基因编辑作物产品中关键外源基因cas9的pcr检测方法
技术领域
1.本发明涉及转基因产品中外源基因的检测方法，尤其涉及基因编辑作物产品中关键外源基因cas9的pcr检测方法，属于基因编辑作物产品中关键外源基因cas9的pcr检测领域。


背景技术：

2.目前科学家已经培育出大量的基因编辑的动植物，而美国与日本已经允许部分基因编辑的产品产业化，但中国尚未批准任何基因编辑产品上市，为了加快推动中国生物技术方面的发展，实现基因编辑产品的有效监测，应尽快根据基因编辑技术的特点建立有效、特异、灵敏、高通量的筛选和鉴定方法。
3.近年来，中国科学家李家洋院士等提出了基因组编辑技术的监管框架，其中最为关键的一条就是基因编辑作物在进入市场前期引入cas9核酸内切酶等外源dna，必须确保最终产品中不含有外源基因(huang et al.,2016)，如若引入cas9外源核酸序列应等同转基因类似的管理策略。因此开展基因编辑外源序列cas9核酸内切酶的检测方法的研究一方面有利于基因编辑作物的研发者在基因编辑作物育种过程中筛选鉴定外源cas9基因，另一方面也是以后基因编辑作物市场化的重要监管策略，具有重要的科学应用价值。
4.目前全球基础研究领域创制了一批新型基因编辑作物，然而在检测cas9核酸内切酶的定性检测方法研究上目前还相对滞后，有待改进。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一是提供用于检测基因编辑作物产品中cas9核酸内切酶基因的pcr引物；
6.本发明的目的之二是建立一种基因编辑作物产品中关键外源基因cas9的pcr检测方法；
7.本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
8.本发明的一方面是提供了检测基因编辑作物产品中cas9核酸内切酶基因的pcr引物对，所述的pcr引物对选自以下三组引物对中的任何一对：
9.(1)引物对1(cas9-f1/r1)：所述的引物对1由上游引物和下游引物组成，其中，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别为seq id no.1和seq id no.2所示；
10.(2)引物对2(cas9-f2/r2)：所述的引物对2由上游引物和下游引物组成，其中，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别为seq id no.3和seq id no.4所示；
11.(3)引物对3(cas9-f3/r3)：所述的引物对3由上游引物和下游引物组成，其中，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别为seq id no.5和seq id no.6所示。
12.本发明根据cas9核酸内切酶序列，经过初步筛选得到了上述3对引物，将这3对引物进一步用于特异性、灵敏度和工作效率的筛选。pcr扩增结果显示上述的三对引物均将1％和0.1％的基因编辑水稻dna模板扩增出目的条带，且1％的dna模板的扩增条带较0.1％
的更为清晰，引物对1(cas9-f1/r1)与引物对3(cas9-f23/r3)这两对引物会出现引物二聚体，而引物对2(cas9-f2/r2)没有引物二聚体，因此，本发明最终优选扩增引物为引物对2(cas9-f2/r2)，扩增条带大小为250bp左右。
13.本发明的另一方面是应用所述的引物对建立了一种基因编辑作物产品中关键外源基因cas9的pcr检测方法，该方法包括：
14.(1)提取待检测的基因编辑产品的dna；
15.(2)以提取待检测的基因编辑产品的dna，采用本发明提供的引物对建立pcr扩增体系进行pcr扩增反应；
16.(3)如果扩增得到250bp左右的产物，则待检测的基因编辑产品中含有关键外源基因cas9。
17.为了更好的优化cas9-f2/r2引物的pcr反应体系和条件，本发明以不同引物浓度和温度进行体系优化试验。体系优化试验结果显示，随着引物浓度的增加扩增条带变强，但同时扩增产物在部分温度下产生引物二聚体。综合评估检测灵敏性和特异性，引物浓度为0.3μmol/l、退火温度61℃-67℃时扩增效率达到较高水平、无非特异性扩增、引物二聚体少，根据实验结果确定反应体系以及条件如下，采用25μl反应体系：10
×
pcr buffer(mg
2+
plus)2.5μl，dntp mixture 2μl，上、下游引物(10μmol/l)各0.75μl，终浓度为300nmol，rtaq dna聚合酶(250u 5u/μl)0.15μl，dna模板(15ng/μl)2μl，用ddh2o补至25μl；pcr反应条件优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s；61℃-67℃退火45s；72℃延伸30s；扩增反应共进行35次循环，72℃延伸7min；4℃保存。
18.本发明的再一方面是提供了一种检测基因编辑作物产品中cas9核酸内切酶基因的pcr检测试剂盒，包括：pcr buffer，dntp mixture，上、下游引物，rtaq dna聚合酶；其中，所述的上、下游引物是上述的三组引物对中的任何一种上、下游引物。
19.本发明中所述的基因编辑作物产品包括但不限于基因编辑水稻产品、基因编辑大豆产品或基因编辑油菜产品等基因编辑作物产品中的任何一种。
20.为了测试本发明所建立的基因编辑作物产品中关键外源基因cas9的pcr检测方法的特异性，采用其它转基因作物混和样品dna和非基因编辑水稻的dna为模板进行pcr扩增，结果表明本发明建立的基因编辑水稻检测方法具有高度特异性。
21.本发明进一步利用cas9-f2/r2引物扩增基因编辑大豆和基因编辑油菜，结果说明cas9-f2/r2引物在检测cas9介导的基因编基因作物中具有广泛的适用性。
22.灵敏度检测试验结果表明本发明建立的基因编辑作物产品中关键外源基因cas9的pcr检测方法的灵敏度可达到0.1％。
23.为了进一步确定本发明建立的基因编辑作物产品中关键外源基因cas9的pcr检测方法的稳定检测下限为0.1％，以质量分数为0.1％的基因编辑水稻基因组dna为模板，进行67次pcr扩增。结果发现，67个反应均能稳定检测出预期dna片段，满足基因编辑成分定性检测限确定的要求，因此可以确定本发明建立的基因编辑产品中关键外源基因cas9的pcr检测方法的检出限为0.1％。
24.本发明根据基因编辑的原理，建立检测外源基因-cas9的方法，判断检测样品是否引入cas9核酸内切酶等外源dna，具体的，本发明以基因编辑水稻引入的cas9核酸酶等外源序列为靶位点，通过设计与筛选引物、特异性、灵敏度等分析和体系优化建立了检测基因编
辑外源基因-cas9的普通pcr，可以实现对基因编辑产品的初筛选。本发明所建立的基因编辑产品中关键外源基因cas9的pcr检测方法具有高度特异性和广泛的适用性，灵敏度可达到0.1％，稳定检测下限为0.1％。
附图说明
25.图1cas9核酸内切酶序列。
26.图2引物筛选m:dna分子标记100bp-1000bp；1％:质量分数为1％的基因编辑水稻；0.1％：质量分数为0.1％的基因编辑水稻。
27.图3引物cas9-2的pcr反应体系和条件的筛选；引物浓度为：0.1μmol/l、0.2μmol/l、0.3μmol/l、0.4μmol/l、0.5μmol/l；退火温度分别设置为：55℃、56℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃、67℃、71℃、72℃、73℃。
28.图4基因编辑水稻普通pcr方法的特异性检测结果；m:dna分子标记100bp-1000bp。
29.图5基因编辑大豆与基因编辑油菜检测结果；m:dna分子标记100bp-1000bp。
30.图6基因编辑水稻的pcr检测方法的灵敏度测试结果；m:dna分子标记100bp-1000bp；10％:质量分数为10％的基因编辑水稻；5％：质量分数为5％的基因编辑水稻；1％：质量分数为1％的基因编辑水稻；0.1％：质量分数为0.1％的基因编辑水稻；0.05：质量分数为0.05％的基因编辑水稻。
31.图7基因编辑水稻的pcr检测方法的稳定性测试结果；1-67：以质量分数为0.1％的基因编辑水稻dna进行67次独立扩增的实验结果。
具体实施方式
32.以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
33.试验例1引物的设计与筛选、基因编辑产品中关键外源基因cas9的实时荧光pcr检测方法的建立和验证
34.1试验方法
35.1.1引物的设计与筛选
36.本发明根据cas9核酸内切酶序列(图1所示)，经过初步筛选得到了3对引物(表1)，将这3对引物进一步用于特异性、灵敏度和工作效率的筛选。
37.表1 pcr设计引物的序列信息
[0038][0039]
将质量分数为1％和0.1％的基因编辑水稻dna模板用于3对引物的筛选。
[0040]
1.2pcr扩增
[0041]
普通pcr采用25μl反应体系：10
×
pcr buffer(mg
2+
plus)2.5μl，dntp mixture 2μl，上、下游引物(10μmol/l)各0.5μl终浓度为200nmol，rtaq dna聚合酶(250u 5u/μl)0.15μl，dna模板(15ng/μl)2μl，用ddh2o补至25μl。
[0042]
普通pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s；60℃退火45s；72℃延伸30s；扩增反应共进行35次循环，72℃延伸7min；4℃保存。
[0043]
2试验结果
[0044]
2.1引物的设计与筛选
[0045]
本试验中以质量分数为1％和0.1％的含有cas9外源的基因编辑水稻dna为模板，普通pcr的反应体系及条件见1.2。
[0046]
pcr扩增结果显示开发的三对引物均将1％和0.1％的基因编辑水稻dna模板扩增出目的条带，且1％的dna模板的扩增条带较0.1％的更为清晰，cas9-f1/r1与cas9-f23/r3两对引物会出现引物二聚体，而cas9-f2/r2引物没有引物二聚体(图2)，根据实验结果，最终选择的扩增引物为cas9-f2/r2，扩增条带大小为250bp左右。
[0047]
2.2pcr反应体系和扩增条件优化
[0048]
为了更好的优化cas9-f2/r2引物的pcr反应体系和条件。以不同引物浓度(0.1μmol/l、0.2μmol/l、0.3μmol/l、0.4μmol/l和0.5μmol/l)和温度(55℃、56℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃、67℃、69℃、71℃、72℃和73℃)进行体系优化试验。
[0049]
体系优化试验结果显示，随着引物浓度的增加扩增条带变强，但同时扩增产物在部分温度下产生引物二聚体。
[0050]
综合评估检测灵敏性和特异性，引物浓度为0.3μmol/l、退火温度61℃-67℃时扩增效率达到较高水平、无非特异性扩增、引物二聚体少(图3)，根据实验结果确定反应体系以及条件如下,采用25μl反应体系：10
×
pcr buffer(mg
2+
plus)2.5μl，dntp mixture 2μl，上下游引物(10μmol/l)各0.75μl，终浓度为300nmol，rtaq dna聚合酶(250u 5u/μl)0.15μl，dna模板(15ng/μl)2μl，用ddh2o补至25μl。反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s；61℃-67℃退火45s；72℃延伸30s；扩增反应共进行35次循环，72℃延伸7min；4℃保存。
[0051]
2.3pcr方法的特异性分析
[0052]
为了测试建立的基因编辑水稻的普通pcr检测方法的特异性，采用其它转基因作物混和样品dna和非基因编辑水稻的dna为模板进行pcr扩增(汪秀秀等,2014)，实验结果如
图4所示，只有1％的基因编辑水稻样品扩增到预期dna片段，而在其他样品中均未扩增到预期大小的条带，表明本发明建立的基因编辑水稻检测方法具有高度特异性。
[0053]
接下来，利用cas9-f2/r2引物扩增基因编辑大豆和基因编辑油菜，实验结果如图5所示，除了空白对照与阴性对照，其他样品均扩增出预期大小的目的片段。说明该cas9-f2/r2引物在检测cas9介导的基因编基因作物中具有广泛的适用性。
[0054]
2.4普通pcr方法的灵敏度分析
[0055]
以质量分数为10％、5％、1％、0.1％、0.05％基因编辑水稻的dna做模板，进行pcr扩增。
[0056]
结果显示，随着基因编辑水稻的dna含量的降低，pcr条带越来越弱，在含量低至0.05％时pcr仍然有条带出现(见图6)，表明本发明建立的检测方法的灵敏度可达到0.1％。
[0057]
为了进一步确定该方法的稳定检测下限为0.1％，以质量分数为0.1％的基因编辑水稻基因组dna为模板，进行67次pcr扩增。结果如图7所示，67个反应均能稳定检测出预期dna片段，满足基因编辑成分定性检测限确定的要求(汪小福等,2016)，因此可以确定本发明检测方法的检出限为0.1％。