验加标回收率。结果如表2所示，牛奶中维吉霉
素m1的加标回收率在82％～110％之间，表明本发明所建立的基于适配体识别和纳米金变色效应的检测方法具有较高的准确性和稳定性，可用于牛奶中维吉霉素m1含量的检测。
[0134]
表2牛奶中维吉霉素m1的加标检测回收率
[0135][0136]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。