用于靶向基因疗法的腺相关病毒组合物
1.交叉引用
2.本技术要求于2018年9月26日提交的美国临时申请序列号62/736,904和于2019年4月11日提交的美国临时申请序列号62/832,812的权益，这两个申请通过全文引用的方式并入本文。
3.关于联邦政府资助的研究或开发的声明
4.本发明是根据美国国立卫生研究院(national institutes of health)授予的授权号ns087949和darpa授予的授权号w91 inf-17-2-0036在政府的支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。
5.序列表
6.本技术含有已经以ascii格式电子提交的序列表，并且特此以全文引用的方式并入。所述ascii副本创建于2019年9月20日，被命名为38075-733_601_sl.txt并且大小为10,656,833字节。


背景技术：

7.重组腺相关病毒(raav)由于其能够转导分裂细胞和非分裂细胞、能够以游离dna的形式长期存在于受感染细胞中和低免疫原性而在基础科学研究和治疗性应用中越来越多地用于基因递送。这些特性使其对于在基础科学和临床方面的应用(如基因疗法)是有吸引力的。当前用于许多病症的基因治疗方法聚焦于直接递送，以增加转导效率并将表达仅限于受感染的细胞类型。然而，由于局部递送的覆盖范围有限，这种施用途径导致在许多临床试验和疾病方面的成功率有限。
8.静脉内施用解决了这些局限性，并且允许以非侵入性方式广泛且高效地接近全身的组织和器官。不幸的是，天然存在的血清型限制了某些细胞类型和器官的转导，而在其它细胞类型和器官中则具有非特异性、重叠的向性。这会在基因疗法应用中导致若干并发症，包含但不限于由于未受影响器官和细胞类型(具体地，肝脏)的转导而引起的脱靶效应，以及需要更大的病毒载量才能在所关注的组织或器官中达到足够的治疗水平。另外，即使是在全身性递送的情况下，目前的raav介导的基因疗法也缺乏对穿过血脑屏障(bbb)或上皮的特异性，从而限制了其作为用于大脑或器官(例如，肺)的疾病和病状的治疗性干预的可及范围)。
9.因此，需要当全身地(例如，静脉内、鼻内)递送到受试者时能够实现对靶特定细胞类型或器官的高特异性和对未受影响的(脱靶)器官和细胞类型的低特异性的raav。


技术实现要素：

10.本文公开了重组aav(raav)，这些raav包括具有特异性的衣壳，这些衣壳通过正向和负向选择的迭代轮次而工程化到衣壳结构中。该工程化产生了raav变体，该raav变体相对于其所衍生自的未经修饰的亲本衣壳对某些组织或器官的特异性改变。在一些实施例中，该raav变体包括aav衣壳蛋白，该aav衣壳蛋白在与aav9衣壳蛋白vp1的氨基酸452-458
相对应的残基处具有7聚体肽取代。在某些实施例中，该取代是aav9 vp1的氨基酸452-458的取代。在某些其它实施例中，该取代是aav-php.b vp1的氨基酸452-458的取代。在又其它实施例中，该取代是aav-php.eb vp1的氨基酸452-458的取代。在一些实施例中，该取代降低了raav衣壳对细胞或组织的向性，使该raav变体能够减少治疗性病毒转导的脱靶效应，从而消除了对更大病毒剂量的需求。在一些实施例中，该取代增加了raav衣壳对细胞或组织的向性，使该raav变体在全身性递送(例如，静脉内注射)时能够实现向受试者中的靶环境(例如，靶细胞类型或组织)的广泛转导。通常，该7聚体肽取代不是ilgtgts(seq id no:45479)、qssqtpr(seq id no:45479)或tlavpfk(seq id no:45477)。
11.本文描述的raav是使用基于cre重组的aav靶向进化(create)方法的修改版本鉴定的。多重create(m-create)方法通过在衣壳蛋白序列中引入变异、无偏的体内选择和仅回收行进到限定的细胞群体、跨细胞膜、行进到细胞核并解包并表达其基因有效载荷的那些变体来产生增强的转导效率和/或特异性。回收并通过深度测序鉴定表现出最期望的向性(例如，对特定体内环境的增强的效率和特异性)的变体衣壳。用于无偏选择和分析的策略包含确定变体的富集评分(通过将靶组织文库相对于起始病毒文库归一化)和通过合成文库构建在选择轮次之间的无偏传播(其中每个变体等同地表示)。本文还描述了来自测序数据的所得文库的详细表征，其提供了关于针对靶标的变体的选择的有用见解。
12.本文还公开了aav衣壳文库，该aav衣壳文库包括aav衣壳蛋白，该aav衣壳蛋白在与aav9 vp1的氨基酸452-458相对应的残基处具有7聚体肽取代。在一些实施例中，该文库是在aav9变体aav-php.eb或aav-php.b的氨基酸452-458处包括7聚体肽取代的衣壳的文库。此类文库在跨不同脑细胞类型(例如，内皮细胞、神经元和星形胶质细胞)的体内正向选择和跨肝脏的负向选择中具有特殊用途，本文已表明此类文库可以产生穿过bbb、广泛转导中枢神经系统(cns)以及使脱靶体内环境(例如，肝脏)去靶的能力得到增强的aav9变体的大集群。在其它实施例中，该文库是包括aav衣壳蛋白的aav衣壳文库，该aav衣壳蛋白在aav9的氨基酸452-458处具有7聚体肽取代。此类文库在跨如脊髓、大脑、肝脏、胃、肠、肺、心脏、睾丸、脾脏、动物脂肪(脂肪)和肌肉等不同器官的体内选择中具有特殊用途。
13.本文还公开了用于产生治疗性重组aav(raav)颗粒的方法和试剂盒，以及用于治疗有需要的受试者的影响例如cns、pns或靶体内环境(例如，肺)的疾病或病状的方法和包括该raav颗粒的药物组合物或调配物。
14.本文公开的方面提供了重组aav(raav)，该raav包括：(a)变体aav衣壳，该变体aav衣壳包括变体aav衣壳蛋白，该变体aav衣壳蛋白包括对应的亲本aav衣壳蛋白的3重对称轴处的7聚体肽序列内的三个或更多个氨基酸的氨基酸取代，其中该7聚体肽序列位于与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基452-458相对应的氨基酸位置处，并且其中该氨基酸取代不是ilgtgts(seq id no:45479)、qssqtpr(seq id no:45479)或tlavpfk(seq id no:45477)；以及(b)异源多核苷酸，该异源多核苷酸包括编码基因产物的核苷酸序列。在一些实施例中，当在受试者中测量时，相对于对应的亲本aav衣壳的向性，该变体aav衣壳对靶组织或靶细胞的向性增加。在一些实施例中，该靶组织或该靶细胞包括中枢神经系统(cns)或外周神经系统(pns)或其组合的组织或细胞。在一些实施例中，当在受试者中测量时，相对于对应的亲本aav衣壳的向性，该变体aav衣壳对包括肝组织的脱靶组织或包括肝细胞的脱靶细胞的向性降低。在一些实施例中，该三个或更多个氨基酸包括该亲本aav衣壳蛋白中与
aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基452-454、453-455、454-456、455-457或456-458相对应的氨基酸位置处的三个连续氨基酸，每个氨基酸独立地选自由以下组成的组：a、d、e、g、k、h、m、n、p、l、q、s、t和v。在一些实施例中，该三个或更多个氨基酸包括该亲本aav衣壳蛋白中与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基452-455、453-456、454-457或455-458相对应的氨基酸位置处的四个连续氨基酸，每个氨基酸独立地选自由以下组成的组：a、d、e、g、k、h、m、n、p、l、q、s、t和v。在一些实施例中，三个或更多个氨基酸包括该亲本aav衣壳蛋白中与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基452-456、453-457或454-458相对应的氨基酸位置处的至少五个连续氨基酸，每个氨基酸独立地选自由以下组成的组：a、d、e、g、k、h、m、n、p、l、q、s、t和v。在一些实施例中，该三个或更多个氨基酸包括以下中的三个或更多个：(a)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基452相对应的氨基酸位置处取代的a、d、e、g、h、m、n、q、s、t或v；(b)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基453相对应的氨基酸位置处取代的a、d、e、g、k、n、q、s、t或v；(c)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基454相对应的氨基酸位置处取代的a、d、e、g、k、n、q、s、t或v；(d)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基455相对应的氨基酸位置处取代的a、d、e、g、k、n、p、q、s或t；(e)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基456相对应的氨基酸位置处取代的a、d、e、g、h、k、n、p、q、s或t；(f)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基457相对应的氨基酸位置处取代的a、d、e、g、k、n、p、s、t或v；以及(g)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基458相对应的氨基酸位置处取代的a、e、g、h、k、l、n、q、s、t或v。在一些实施例中，该三个或更多个氨基酸包括以下中的三个或更多个：(a)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基452相对应的氨基酸位置处取代的a、d、e、g、h、k、l、m、n、q、s、t或v；(b)在与aav9 vp1(seqid no:1)的氨基酸残基453相对应的氨基酸位置处取代的a、d、g、h、m、n、p、q、s、t或v；(c)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基454相对应的氨基酸位置处取代的a、d、e、g、k、n、q、s、t或v；(d)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基455相对应的氨基酸位置处取代的a、d、e、g、k、n、p、q、s或t；(e)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基456相对应的氨基酸位置处取代的a、d、g、k、n、p、q、s或t；(f)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基457相对应的氨基酸位置处取代的a、g、h、l、m、n、p、q、s、t或v；以及(g)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基458相对应的氨基酸位置处取代的a、d、e、g、h、i、k、l、n、q、r、s、t或v。在一些实施例中，该氨基酸取代包括选自dgaatkn(seq id no:3943)和dgqssks(seq id no:2764)的氨基酸序列。在一些实施例中，该三个或更多个氨基酸包括以下中的三个或更多个：(a)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基452相对应的位置处的氨基酸处取代的a、d、g、l、n、q、s或t；(b)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基453相对应的位置处的氨基酸处取代的a、g、n、p、q、r、s或；(c)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基454相对应的位置处的氨基酸处取代的a、d、g、n、s或t；(d)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基455相对应的位置处的氨基酸处取代的a、d、g、k、n、p、q、s或t；(e)在与aav9 vp(seq id no:1)的氨基酸残基456相对应的位置处的氨基酸处取代的a、g、k、n、p、r、s或t；(f)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基457相对应的位置处的氨基酸处取代的a、g、k、n、p、r、s、t或v；以及(g)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基458相对应的位置处的氨基酸处取代的a、g、k、l、r、s、t或v。在一些实施例中，该氨基酸取代包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：lqtsspg(seq id no:2933)、qqgkqsv(seq id no:79)、sintktn(seq id no:45475)、sngtkqt(seq id no:442)、
gsgktaa(seq id no:88)、mgdkptr(seq id no:2466)、qpsggnt(seq id no:2672)、ergantk(seq id no:5192)、ttgghss(seq id no:2743)、gttktse(seq id no:3064)、gtgtsvl(seq id no:11958)、nqsgtkg(seq id no:780)、kgpgqmg(seq id no:45476)和gtpskag(seq id no:2741)。在一些实施例中，该靶组织或该组织中的该靶细胞选自由以下组成的组：肺、肠、肾脏、心脏和胃。在一些实施例中，该三个或更多个氨基酸包括在与aav9 vp1的氨基酸残基452-454、453-455、454-456、455-457或456-458相对应的氨基酸位置处的三个连续氨基酸，其中：(a)452选自由以下组成的组：n、k、r和t；(b)453选自由以下组成的组：l、n、p和s；(c)454选自由以下组成的组：a、d、g、n、s和t；(d)455选自由以下组成的组：l、p、s和t；(e)456选自由以下组成的组：p、r和s；(f)457选自由以下组成的组：g、n、s和t；并且(g)458选自由以下组成的组：i、l和r。在一些实施例中，该三个或更多个氨基酸包括：(a)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基452-455、453-456、454-457或455-458相对应的氨基酸位置处的四个连续氨基酸；(b)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基452-456、453-457或453-458相对应的氨基酸位置处的五个连续氨基酸；(c)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基452-457或453-458相对应的氨基酸位置处的六个连续氨基酸；以及(d)在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基452-458相对应的氨基酸位置处的七个连续氨基酸。在一些实施例中，该靶组织是肺，并且该三个或更多个氨基酸在包括kdntpgr(seq id no:32538)、nnlprnl(seq id no:32867)或图13中提供的任何氨基酸序列的氨基酸序列中提供。在一些实施例中，该靶组织是肠，并且该三个或更多个氨基酸在包括resspsl(seq id no:26474)、kdntpgr(seq id no:26584)或图5中提供的任何氨基酸序列的氨基酸序列中提供。在一些实施例中，该组织是肾脏，并且该三个或更多个氨基酸在包括rvplsti(seq id no:26933)、nnlprnl(seq id no:27530)、kdntpgr(seq id no:28509)或图6中提供的任何氨基酸序列的氨基酸序列中提供。在一些实施例中，该组织是心脏，并且该三个或更多个氨基酸在包括kdntpgr(seq id no:25633)或图4中提供的任何氨基酸序列的氨基酸序列中提供。在一些实施例中，该组织是胃，并且该三个或更多个氨基酸在包括resspsl(seq id no:31904)或图12的任何氨基酸序列的氨基酸序列中提供。在一些实施例中，该对应的亲本aav衣壳蛋白是aav9 vp1或其变体。在一些实施例中，该aav9 vp1变体与seq id no:1具有90％或更大的序列同一性。在一些实施例中，该aav9 vp1变体与seq id no:1具有95％或更大的序列同一性。在一些实施例中，该对应的亲本aav衣壳蛋白进一步包括在与aav9 vp1(seq id no:1)的588_589相对应的氨基酸位置处对选自由以下组成的组的氨基酸序列的插入：tlaxpfk(seq id no:46424)、tlax(seq id no:46425)、lavx(seq id no:46426)、avpx(seq id no:46427)和vpfx(seq id no:46428)，其中x是除v以外的任何氨基酸。在一些实施例中，该亲本aav衣壳蛋白来自aav-php.b或aav-php.eb。在一些实施例中，该raav是分离的和纯化的。
15.本文公开的方面提供了包括本公开的raav和药物赋形剂的药物调配物。在一些实施例中，该药物调配物被调配成用于静脉内、动脉内、鼻内、鞘内、小脑延髓池内或皮下注射。
16.本文公开的方面提供了治疗受试者的疾病或病状的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本公开的raav或本公开的药物调配物，其中基因产物是治疗性基因产物。在一些实施例中，施用是通过静脉内、动脉内、鼻内、鞘内、小脑延髓池内或皮下注射进行的。在一些实施例中，该疾病或该病状选自由以下组成的组：肺纤维化、表面活性蛋白病
症、过氧化物酶体生物发生病症或copd。在一些实施例中，该病状的该疾病是中枢神经系统(cns)外周神经系统(pns)病症。
17.一种制造本公开的raav的方法，该方法包括：(a)将包括以下的核酸引入到细胞中：(i)编码治疗性基因表达产物的第一核酸序列，该第一核酸序列由5'和3'反向末端重复(itr)序列封闭；(ii)编码病毒基因组的第二核酸序列，该第二核酸序列包括5'itr序列、复制(rep)基因、衣壳(cap)基因和3'itr，其中该cap基因编码raav衣壳蛋白；以及(iii)编码选自由e4orf6、e2a和va rna组成的组的第一辅助病毒蛋白和任选地包括ela或elb55k的第二辅助病毒蛋白的第三核酸序列；(b)在该细胞中表达该aav衣壳蛋白；(c)组装本公开的raav；以及(d)将该第一核酸序列包装在该raav中。本文公开的方面提供了变体腺相关病毒(aav)衣壳，其包括：(a)以下中的至少一个：如当静脉内递送到灵长类动物受试者时在该灵长类动物受试者的肝脏中测量的，相对于具有seq id no:1的aav衣壳蛋白的对应的亲本aav衣壳，特异性降低和转导效率降低；以及(b)以下中的至少一个：如当静脉内递送到该灵长类动物受试者时在该灵长类动物受试者的中枢神经系统(cns)中测量的，相对于该对应的亲本aav衣壳，特异性增加和转导效率增加。在一些实施例中，该变体aav衣壳进一步包括变体aav衣壳蛋白，该变体aav衣壳蛋白包括在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基452-458相对应的氨基酸位置处的7聚体肽序列内的三个或更多个氨基酸的氨基酸取代。在一些实施例中，该三个或更多个氨基酸包括在该亲本aav衣壳蛋白中的与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基452-454、453-455、454-456、455-457或456-458相对应的氨基酸位置处的三个连续氨基酸，每个氨基酸独立地选自由以下组成的组：a、d、e、g、k、h、m、n、p、l、q、s、t和v。在一些实施例中，该7聚体肽序列是dgaatkn(seq id no:3943)。在一些实施例中，该变体aav衣壳蛋白进一步包括与seq id no:1的介于氨基酸217到氨基酸736之间的氨基酸序列至少96％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，该氨基酸取代不是ilgtgts(seq id no:45479)、qssqtpr(seq id no:45479)或tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该变体aav衣壳蛋白进一步包括在与aav9 vp1(seq id no:1)的588_589相对应的氨基酸位置处对选自由以下组成的组的氨基酸序列的插入：tlaxpfk(seq id no:46424)、tlax(seq id no:46425)、lavx(seq id no:46426)、avpx(seq id no:46427)和vpfx(seq id no:46428)，其中x是除v以外的任何氨基酸。本文公开的方面提供了变体腺相关病毒(aav)衣壳，其包括：(a)变体aav衣壳蛋白，该变体aav衣壳蛋白包括具有在与aav9 vp1(seq id no:1)的氨基酸残基452-458相对应的氨基酸位置处的7聚体肽序列内的三个或更多个氨基酸的氨基酸取代的氨基酸序列；以及(b)以下中的至少一个：如当鼻内或静脉内递送到受试者时在该受试者的靶组织中测量的，相对于seq id no:1或seq id no:2的对应的亲本aav衣壳蛋白，在该靶组织中的特异性增加和转导效率增加，其中该靶组织选自由以下组成的组：肺、肠、肾脏、心脏和胃。在一些实施例中，该三个或更多个氨基酸包括在与aav9 vp1的氨基酸残基452-454、453-455、454-456、455-457或456-458相对应的氨基酸位置处的三个连续氨基酸，其中：(a)452选自由以下组成的组：n、k、r和t；(b)453选自由以下组成的组：l、n、p和s；(c)454选自由以下组成的组：a、d、g、n、s和t；(d)455选自由以下组成的组：l、p、s和t；(e)456选自由以下组成的组：p、r和s；(f)457选自由以下组成的组：g、n、s和t；并且(g)458选自由以下组成的组：i、l和r。在一些实施例中，该靶组织是肺，并且在包括kdntpgr(seq id no:32538)、nnlprnl(seq id no:32867)或图13中提供的任何氨基酸序列的氨基酸序列中提供
该三个或更多个氨基酸。在一些实施例中，该靶组织是肠，并且在包括resspsl(seq id no:26474)、kdntpgr(seq id no:26584)或图5中提供的任何氨基酸序列的氨基酸序列中提供该三个或更多个氨基酸。在一些实施例中，该组织是肾脏，并且在包括rvplsti(seq id no:26933)、nnlprnl(seq id no:27530)、kdntpgr(seq id no:28509)或图6中提供的任何氨基酸序列的氨基酸序列中提供该三个或更多个氨基酸。在一些实施例中，该组织是心脏，并且在包括kdntpgr(seq id no:25633)或图4中提供的任何氨基酸序列的氨基酸序列中提供该三个或更多个氨基酸。在一些实施例中，该组织是胃，并且在包括resspsl(seq id no:31904)或图12的任何氨基酸序列的氨基酸序列中提供该三个或更多个氨基酸。在一些实施例中，该变体aav衣壳蛋白进一步包括与seq id no:1的介于氨基酸217到氨基酸736之间的氨基酸序列至少96％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的变体aav衣壳是分离的和纯化的。在一些实施例中，本公开的变体aav衣壳被调配为进一步包括药学上可接受的载体的药物调配物。在一些实施例中，该药物调配物被调配用于鼻内或静脉内施用。
18.公开的方面提供了治疗受试者的疾病或病状的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本公开的raav或本公开的药物调配物。在一些实施例中，该疾病或病状选自由以下组成的组：肺纤维化、表面活性蛋白病症、过氧化物酶体生物发生病症、慢性阻塞性肺疾病(copd)、cns疾病或病状以及pns疾病或病状。
19.本文公开的方面提供了包括变体aav衣壳蛋白的重组腺相关病毒(raav)衣壳，当在灵长类动物受试者的靶组织中测量时，相对于对应的亲本aav衣壳，该raav衣壳具有特异性增加和转导效率增加中的至少一个，并且当在该灵长类动物受试者的脱靶组织中测量时，相对于该对应的亲本aav衣壳，该aav衣壳具有特异性降低和转导效率降低中的至少一个。在一些情况下，在将该raav衣壳静脉内、动脉内、鞘内或皮下施用到该受试者后，测量特异性或转导效率。在一些情况下，该raav衣壳是嵌合的。在一些情况下，与亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav或变体aav蛋白在其中包括使该raav在该靶组织内的定位增加。
20.在一些情况下，该变体aav衣壳蛋白(和raav衣壳)包括对在与seq id no:1中提供的aav9 vp1衣壳蛋白的氨基酸序列中的残基452-458中的一个或多个残基相对应的一个或多个氨基酸位置处的选自由a、d、e、g、k、h、m、n、p、l、q、s、t和v组成的组的氨基酸的氨基酸取代。在一些情况下，在seq id no:1内的氨基酸217-736中提供aav9衣壳蛋白的氨基酸序列。在一些情况下，该靶组织是中枢神经系统(cns)。在一些情况下，该cns包括选自新皮质、基底神经节、海马体、丘脑、小脑、脑干和脊髓的区域。在一些实施例中，该靶组织是外周神经系统(pns)。在一些情况下，该pns包括神经节。在一些情况下，该神经节包括三叉神经节或背根神经节。在一些情况下，该靶组织是非分裂细胞。在一些情况下，该非分裂细胞选自神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和雪旺氏细胞(schwann cell)。在一些情况下，该脱靶组织是肝脏。在一些情况下，该aav衣壳的vp1、vp2和vp3包括氨基酸取代。在一些情况下，该氨基酸取代在对应的亲本aav衣壳蛋白的三(3)重对称轴处。在一些情况下，该氨基酸取代包括在与aav9 vp1衣壳蛋白的氨基酸序列的残基452-454、453-455、454-456、455-457或456-458相对应的氨基酸位置处的至少三个连续氨基酸，每个氨基酸独立地选自由以下组成的组：a、d、e、g、k、h、m、n、p、l、q、s、t和v。在一些情况下，该氨基酸取代包括在与aav9 vp1衣壳蛋白的氨基酸序列的残基452-455、453-456、454-457或455-458相对应的氨基酸位置处的至少四个连续氨基酸，每个氨基酸独立地选自由以下组成的组：a、d、e、
g、k、h、m、n、p、l、q、s、t和v。在一些情况下，该氨基酸取代包括在与aav9 vp1衣壳蛋白的氨基酸序列的残基452-456、453-457或454-458相对应的氨基酸位置处的至少五个连续氨基酸，每个氨基酸独立地选自由以下组成的组：a、d、e、g、k、h、m、n、p、l、q、s、t和v。在一些情况下，对应的亲本aav衣壳(或aav衣壳蛋白)是天然aav9衣壳。在一些情况下，对应的亲本aav衣壳是aav9的变体，该变体包括在seq id no:3-6中的任何一个中提供的氨基酸序列。
21.在一些情况下，在与aav9 vp1中的残基452相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代选自由以下组成的组：n452a、n452d、n452e、n452g、n452h、n452m、n452n、n452q、n452s、n452t和n452v。在一些情况下，在与aav9 vp1中的残基453相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代选自由以下组成的组：g453a、g453d、g453e、g453g、g453k、g453n、g453q、g453s、g453t和g453v。在一些情况下，在与aav9 vp1中的残基454相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代选自由以下组成的组：s454a、s454d、s454e、s454g、s454k、s454n、s454q、s454s、s454t和s454v。在一些情况下，在与aav9 vp1中的残基455相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代选自由以下组成的组：g455a、g455d、g455e、g455g、g455k、g455n、g455p、g455q、g455s和g455t。在一些情况下，在与aav9 vp1中的残基456相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代选自由以下组成的组：q456a、q456d、q456e、q456g、q456h、q456k、q456n、q456p、q456q、q456s和q456t。在一些情况下，在与aav9 vp1中的残基457相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代选自由以下组成的组：n457a、n457d、n457e、n457g、n457k、n457n、n457p、n457s、n457t和n457v。在一些情况下，在与aav9 vp1中的残基458相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代选自由以下组成的组：q458a、q458e、q458g、q458h、q458k、q458l、q458n、q458q、q458s、q458t和q458v。在一些情况下，在与aav9 vp1中的残基452-458相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代是dgaatkn(seq id no:3943)。在一些情况下，该氨基酸取代包括选自图3或表1或其组合的氨基酸序列。
22.在一些情况下，该变体aav衣壳蛋白进一步包括在与aav9 vp1的氨基酸序列中的残基588相对应的位置处的氨基酸之后插入选自由以下组成的组的氨基酸序列：tlaxpfk(seq id no:46424)、tlax(seq id no:46425)、lavx(seq id no:46426)、avpx(seq id no:46427)和vpfx(seq id no:46428)，其中x是除v以外的任何氨基酸。在一些情况下，取代包括图3中提供的氨基酸序列。
23.在一些情况下，该靶组织是大脑，并且与亲本aav衣壳或衣壳蛋白(例如，aav9)相比，该raav衣壳或其中包括的变体aav衣壳蛋白对该大脑的特异性增加。在一些情况下，该脱靶组织是肝脏，并且与亲本aav衣壳或衣壳蛋白(例如，aav9)相比，该raav衣壳或变体avv衣壳蛋白对该肝脏的特异性降低。在一些情况下，该靶组织是中枢神经系统(cns)，并且与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白(例如，aav9)相比，该raav衣壳或变体avv衣壳蛋白在该中枢神经系统(cns)中的病毒转导效率增加了至少12倍。在一些情况下，该靶组织是脊髓，并且与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体avv衣壳蛋白在该脊髓中的病毒转导效率增加了至少20倍。在一些情况下，该靶组织是神经元，并且与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体avv衣壳蛋白对该神经元的特异性增加。在一些情况下，该脱靶组织是肝脏，并且与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体avv衣壳蛋白在该肝脏中的病毒转导效率降低了至少50倍。在一些情况下，该脱靶组织是浦肯野细胞，并且与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体avv衣壳蛋白在该
浦肯野细胞中的病毒转导效率降低了至少4倍。在一些情况下，该脱靶组织是肝脏，并且与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体avv衣壳蛋白在该肝脏中的病毒转导效率降低了至少100倍。在一些情况下，该aav进一步包括编码治疗性基因表达产物的异源核酸。在一些情况下，该aav衣壳是分离的和纯化的。在一些情况下，本文描述的aav衣壳被调配为进一步包括药学上可接受的载体的药物调配物。在一些情况下，该药物调配物进一步包括编码治疗性基因表达产物的异源核酸。在一些情况下，该药物调配物进一步包括药物赋形剂。在一些情况下，该药物调配物被调配用于静脉内、动脉内、鞘内或皮下施用以治疗cns或pns的疾病或病状。
24.本文公开的方面提供了raav衣壳，该raav衣壳包括变体aav衣壳蛋白，该变体aav衣壳蛋白具有对在与选自aav9 vp1的氨基酸序列内的452-458的残基相对应的氨基酸位置处的选自由以下组成的组的氨基酸的氨基酸取代：a、d、e、g、k、h、m、n、p、l、q、s、t和v，相对于对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白，该raav衣壳和变体aav衣壳蛋白对受试者的脱靶组织具有降低的特异性和降低的转导效率中的至少一个，并且相对于对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白，该raav衣壳和变体aav衣壳蛋白对受试者的靶组织具有增加的特异性和增加的转导效率中的至少一个。在一些情况下，该raav衣壳是嵌合的。在一些情况下，该氨基酸取代在该raav衣壳的三(3)重对称轴处。在一些情况下，与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav或变体aav蛋白在其中包括使该raav在该靶组织内的定位增加。
25.在一些情况下，该靶组织是中枢神经系统(cns)或外周神经系统(pns)。在一些情况下，该cns包括选自新皮质、基底神经节、海马体、丘脑、小脑、脑干和脊髓的区域。在一些情况下，该pns包括神经节。在一些情况下，该神经节包括三叉神经节或背根神经节。在一些情况下，该靶组织是非分裂细胞。在一些情况下，该cns包括选自由以下组成的组的细胞：神经元、脊髓、星形胶质细胞、少突胶质细胞和雪旺氏细胞。在一些情况下，该脱靶组织是肝脏。
26.在一些情况下，该氨基酸取代包括在与aav9衣壳蛋白的氨基酸序列中的残基452-454、453-455、454-456、455-457或456-458相对应的氨基酸位置处的至少三个连续氨基酸，每个氨基酸独立地选自由以下组成的组：a、d、e、g、k、h、m、n、p、l、q、s、t和v。在一些情况下，该氨基酸取代包括在与aav9衣壳蛋白的氨基酸序列中的残基452-455、453-456、454-457或455-458相对应的氨基酸位置处的至少四个连续氨基酸，每个氨基酸独立地选自由以下组成的组：a、d、e、g、k、h、m、n、p、l、q、s、t和v。在一些情况下，该氨基酸取代包括在与aav9衣壳蛋白的氨基酸序列中的残基452-456、453-457或454-458相对应的氨基酸位置处的至少五个连续氨基酸，每个氨基酸独立地选自由以下组成的组：a、d、e、g、k、h、m、n、p、l、q、s、t和v。在一些情况下，该aav衣壳蛋白是aav9衣壳蛋白。
27.在一些情况下，在与aav9 vp1中的残基452相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代选自由以下组成的组：n452a、n452d、n452e、n452g、n452h、n452m、n452n、n452q、n452s、n452t和n452v。在一些情况下，在与aav9 vp1中的残基453相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代选自由以下组成的组：g453a、g453d、g453e、g453g、g453k、g453n、g453q、g453s、g453t和g453v。在一些情况下，在与aav9 vp1中的残基454相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代选自由以下组成的组：s454a、s454d、s454e、s454g、s454k、s454n、s454q、s454s、s454t和s454v。在一些情况下，在与aav9 vp1中的残基455相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代选
自由以下组成的组：g455a、g455d、g455e、g455g、g455k、g455n、g455p、g455q、g455s和g455t。在一些情况下，在与aav9 vp1中的残基456相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代选自由以下组成的组：q456a、q456d、q456e、q456h、q456h、q456k、q456n、q456p、q456q、q456s和q456t。在一些情况下，在与aav9 vp1中的残基457相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代选自由以下组成的组：n457a、n457d、n457e、n457g、n457k、n457n、n457p、n457s、n457t和n457v。在一些情况下，在与aav9 vp1中的残基458相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代选自由以下组成的组：q458a、q458e、q458g、q458h、q458k、q458l、q458n、q458q、q458s、q458t和q458v。在一些情况下，该氨基酸取代包括在选自由dgaatkn(seq id no:3943)、dgqssks(seq id no:2764)和表1中提供的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列中的至少三个连续氨基酸。在一些情况下，在seq id no:1中提供aav9 vp1的氨基酸序列。在一些情况下，在seq id no:1内的氨基酸217-736中提供aav9 vp1的氨基酸序列。例如，该aav衣壳蛋白的vp1、vp2和vp3包括氨基酸取代。在一些情况下，对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白是天然aav9 vp1衣壳。在一些情况下，该天然aav衣壳蛋白包括在seq id no:1中提供的氨基酸序列。在一些情况下，对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白是aav9的变体，该变体包括在seq id no:3-6中的任何一个中提供的氨基酸序列。
28.在一些情况下，该raav衣壳或变体aav衣壳蛋白进一步包括在该aav衣壳蛋白的氨基酸序列内的氨基酸位置588_589处对选自由以下组成的组的氨基酸序列的插入：tlaxpfk(seq id no:46424)、tlax(seq id no:46425)、lavx(seq id no:46426)、avpx(seq id no:46427)和vpfx(seq id no:46428)，其中x是除v以外的任何氨基酸。
29.在一些情况下，该靶组织是大脑，并且与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体avv衣壳蛋白对该大脑的特异性增加。在一些情况下，该脱靶组织是肝脏，并且与亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体avv衣壳蛋白对该肝脏的特异性降低。在一些情况下，该靶组织是中枢神经系统(cns)，并且与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体avv衣壳蛋白在该cns中的病毒转导效率增加了至少12倍。在一些情况下，该靶组织是脊髓，并且与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体avv衣壳蛋白在该脊髓中的病毒转导效率增加了至少20倍。在一些情况下，该靶组织是神经元，并且与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体avv衣壳蛋白对该神经元的特异性增加。在一些情况下，该脱靶组织是肝脏，并且与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体avv衣壳蛋白在该肝脏中的病毒转导效率降低了至少50倍。在一些情况下，该脱靶组织是浦肯野细胞，并且与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体avv衣壳蛋白在该浦肯野细胞中的病毒转导效率降低了至少4倍。在一些情况下，该脱靶组织是肝脏，并且与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体avv衣壳蛋白在该肝脏中的病毒转导效率降低了至少100倍。在一些情况下，本文描述的raav衣壳或变体avv衣壳蛋白是分离的和纯化的。在一些情况下，本文描述的raav衣壳或变体衣壳蛋白被调配为进一步包括药学上可接受的载体的药物调配物。在一些情况下，该药物调配物进一步包括编码治疗性基因表达产物的异源核酸。在一些情况下，该药物调配物进一步包括药物赋形剂。在一些情况下，该药物调配物被调配用于静脉内、动脉内、鞘内或皮下施用以治疗cns或pns的疾病或病状。
30.本文公开的方面提供了重组aav(raav)衣壳，该raav衣壳包括变体aav衣壳蛋白，
该变体aav衣壳蛋白包括在与选自由根据vp1编号的aav9衣壳蛋白的氨基酸序列的452-455、453-456、454-457和455-458组成的组的残基相对应的氨基酸位置处的至少四个连续氨基酸，该raav衣壳赋予了对受试者的靶组织的增加的特异性和增加的转导效率中的至少一个，其中：(a)在与残基452相对应的氨基酸位置处的氨基酸选自由以下组成的组：a、d、g、l、n、q、s和t；(b)在与残基453相对应的氨基酸位置处的氨基酸选自由以下组成的组：a、g、n、p、q、r、s和t；(c)在与残基454相对应的氨基酸位置处的氨基酸选自由以下组成的组：a、d、g、n、s和t；(d)在与残基455相对应的氨基酸位置处的氨基酸选自由以下组成的组：a、d、g、k、n、p、q、s和t；(e)在与残基456相对应的氨基酸位置处的氨基酸选自由以下组成的组：a、g、k、n、p、r、s和t；(f)在与残基457相对应的氨基酸位置处的氨基酸选自由以下组成的组：a、g、k、n、p、r、s、t和v；并且(g)在与残基458相对应的氨基酸位置处的氨基酸选自由以下组成的组：a、g、k、l、r、s、t和v。在一些情况下，该aav衣壳蛋白在与选自由aav9 vp1的452-455、453-456、454-457和455-458组成的组的残基相对应的氨基酸位置处不含有氨基酸序列ilgtgts(seq id no:45479)、qssqtpr(seq id no:45479)或tlavpfk(seq id no:45477)。在一些情况下，该氨基酸取代在该raav衣壳的三(3)重对称轴处。在一些情况下，在将该raav衣壳全身施用到该受试者后，测量特异性或转导效率。在一些情况下，全身施用包括动脉内、静脉内或皮下施用。在一些情况下，该raav衣壳或其中的变体aav衣壳蛋白来自aav9。在一些情况下，与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav或变体aav蛋白在其中包括使该raav在该靶组织内的定位增加。
31.在一些情况下，取代包括图3中提供的氨基酸序列。在一些此类情况下，在选自由以下组成的组的氨基酸序列中提供该至少四个连续氨基酸：lqtsspg(seq id no:2933)、sintktn(seq id no:45475)、ergantk(seq id no:5192)、ttgghss(seq id no:2743)、gttktse(seq id no:3064)、gtgtsvl(seq id no:11958)和gtpskag(seq id no:2741)。在一些情况下，取代包括在图2中提供的氨基酸序列。在一些此类情况下，在选自由以下组成的组的氨基酸序列中提供该至少四个连续氨基酸：qqgkqsv(seq id no:79)、sngtkqt(seq id no:442)、gsgktaa(seq id no:88)、mgdkptr(seq id no:2466)、qpsggnt(seq id no:2672)和nqsgtkg(seq id no:780)。在一些情况下，在选自由以下组成的组的氨基酸序列中提供该至少四个连续氨基酸：lqtsspg(seq id no:2933)、qqgkqsv(seq id no:79)、sintktn(seq id no:45475)、sngtkqt(seq id no:442)、gsgktaa(seq id no:88)、mgdkptr(seq id no:2466)、qpsggnt(seq id no:2672)、ergantk(seq id no:5192)、ttgghss(seq id no:2743)、gttktse(seq id no:3064)、gtgtsvl(seq id no:11958)、nqsgtkg(seq id no:780)和gtpskag(seq id no:2741)。在一些情况下，在表2中提供的氨基酸序列中提供该至少四个连续氨基酸。在一些情况下，该靶组织是中枢神经系统(cns)。在一些情况下，该cns包括选自新皮质、基底神经节、海马体、丘脑、小脑、脑干和脊髓的区域。在一些实施例中，该靶组织是外周神经系统(pns)。在一些情况下，该pns包括神经节。在一些情况下，该神经节是三叉神经节或背根神经节。在一些情况下，该靶组织是非分裂细胞。在一些情况下，该cns包括选自由以下组成的组的细胞：神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和雪旺氏细胞。在一些情况下，该靶组织是cns，并且与亲本aav衣壳或aav衣壳蛋白相比，该aav衣壳在该cns中的病毒转导效率增加了至少12倍。在一些情况下，该靶组织是大脑，并且与亲本aav衣壳或aav衣壳蛋白相比，该aav衣壳对该大脑的特异性增加。在一些情况下，该
靶组织是脊髓，并且与亲本aav衣壳或aav衣壳蛋白相比，该aav衣壳在该脊髓中的病毒转导效率增加了至少20倍。在一些情况下，该靶组织是神经元，并且与亲本aav衣壳或aav衣壳蛋白相比，该aav衣壳对该神经元的特异性增加。在一些情况下，本文描述的raav衣壳或变体aav衣壳蛋白是分离的和纯化的。在一些情况下，本文描述的raav衣壳或变体aav蛋白被调配为进一步包括药学上可接受的载体的药物调配物。在一些情况下，该药物调配物进一步包括编码治疗性基因表达产物的异源核酸。在一些情况下，该药物调配物进一步包括药物赋形剂。在一些情况下，该药物调配物被调配用于静脉内、动脉内、鞘内或皮下施用以治疗cns或pns的疾病或病状。
32.本文公开的方面提供了raav衣壳，该raav衣壳包括aav衣壳蛋白，该aav衣壳蛋白包括来自图2或表2中提供的氨基酸序列的至少四个连续氨基酸，该至少四个连续氨基酸在与选自由aav9 vp1的452-455、453-456、454-457和455-458组成的组的残基相对应的氨基酸位置处，当在受试者的靶组织中测量时，与亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳赋予了增加的特异性和增加的转导效率中的至少一个。在一些情况下，该至少四个连续氨基酸在该raav衣壳的三(3)重对称轴处。在一些情况下，该aav衣壳蛋白在与选自由aav9 vp1的452-455、453-456、454-457和455-458组成的组的残基相对应的氨基酸位置处不含有氨基酸序列ilgtgts(seq id no:45479)、qssqtpr(seq id no:45479)或tlavpfk(seq id no:45477)。在一些情况下，在将该aav衣壳全身施用到该受试者后，测量特异性或转导效率。在一些情况下，该raav衣壳是嵌合的。在一些情况下，与亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav或变体aav蛋白在其中包括使该raav在该靶组织内的定位增加。
33.在一些情况下，该至少四个连续氨基酸包括在选自由以下组成的组的氨基酸序列中的至少四个、五个、六个或七个连续氨基酸：lqtsspg(seq id no:2933)、qqgkqsv(seq id no:79)、sintktn(seq id no:45475)、sngtkqt(seq id no:442)、gsgktaa(seq id no:88)、mgdkptr(seq id no:2466)、qpsggnt(seq id no:2672)、ergantk(seq id no:5192)、ttgghss(seq id no:2743)、gttktse(seq id no:3064)、gtgtsvl(seq id no:11958)、nqsgtkg(seq id no:780)和gtpskag(seq id no:2741)。
34.在一些情况下，该靶组织是中枢神经系统(cns)。在一些情况下，该cns包括选自新皮质、基底神经节、海马体、丘脑、小脑、脑干和脊髓的区域。在一些实施例中，该靶组织是外周神经系统(pns)。在一些情况下，该pns包括神经节。在一些情况下，该神经节是三叉神经节或背根神经节。在一些情况下，该靶组织是非分裂细胞。在一些情况下，该cns包括选自由以下组成的组的细胞：神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和雪旺氏细胞。
35.在一些情况下，该raav衣壳或其中包括的变体aav衣壳蛋白进一步包括在与aav9 vp1的氨基酸序列中的残基588_589相对应的氨基酸位置处对选自由以下组成的组的氨基酸序列的插入：tlaxpfk(seq id no:46424)、tlax(seq id no:46425)、lavx(seq id no:46426)、avpx(seq id no:46427)和vpfx(seq id no:46428)，其中x是除v以外的任何氨基酸。在一些情况下，亲本aav衣壳或衣壳蛋白是aav9。在一些情况下，在seq id no:1中提供aav9衣壳蛋白的氨基酸序列。在一些情况下，在seq id no:1内的氨基酸217-736中提供aav9衣壳蛋白的氨基酸序列。
36.在一些情况下，该靶组织是大脑，并且与亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体aav衣壳蛋白对该大脑的特异性增加。在一些情况下，该靶组织是cns，并且与亲本
aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体aav衣壳蛋白在该cns中的病毒转导效率增加了至少12倍。在一些情况下，该靶组织是脊髓，并且与亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体aav衣壳蛋白在该脊髓中的病毒转导效率增加了至少20倍。在一些情况下，该靶组织是神经元，并且与亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体aav衣壳蛋白对该神经元的特异性增加。在一些情况下，本文描述的raav衣壳或变体aav衣壳蛋白是分离的和纯化的。在一些情况下，本文描述的raav衣壳或变体aav衣壳蛋白被调配为进一步包括药学上可接受的载体的药物调配物。在一些情况下，该药物调配物进一步包括编码治疗性基因表达产物的异源核酸。在一些情况下，该药物调配物进一步包括药物赋形剂。
37.本文提供的方面提供了raav衣壳，该raav衣壳包括变体aav衣壳蛋白，当在受试者的靶组织中测量时，相对于对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白，该raav衣壳具有增加的特异性和增加的转导效率中的至少一个，该aav衣壳蛋白包括在与选自由aav9vp1中的452-454、453-455、454-456、455-457和456-458组成的组的残基相对应的氨基酸位置处的三个氨基酸(x1-x2-x3)，其中：(a)xi选自由以下组成的组：n、k、r、l和t；(b)x2选自由以下组成的组：n、s、l、e、d和p；并且(c)x3选自由以下组成的组：n、s、a、d、g、l和t。在一些情况下，该靶组织选自由以下组成的组：肺、心脏、肠、肾脏和胃。在一些情况下，该靶组织是非分裂细胞。在一些情况下，该组织是肺，并且氨基酸序列是kdntpgr(seq id no:32538)或图13中提供的任何氨基酸序列。在一些情况下，该组织是肺，并且氨基酸序列是nnlprnl(seq id no:32867)或图13中提供的任何氨基酸序列。在一些情况下，该组织是肠，并且氨基酸序列是resspsl(seq id no:29065)或图5中提供的任何氨基酸序列。在一些情况下，该组织是肾脏，并且氨基酸序列是rvplsti(seq id no:26933)或图6中提供的任何氨基酸序列。在一些情况下，该aav衣壳蛋白是aav9衣壳蛋白。在一些情况下，在seq id no:1中提供该aav9衣壳蛋白。在一些情况下，该aav衣壳蛋白进一步包括在选自由452-455、453-456、454-457和455-458组成的组的氨基酸位置处的四个氨基酸，其中x4选自由t、s、p和l组成的组。在一些情况下，该aav衣壳蛋白进一步包括在选自由452-456、453-457和453-458组成的组的氨基酸位置处的五个氨基酸，其中x5选自由p、r和s组成的组。在一些情况下，该aav衣壳蛋白进一步包括在氨基酸位置452-457或453-458处的六个氨基酸，其中x6选自由n、g、s和t组成的组。在一些情况下，该aav衣壳蛋白进一步包括在氨基酸位置452-458处的七个氨基酸，其中x7选自由r、l和i组成的组。在一些情况下，该aav衣壳蛋白的vp1、vp2和vp3包括氨基酸序列。在一些情况下，对应的亲本aav衣壳是天然aav9衣壳。在一些情况下，在seq id no:1中提供该天然aav9衣壳的vp1蛋白的氨基酸序列。在一些情况下，对应的亲本aav是天然aav5衣壳。在一些情况下，在seq id no:2中提供该天然aav5衣壳的vp1蛋白的氨基酸序列。
38.在一些情况下，当在受试者中测量时，与对应的亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，本文描述的raav或变体aav衣壳蛋白具有对靶组织的增加的特异性和增加的转导效率中的至少一个。在一些情况下，该靶组织是肺细胞类型，该肺细胞类型是肺泡ii型上皮(atii)细胞，并且与亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体aav衣壳在该atii细胞中的病毒转导效率增加了至少60倍。在一些情况下，该靶组织是肺细胞类型，该肺细胞类型是atii细胞，并且与亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体aav衣壳在该atii细胞中的病毒转导效率增加了至少60倍。在一些情况下，与亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体aav衣壳在该肺中的病毒转导效率增加了至少15倍。在一些情况下，与亲本aav衣
壳或衣壳蛋白相比，该raav衣壳或变体aav衣壳在该肺中的病毒转导效率增加了至少30倍。还设想了包括这些aav衣壳蛋白的aav衣壳。在一些情况下，本文描述的raav衣壳或变体aav衣壳是分离的和纯化的。在一些情况下，本文描述的raav衣壳或变体aav衣壳被调配为进一步包括药学上可接受的载体的药物调配物。在一些情况下，该药物调配物进一步包括编码治疗性基因表达产物的异源核酸。在一些情况下，该药物调配物进一步包括药物赋形剂。在一些情况下，该药物调配物被调配用于静脉内、动脉内、皮下或鼻内施用以治疗靶组织的疾病或病状。
39.本文公开的方面提供了raav衣壳，这些raav衣壳包括变体aav衣壳蛋白，这些变体aav衣壳蛋白包括在与选自由aav9 vp1中的452-454、453-455、454-456、455-457和456-458组成的组的残基相对应的氨基酸位置处的三个氨基酸，其中在图4-图14中的一个或多个图中提供的氨基酸序列中提供该三个氨基酸。在一些情况下，当在受试者的靶组织中测量时，该raav衣壳或变体aav衣壳蛋白具有增加的特异性和增加的转导效率中的至少一个。在一些情况下，该靶组织选自由以下组成的组：肺、肠、肝脏、胃、心脏、肌肉、动物脂肪组织、脾脏、肾脏或生殖器官(例如，睾丸、卵巢)。在一些情况下，该靶组织是非分裂细胞。在一些情况下，在图4中提供了该氨基酸序列。在一些情况下，在图5中提供了该氨基酸序列。在一些情况下，在图6中提供了该氨基酸序列。在一些情况下，在图7中提供了该氨基酸序列。在一些情况下，在图8中提供了该氨基酸序列。在一些情况下，在图9中提供了该氨基酸序列。在一些情况下，在图10中提供了该氨基酸序列。在一些情况下，在图11中提供了该氨基酸序列。在一些情况下，在图12中提供了该氨基酸序列。在一些情况下，在图13中提供了该氨基酸序列。在一些情况下，在图14中提供了该氨基酸序列。在一些情况下，与亲本aav衣壳或衣壳蛋白相比，该raav或变体aav蛋白在其中包括使该raav在该靶组织内的定位增加。
40.在一些情况下，亲本aav衣壳天然aav9。在一些情况下，在seq id no:1中提供该天然aav9衣壳蛋白的vp1蛋白的氨基酸序列。
41.在一些情况下，该三个氨基酸进一步包括在与选自由aav9 vp1的452-455、453-456、454-457和455-458组成的组的残基相对应的氨基酸位置处的四个氨基酸，其中在图4-图14中的一个或多个图中提供该氨基酸序列。在一些情况下，该三个氨基酸包括在与选自由aav9 vp1的452-456、453-457和453-458组成的组的残基相对应的氨基酸位置处的五个氨基酸，其中在图4-图14中的一个或多个图中提供该氨基酸序列。在一些情况下，该三个氨基酸进一步包括在与残基452-457或453-458相对应的氨基酸位置处的六个氨基酸，其中在图4-图14中的一个或多个图中提供该氨基酸序列。在一些情况下，该三个氨基酸进一步包括在与残基452-458相对应的氨基酸位置处的七个氨基酸，其中在图4-图14中的一个或多个图中提供该氨基酸序列。在一些情况下，该raav衣壳的vp1、vp2和vp3包括该氨基酸序列。在一些情况下，本文描述的raav衣壳或变体aav衣壳蛋白是分离的和纯化的。在一些情况下，本文描述的aav衣壳或变体aav衣壳蛋白被调配为进一步包括药学上可接受的载体的药物调配物。在一些情况下，该药物调配物进一步包括编码治疗性基因表达产物的异源核酸。在一些情况下，该药物调配物进一步包括药物赋形剂。在一些情况下，该药物调配物被调配用于静脉内、动脉内、皮下或鼻内施用以治疗靶组织的疾病或病状。
42.本文公开的方面提供了治疗受试者的疾病或病状的方法，这些方法包括向该受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物包括本文公开的raav衣壳，该raav衣壳使编码治疗
性基因表达产物的核酸序列衣壳化。在一些情况下，哺乳动物受试者是灵长类动物。在一些情况下，哺乳动物受试者是非人类灵长类动物。在一些情况下，哺乳动物受试者是人。在一些情况下，该治疗性基因表达产物是蛋白质。在其它情况下，该治疗性基因表达产物是rna，例如小干扰rna(sirna)、短发夹状rna(shrna)或微小rna(mirna)。在一些情况下，施用包括静脉内或鼻内施用。在一些情况下，该疾病或病状是中枢神经系统或外周神经系统的疾病或病状。在一些情况下，该疾病或病状是cns或pns的疾病或病状。在一些情况下，该疾病或病状选自由以下组成的组：肾上腺脑白质营养不良、阿尔茨海默氏病(alzheimer's disease)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、天使综合征(angelman syndrome)、共济失调毛细血管扩张症、夏-马-图综合征(charcot-marie-tooth syndrome)、经典肢近端型点状软骨发育不良(rcdp)、科克因综合征(cockayne syndrome)、耳聋、dravet综合征、杜氏肌营养不良症、癫痫症、特发性震颤、脆性x综合征、弗里德希氏共济失调(friedreich's ataxia)、额颞叶痴呆(ftd)、戈谢病(gaucher disease)、恶性胶质瘤、亨廷顿病(huntington disease)、小儿雷夫叙姆病(infantile refsum disease，ird)、莱施-奈恩综合征(lesch-nyhan syndrome)、枫糖尿症、麦肯斯氏综合征(menkes syndrome)、强直性肌营养不良、发作性睡病、神经纤维瘤病、尼曼匹克病(niemann-pick disease)、帕金森病(parkinson disease)、苯丙酮尿症、普拉德-威利综合征(prader-willi syndrome)、雷夫叙姆病(refsum disease)、雷特综合征(rett syndrome)、脊髓性肌萎缩、脊髓小脑性共济失调、丹吉尔病(tangier disease)、泰-萨克斯病(tay-sachs disease)、结节性硬化症、冯
·
希佩尔-林道综合征(von hippel-findau syndrome)、威廉斯综合征(williams syndrome)、威尔逊氏病(wilson'sdisease)和泽尔韦格氏综合征(zellweger syndrome)。在一些情况下，该治疗性基因表达产物有效地调节了选自由以下组成的组的靶基因或基因表达产物的活性或表达：肌聚糖α(sgca)、谷氨酸脱羧酶65(gad65)、谷氨酸脱羧酶67(gad67)、cfn2、神经生长因子(ngf)、运动神经元存活基因(survival of motor neuron)1、端粒(smn1)、因子x(fix)、类视黄醇异构水解酶(retinoid isomerohydrolase)(rpe65)、肌浆网/内质网ca2+-atp酶(serca2a)、β-葡糖脑苷脂酶(gcase)、共济蛋白(frataxin，fxn)、亨廷顿蛋白(huntingtin，htn)、甲基-cpg结合蛋白2(mecp2)、过氧化物酶体生物发生因子(pex)、颗粒蛋白前体(grn)、抗微管蛋白剂、铜锌超氧化物歧化酶(sod1)、葡萄糖基神经酰胺酶β(gba)、npc细胞内胆固醇转运体1(npc1)和nfrp3炎性小体。在一些情况下，该治疗性基因表达产物包括基因编辑组件。在一些情况下，这些基因编辑组件选自由以下组成的组：人工位点特异性rna核酸内切酶(asre)、锌指核酸内切酶(zfn)、转录因子样效应物核酸酶(talen)、成簇的规则间隔的短回文重复序列(crispr)/cas酶以及crispr/cas导向rna。
43.本文公开的方面包括质粒载体，该质粒载体包括编码本文描述的aav衣壳的核酸序列。在一些情况下，该质粒载体是细菌。在一些情况下，该质粒载体衍生自大肠杆菌(escherichia coli.)。在一些情况下，该核酸序列在5'到3'方向上包括：(1)5'反向末端重复(itr)序列、(2)复制(rep)基因、(3)衣壳(cap)基因和(4)3'itr，其中该cap基因编码本文描述的aav衣壳蛋白。在一些情况下，该质粒载体编码假型aav衣壳蛋白。在一些情况下，该cap基因衍生自seq id no:6-10中的任一个中提供的脱氧核糖核酸(dna)。在一些情况下，包括该cap基因的该核酸序列与seq id no:46364-46383中提供的dna序列中的任一个dna序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些情
况下，该5'itr和该3'itr衍生自aav2血清型。在一些情况下，该5'itr和该3'itr衍生自aav5血清型。在一些情况下，该5'itr和该3'itr衍生自aav9血清型。
44.本文公开的方面提供了制造方法，这些制造方法包括：(a)将包括以下的核酸引入到细胞中：(i)编码治疗性基因表达产物的第一核酸序列，该第一核酸序列在其5'和3'端侧接有反向末端重复(itr)序列；(ii)编码病毒基因组的第二核酸序列，该第二核酸序列包括5'itr序列、复制(rep)基因、衣壳(cap)基因和3'itr，其中该cap基因编码本文描述的aav衣壳蛋白；以及(iii)编码选自由e4orf6、e2a和va rna组成的组的第一辅助病毒蛋白和任选地包括ela或elb55k的第二辅助病毒蛋白的第三核酸序列；(b)在该细胞中表达本文描述的aav衣壳蛋白；(c)组装包括本文公开的aav衣壳蛋白的aav颗粒；以及(d)将该第一核酸序列包装在该aav颗粒中。在一些情况下，该核酸包括在质粒中，并且细胞是哺乳动物类的。在一些情况下，该细胞是永生的。在一些情况下，该永生的细胞是胚胎干细胞。在一些情况下，该胚胎干细胞是人胚胎干细胞。在某些情况下，该人胚胎干细胞是人胚胎肾293(hek-293)细胞。在其它情况下，该核酸包括在病毒(例如，杆状病毒)中。在一些此类情况下，该细胞是昆虫细胞。在某些此类情况下，该细胞是sf9细胞。在一些情况下，该cap基因衍生自seq id no:6-10中的任一个中提供的脱氧核糖核酸(dna)。在一些情况下，包括该cap基因的该核酸序列与seq id no:46364-46383中提供的dna序列中的任一个dna序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些情况下，该5'itr和该3'itr衍生自aav2血清型。在一些情况下，该5'itr和该3'itr衍生自aav5血清型。在一些情况下，该5'itr和该3'itr衍生自aav9血清型。在一些情况下，该第一核酸序列(编码治疗性基因表达产物)和该第二核酸序列(编码该cap基因)是反式的。在一些情况下，该第一核酸序列和该第二核酸序列是顺式的。在一些情况下，该第一核酸序列、该第二核酸序列和该第三核酸序列(编码辅助病毒)是反式的。
45.本文公开的方面提供了试剂盒，该试剂盒包括：(a)第一载体，该第一载体包括编码病毒基因组的第一核酸序列，该第一核酸序列在5'到3'方向上包括：(i)5'反向末端重复(itr)序列；(ii)复制(rep)基因；(iii)编码本文描述的aav衣壳蛋白的衣壳(cap)基因；以及(iv)3'itr；以及(b)任选的第二载体，该第二载体包括编码辅助病毒蛋白的第二核酸序列，该辅助病毒蛋白包括e4orf6、e2a、va rna、ela和elb55k中的至少一个。在一些情况下，该试剂盒进一步包括细胞。在一些情况下，该细胞是哺乳动物类的。在一些情况下，该细胞是永生的。在一些情况下，该永生的细胞是胚胎干细胞。在一些情况下，该胚胎干细胞是人胚胎干细胞。在一些情况下，该人胚胎干细胞是人胚胎肾293(hek-293)细胞。在一些情况下，该试剂盒进一步包括包含编码治疗性基因表达产物的异源核酸的载体。在一些情况下，该载体是游离体。
46.通过引用的方式并入
47.本说明书中所提及的所有公开、专利以及专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开、专利或专利申请被专门地且单独地指示通过引用并入。
附图说明
48.在所附权利要求中具体阐述了实施例。通过参考阐述了说明性实施例的以下详细描述以及附图，将获得对本发明的这些特征和优势的更好理解，在所述说明性实施例中利
用了本发明的原理。本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。应强调的是，根据惯例，附图的各种特征不是按比例绘制的。相反，为了清晰起见，各种特征的尺寸可以任意扩大或缩小。附图中包含以下图：
49.图1a-1d示出了根据本实施例的病毒工程化概述。图1a示出了包括aav9的3重对称(带圆圈)的三种单体的表面模型，其展示了在此文库中引入的7氨基酸取代(红色)的定位在氨基酸452-458处，并且aav-php.eb先前引入的2氨基酸取代和7氨基酸插入(绿色)在氨基酸588-589处。图1b示出了两个环在单个aav9单体内的位置，其指示了环的接近度以及其与衣壳表面的关系(aav内部向下，外部向上)。图1c示出了由一种aav9单体的588(左)和455(右)环与第二单体的495(中间)环相互作用而产生的尖峰。图1d示出了工程化过程的示意图(公开为seq id no 45492-45493的“tatt nnknnk...nnknnk caac”和公开为seq id no 45494-45495的“tatt aacggt...aatcaa caac”)。使用pcr，将多样性以9氨基酸取代/插入(aav-php.eb；绿色条带)和/或取代(aa 452-458；红色条带)的形式引入在聚腺苷酸化序列周围携带有cre可诱导开关的raav9基因组中。将dna衣壳文库转染到hek-293t细胞中，并在60小时后收获各种病毒衣壳文库。将病毒文库全身性注射到一组cre转基因动物中。在表达三周后，收获组织，并且从所有器官中提取dna。使用pcr，仅从那些转导cre+细胞的衣壳中选择性地回收序列，从而翻转其聚腺苷酸化序列。回收的序列随后通过pcr、添加每种特定cre组织组合所特有的双索引条形码而准备用于下一代测序(ngs)。在ngs之后，使用针对富集(与其它序列相比，特定组织内的流行率增加，并相对于其在注射的病毒文库中的存在进行归一化)和特异性(与其它组织或细胞类型相比，特定组织或细胞类型内的流行率增加)的正向和负向选择来挖掘数据。在一到两个轮次的选择之后，基于各种变体的富集和特异性评分来对该各种变体进行测试。呈斜体形式的序列表示aav9，其在肝脏(右)中高度富集，而不在大脑(左)中高度富集。
50.图2示出了在两个轮次的体内选择后，在中枢神经系统(cns)中正向富集的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。
51.图3示出了在两个轮次的体内选择之后，具有对cns具有特异性并且使肝脏去靶的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。“富集”是与给定变体在施用于转基因动物的病毒文库中的流行率相比，该给定变体在组织中的流行率。富集评分高于1指示正向富集；并且富集评分小于0指示负向富集。富集评分为0指示无法在组织中检测到变体。
52.图4示出了在两个轮次的体内选择后，具有对心脏具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。
53.图5示出了在两个轮次的体内选择后，具有对肠具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。
54.图6示出了在两个轮次的体内选择后，具有对肾脏具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。
55.图7示出了在两个轮次的体内选择后，具有对肝脏具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。
56.图8示出了在两个轮次的体内选择后，具有对肌肉具有特异性的向性的7聚体变体
aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。
57.图9示出了在两个轮次的体内选择后，具有对胰腺具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。
58.图10示出了在两个轮次的体内选择后，具有对脾脏具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。
59.图11示出了在两个轮次的体内选择后，具有对胃具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。
60.图12示出了在两个轮次的体内选择后，具有对睾丸具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。
61.图13示出了在两个轮次的体内选择后，具有对肺具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。
62.图14示出了在两个轮次的体内选择后，具有对动物脂肪组织具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。
63.图15a-15b示出了下一代测序数据和候选变体的体内转导效率。图15a示出了两种候选变体aav.cap-a4和aav.cap-a14以及随机选择的变体的相对对数富集丰度。ngs数据示出aav.cap-a4在肺中现在富集，在若干个外周器官中负向富集。相反，aav.cap-a14在胃和肠内的神经元中富集，并且在如肺等其它器官中负向富集。图15b示出了在全身施用5
×
10
11
vg的raav:cag-mneongreen 2周后的体内转导证实了2a中的ngs数据，其中当与aav9相比时，aav.cap-a4强烈地转导肺，并且aav.cap-a14更强烈地转导胃和肠中的神经元。为了避免疑问，aav.cap-a4是kdntpgr，其在seq id no:32538(在肺中富集)、seq id no:25633(在心脏中富集)、seq id no:26584(在肠中富集)和seq id no:28509(在肾脏中富集)中提供。aav.cap-a14是resspsl，其在seq id no:26474(在肠中富集)、seq id no:29065(在肾脏中富集)和seq id no:31904(在胃中富集)中提供。
64.图16a-16d示出了aav.cap-a4的向性强烈地富集于肺内的粘膜下细胞中。将ssaav9:cag-nlsx2-egfp、ssaav5:cag-nlsx2-egfp或ssaav.cap-a4:cag-nlsx2-egfp以1
×
10
11
vg/小鼠静脉内注射到成年雄性小鼠中。在表达三周后评估gfp荧光。图16a提供了由aav.cap-a4转导的细胞总数与其亲本衣壳aav9相比的比较。图16b示出了与aav5和aav9相比，通过egfp表达评估的总转导增加了15-30倍。图16c提供了通过egfp信号与抗体染色的共定位评估的细胞类型特异性定量，并且示出atii细胞的aav.cap-a4转导与aav5和aav9相比(分别)增加了30-60倍。由aav.cap-a4转导的大量细胞是肺泡ii型肺细胞。图16d示出了细胞类型特异性的定量，其中在肺中转导的60％的细胞被鉴定为atii细胞。对于定量：n＝每组(对于aav9、aav5和aav.cap-a4)3只小鼠，平均值
±
se，单向方差分析(anova)(*p《0.05；n.s.，p》0.05)。比例尺为50μm。
65.图17a-17e示出了aav-php.eb中的7氨基酸(aa)取代文库的表征。图17a示出了aav-php.eb中的7氨基酸取代的分布，其示出了在pcr生成dna文库并且包装病毒衣壳文库之后相对均匀的分布(具有少数值得注意的例外)，终止密码子的流行率低，并且没有偏向野生型(wt)aav9序列(ngsgqnq(seq id no:545)。图17b示出了从两个轮次的正向和负向选择中获得的表现最佳的变体的子集(seq id no:45496-45513，分别按出现顺序)，其示出了与wt aav9序列的强烈差异。ti：在位置450-451处存在的苏氨酸和异亮氨酸残基；qt：在位
置459-460处存在的谷氨酰胺和苏氨酸残基。图17c示出了热图，该热图绘制了表现最佳的子集的对数富集评分，证明了对神经元群体(aav-php.eb所偏向的靶标)的特异性以及在该神经元群体中的富集。图17d示出了将ssaav9:cag-mneongreen、ssaav-php.eb:cag-mneongreen、ssaav.cap-b1:cag-mneongreen(lqtsspg；seq id no:2933)、ssaav.cap-b2:cag-mneongreen(qqgkqsv；seq id no:79)、ssaav.cap-b4:cag-mneongreen(sintktn；seq id no:45475)和ssaav.cap-b7:cag-mneongreen(sngtkqt；seq id no:442)以5
×
10
11
vg/小鼠静脉内注射到成年雄性小鼠中，并且在两周后评估mneongreen荧光。图17e示出了将ssaav.cap-b8:cag-mneongreen(gsgktaa；seq id no:88)、ssaav.cap-b9:cag-mneongreen(mgdkptr；seq id no:2466)、ssaav.cap-b10:cag-mneongreen(dgaatkn；seq id no:3943)、ssaav.cap-b11:cag-mneongreen(qpsggnt；seq id no:2672)、ssaav.cap-b14:cag-mneongreen(ergantk；seq id no:5192)、ssaav.cap-b16:cag-mneongreen(ttgghss；seq id no:2743)、ssaav.cap-b17:cag-mneongreen(gttktse；seq id no:3064)、ssaav.cap-b18:cag-mneongreen(gtgtsvl；seq id no:11958)、ssaav.cap-b19:cag-mneongreen(nqsgtkg；seq id no:780)、ssaav.cap-b22:cag-mneongreen(dgqssks；seq id no:2764)、ssaav.cap-b23:cag-mneongreen(kgpgqmg；seq id no:45476)或ssaav.cap-b25:cag-mneongreen(gtpskag；seq id no:2741)以5
×
10
11
vg/小鼠静脉内注射到成年雄性小鼠中，并且在两周后评估mneongreen荧光。在图17d和图17e中，表现最佳的变体的转导谱的直接比较表明经验证的向性与通过ngs数据预测的向性之间具有很强的相关性。比例尺为2mm。
66.图18a-18d示出了aav.cap-b 10的向性强烈地偏向大脑，其中肝脏去靶明显。将ssaav9:cag-nlsx2-egfp、ssaav-php.eb:cag-nlsx2-egfp或ssaav.cap-b10:cag-nlsx2-egfp以1
×
10
11
vg/小鼠静脉内注射到成年雄性小鼠中。在表达三周后评估gfp荧光。图18a示出了在aav9、aav-php.eb和aav.cap-b10中bbb穿越和大脑转导的比较，其示出了在wt衣壳的迭代工程化之后大脑中转导效率的逐渐增加。图18b示出了在肝脏中的相同比较，其示出了转导效率的逐渐降低。图18c提供了在大脑中转导的细胞总数的定量，并且示出了与aav-php.eb相比，aav.cap-b10的总转导没有显著增加，与aav9相比，两者均显著增加。每个细胞的平均亮度的比较表明aav显著增加。cap-b10超过aav9，但不超过aav-php.eb。图18d提供了在肝脏中转导的细胞总数的定量，并且示出了aav.cap-b10与aav9和aav-php.eb两者相比都显著减少。当比较aav.cap-b10和aav9时，每个细胞的亮度也显著降低，其中在aav-php.eb的情况下未观察到显著差异。对于定量：n＝每组6只小鼠，平均值
±
se，brown-forsythe和welch方差分析检验(针对转导)以及克鲁斯卡尔-沃利斯检验(kruskal-wallis test)(针对亮度)(*p≤0.05；n.s.，p≥0.05)。比例尺为1mm。
67.图19a-f示出在大脑内，aav.cap-b10强烈偏向神经元。将ssaav-php.eb:cag-nlsx2-egfp或ssaav.cap-bb10:cag-nlsx2-egfp以1
×
10
11
vg/小鼠静脉内注射到成年雄性小鼠中。在表达三周后评估gfp荧光。图19a-19b示出了在多个大脑区域中，与aav-php.eb相比，aav.cap-b10示出了转导的神经元总数无明显增加。图19c-19d示出了与aav-php.eb相比，aav.cap-b10示出了在定量的所有大脑区域中星形胶质细胞的转导显著降低。图19e-19f示出了与aav-php.eb相比，aav.cap-b10示出了在定量的所有大脑区域中少突胶质细胞的转导显著降低。对于定量：n＝每组6只小鼠，平均值
±
se，曼-惠特尼检验(mann-whitney test)(*p《0.05；n.s.，p》0.05)。比例尺为200μm。
68.图20a-20c示出了在7聚体取代中的氨基酸对富集在大脑中并从肝脏去靶的变体的贡献。图20a示出了在7聚体取代中的氨基酸对富集在大脑中的变体的贡献。图20b示出了在7聚体取代中的氨基酸对从肝脏负向富集(去靶)的变体的贡献。图20c示出了在7聚体取代中的氨基酸对富集在大脑中并且从肝脏负向富集(去靶)的变体的贡献。分析了在hsyn-cre动物的大脑中具有最高富集的1000个变体、在tek-cre动物的肝脏中具有最低富集的1000个变体以及在大脑中具有正向富集并且在肝脏中具有负向富集的所有变体。绘制了所有氨基酸在每个位置处的z-评分。
69.图21示出了aav.cap-b10从外周器官去靶。将ssaav9:cag-nlsx2-egfp、ssaav-php.eb:cag-nlsx2-egfp或ssaav.cap-b10:cag-nlsx2-egfp以1
×
1011vg/小鼠静脉内注射到成年雄性小鼠中。在表达三周后评估gfp荧光。在脊髓转导中，aav.cap-b10在外周组织中的转导效率当与aav9或aav-php.eb相比时分别显著提高和降低。在drg中，aav.cap-b10当与aav9相比时显著降低，并且当与aav-php.eb相比时显著降低。在肠的肠肌丛和粘膜下丛中，aav.cap-b10与aav9相比显著降低，并且与aav-php.eb相比无明显降低。在肺中，aav.cap-b10当与aav-php.eb相比时显著降低，并且与aav9相比无明显降低。在肾脏、脾脏、胰腺和睾丸中，aav.cap-b10当与aav9相比时显著降低，并且与aav-php.eb相比显著降低。对于定量：n＝每组6只小鼠，脊髓和drg除外，其中n＝3只小鼠(对于aav9和aav-php.eb)并且n＝5只小鼠(对于aav.cap-b10)，平均值
±
se，方差分析(对于脊髓)，brown-forsythe和welch方差分析检验(对于肠肌丛和胰腺)，克鲁斯卡尔-沃利斯检验(对于drg、粘膜下丛、肺、肾脏、脾脏和睾丸)(*p《0.05；n.s.，p》0.05)。
70.图22a-22b示出了aav.cap-b10从小脑中的浦肯野细胞明显去靶。将ssaav-php.eb:cag-nlsx2-egfp或ssaavcap-b10:cag-nlsx2-egfp以1
×
10
11
vg/小鼠静脉内注射到成年雄性小鼠中。在表达三周后评估gfp荧光。图22a示出了小脑切片中的免疫荧光。图22b示出了小脑中的浦肯野细胞转导的定量，并且示出了当与aav-php.eb相比时，由aav.cap-b10转导的浦肯野细胞明显更少。对于定量：n＝每组6只小鼠，平均值
±
se，曼-惠特尼检验(*p《0.05；n.s.，p》0.05)。比例尺为200μm。
71.图23a-23f示出了在非人灵长类动物中汇集表达的特征。图23a示出了用于汇集注射新型变体aav.cap-b1、aav.cap-b2、aav.cap-b8、aav.cap-b10、aav.cap-b18和aav.cap-b22以及对照aav9和aav-php.eb的实验范例。在普遍存在的cag启动子的控制下，将融合到ha标签的人fxn包装在每种变体中，其中在5'utr中的独特的12bp rna条形码区分每种变体。以1.2
×
10∧14vg/kg的剂量对两个绒猴进行注射，其中库中的每种变体贡献了其中的1/8。图23b示出了通过绒猴大脑的前后轴和小脑分布的六个切片。fxn转基因上的ha标签的对比染色示出了在iv施用变体库后，表达稳健地分布在整个大脑中。图23c示出了针对库中8种变体中的每种变体的来自两个绒猴的rna条形码表达的ngs定量，其示出了若干种变体的急剧增加，包含与aav9相比，aav.cap-b22的rna水平增加》12倍，并且对于aav.cap-b10，增加》5倍。图23d示出了来自各种皮质和皮质下区域的放大帧，其示出了跨大多数大脑区域(包含皮质、海马体和小脑)的显著且广泛的转导。图23e示出了肝脏中的ha标签的对比染色，其揭示了来自病毒库的总转导低。ngs定量示出从肝脏中相对去靶，其中aav.cap-b22贡献的rna水平与aav9相似，而aav.cap-b10的贡献则降低了》5倍。图23f示出了对于变体中的若干种变体，心脏的转导从aav9增加，其中相比之下，aav.cap-b22贡献的rna几乎多5倍。与
aav9相比，变体对肾上腺皮质的转导有所不同。从两只动物收集rna以用于肝脏转导分析，并且从一只动物收集rna以用于心脏和肾上腺转导分析。
具体实施方式
72.本文提供了经修饰的腺相关(aav)病毒衣壳蛋白组合物，这些经修饰的腺相关(aav)病毒衣壳蛋白组合物可用于当施用于受试者时将转基因整合到该受试者的靶细胞或环境(例如，细胞类型或组织)中。本公开的经修饰的aav衣壳蛋白在对应的亲本aav衣壳蛋白中包括氨基酸的至少一个插入或取代，其赋予了期望的向性，如与参考aav衣壳蛋白(例如，对应的未经修饰的亲本衣壳蛋白)相比特异性增加或降低，或者与参考aav衣壳蛋白(例如，对应的未经修饰的亲本衣壳蛋白)相比转基因转导效率增加或降低。
73.aav中最常被操纵的环是588环，因为它是aav2与硫酸乙酰肝素结合的位点并且易于进行肽展示。aav9的唯一已知受体是n连接的末端半乳糖，但许多迹象表明还存在其它受体。尽管在啮齿类动物模型中，与对应的亲本aav衣壳蛋白相比，对aav9 588环的修饰已显示出在靶体内环境中具有增加的特异性和转基因转导效率，但这些期望的向性在非人灵长类动物模型中不翻译，因此使得其对治疗人类疾病的价值有限。经修饰的aav衣壳蛋白的非限制性实例包含aav-php.b、aav-php.eb、aav-php.s和aav-php。
74.本文公开了在人类疾病的啮齿类动物模型和非人灵长类动物模型中均观察到具有期望的向性的经修饰的aav衣壳蛋白，这些经修饰的aav衣壳蛋白相对于对应的亲本aav衣壳蛋白包括至少一个氨基酸的插入或取代，该插入或取代存在于与aav9的氨基酸455环(aa455环)相对应的环中。aa455环从衣壳表面突出得最远并且与中和抗体结合有关。据信aa455环本身或通过与588环的相互作用在细胞表面受体结合中起重要作用。在一些情况下，亲本aav衣壳蛋白是aav5、aav9或先前经修饰的aav5或aav9(例如，aav-php.eb、aav-php.b等)。
75.最常见的aav介导的转基因递送方法是直接注射到靶体内环境，与低创方法相比，由于许多原因，包含受伤或死亡的风险、疼痛和更高的成本，这是不利的。先前通过静脉内施用进行的aav介导的递送避免了对直接注射的需要，但是对靶体内环境的特异性和转导效率降低，从而导致脱靶转导事件，并且需要更大的病毒载量才能在靶体内环境中实现足够的治疗水平。当aav必须穿过血脑屏障(bbb)或上皮衬里以到达靶体内环境以便治疗中枢神经系统(cns)和肺的疾病或病状时，这尤其明显。
76.本文公开了包括全身施用本公开的经修饰的aav衣壳的方法，该经修饰的aav衣壳使包括转基因(例如，治疗性核酸)的病毒载体衣壳化，与参考aav衣壳蛋白(例如，对应的亲本衣壳蛋白)相比，该经修饰的aav衣壳具有增加的特异性和增加的转导效率。本公开的经修饰的aav衣壳蛋白在啮齿类动物模型和非人灵长类动物模型中都能够穿过bbb并且在特定靶细胞类型(例如，神经元)中转导转基因。另外，本公开的经修饰的aav衣壳蛋白能够靶向肺的细胞类型(例如，ii型上皮(atii)细胞)，其中在一些情况下与参考aav衣壳蛋白(例如，对应的亲本衣壳蛋白)相比，转基因转导效率增加了60倍。本公开的经修饰的aav衣壳蛋白能够通过在一些情况下使转基因转导效率相对于参考aav衣壳蛋白(例如，对应的亲本衣壳蛋白)降低100倍而使脱靶体内环境(例如肝脏)去靶。因此，本公开的经修饰的aav衣壳蛋白适用于转基因疗法以治疗人类疾病。
77.本文公开了包含在重组aav(raav)载体中并由本公开的经修饰的aav衣壳蛋白衣壳化的转基因。本文公开的转基因出于各种目的递送到受试者，例如以治疗受试者的疾病或病状。转基因可以是调节靶基因或基因表达产物的活性或表达的基因编辑组件。可替代地，转基因是编码治疗性基因表达产物的基因，该基因有效地调节其自身、另一靶基因或基因表达产物的活性或表达。
78.还提供了产生重组aav(raav)病毒体或raav颗粒的方法，这些raav病毒体或raav颗粒包括aav衣壳和编码治疗性核酸的异源多核苷酸，这些aav衣壳包括经修饰的aav衣壳蛋白。通过将编码转基因(例如，含有治疗性核酸)的异源多核苷酸、编码具有经修饰的aav衣壳蛋白的aav基因组的第一质粒载体和编码经修饰的衣壳结构的组装和转基因在经修饰的衣壳中的包装所必需的辅助病毒蛋白的第二质粒载体引入到细胞(例如，永生的干细胞)中来产生经修饰的衣壳蛋白。可以使用本领域已知的合适方法从细胞中分离并纯化组装的raav颗粒。
79.本文还提供了包括编码本公开的经修饰的aav衣壳蛋白的核酸序列的载体。例如，本公开的载体包括编码两个aav病毒基因(rep(复制)、cap(衣壳))的核酸序列，其中编码病毒衣壳蛋白vp1、vp2和vp3的cap基因被修饰以产生本公开的经修饰的aav衣壳蛋白。载体可以包括来自一种或多种aav血清型(例如，aav5、aav9)或变体aav血清型(例如，aav-php.eb、aav-php.b等)的病毒基因组。
80.概述
81.重组aav(raav)介导的基因递送利用病毒转导的aav机制用于游离异源核酸(例如，转基因、治疗性核酸)的核表达。在递送到宿主体内环境后，raav将(1)结合或附着到靶细胞上的细胞表面受体，(2)内吞，(3)行进到细胞核，(4)使病毒脱壳以释放经衣壳化的异源核酸，(5)将异源核酸从单链dna转换为双链dna，作为在细胞核中转录的模板，并且(6)在宿主细胞的细胞核中转录游离异源核酸(“转导”)。被工程化以具有增加的特异性(与靶细胞上的细胞表面受体结合)和转导效率(宿主细胞中的游离异源核酸的转录)的raav对于基因疗法应用来说是理想的。
82.aav衣壳由三种衣壳蛋白单体vp1、vp2和vp3构成。这三种vp蛋白的六十个拷贝以1:1:10的比率相互作用形成病毒衣壳。除了～137氨基酸n末端区域(vplu)外，vp1还覆盖整个vp2蛋白；除了～65氨基酸n末端区域(vp1/2公用区)之外，vp2还覆盖整个vp3。这三种衣壳蛋白共享vp3的保守氨基酸序列，在一些情况下，该保守氨基酸序列是从氨基酸位置217开始的区域(例如，aa 217-736)。
83.aav vp3结构含有所有血清型共有的高度保守的区域，一个核心的八链β-桶基序(βb-βi)和一个小的α-螺旋(αa)。插入β链之间的环区域由β链h和i之间的独特hi环、β链d和e之间的de环以及形成环的顶部的九个可变区(vr)组成。这些vr存在于衣壳表面上并且可以与aav生命周期中的特定功能作用(包含受体结合、转导和抗原特异性)相关。例如，aa455环从衣壳表面突出得最远，与中和抗体结合有关，并且被认为就其本身而言或通过与588环相互作用在细胞表面受体结合中起重要作用。
84.本文公开了重组腺相关病毒(raav)，这些raav具有在aa455环处包括经修饰的aav衣壳蛋白的aav衣壳，这些aav衣壳赋予了期望的向性，该向性的特征在于在特定细胞类型(例如，脑细胞类型)中转导的效率和特异性更高。具体地，本文公开的经修饰的aav衣壳实
n-k编码。“n”是四个dna核苷酸中的任一个核苷酸，并且k是鸟嘌呤(g)或胸腺嘧啶(t)。这种生成随机7聚体氨基酸序列的方法可以在蛋白质水平上实现12.8亿种可能的组合。由于开发的7聚体是随机的，因此7聚体中的一些氨基酸可能天然存在于aac衣壳蛋白中的该氨基酸位置处，而其它氨基酸可能有所不同。
92.生成了各自在455环处具有独特的7聚体并且各自使报告基因衣壳化的重组aav(raav)，该raav当全身施用于多个转基因动物中时能够选择性地扩增和回收将报告基因有效地转导在转基因动物的靶体内环境中的序列。本文提供的7聚体被发现在靶体内环境(例如，中枢神经系统、肺)中正向富集，并且在脱靶体内环境(例如，肝脏)中负向富集。“富集”是与给定的7聚体在施用于转基因动物的病毒文库中的流行率相比，该给定的7聚体在体内环境的组织中的流行率。富集评分高于0指示正向富集。富集评分小于0指示负向富集。富集评分为0指示组织中不存在该变体。在体内分别测试了具有期望富集谱的raav的子集，以确定确切的全身表达(例如，特异性和转导效率)。来自此子集的表现出期望的向性(该向性包括增加的特异性，并且在一些情况下，包括增加的转导效率)的raav被认为独特地适合于可用于多种目的(例如，治疗、诊断、科学发现)的靶向raav介导的转基因递送。
93.本文描述的具有7聚体插入或取代的raav颗粒在靶体内环境(例如，组织或细胞类型)中的转导效率增加。在一些情况下，增加的转导效率包括相对于参考aav(例如，对应的亲本衣壳蛋白)增加1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、75倍或100倍或更多倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少30倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少40倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少50倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少60倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少80倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少90倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少100倍。
94.本文描述的具有7聚体插入或取代的raav颗粒在脱靶体内环境(例如，组织或细胞类型)中的转导效率降低。在一些情况下，相对于参考aav(例如，对应的亲本衣壳蛋白)，脱靶基因转移降低1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、75倍或100倍或更多倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少20倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少30倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少40倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少50倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少60倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少80倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少90倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少100倍。
95.与参考aav(例如，对应的亲本衣壳蛋白)相比，本文描述的具有7聚体插入或取代的raav颗粒在靶体内环境(例如，组织或细胞类型)中的特异性增加或降低。检测raav对靶体内环境的特异性比参考aav对靶体内环境的特异性是更多还是更少包含：测量由raav衣壳化的异源核酸表达的基因表达产物(例如，rna或蛋白质)在获自受试者的靶体内环境的组织样品中的水平；并且将测得的水平与对照水平(例如，由参考aav(例如，aav9)衣壳化的
异源核酸表达的基因表达产物)进行比较。用于测量基因表达产物的表达的合适方法荧光素酶报告基因测定和定量聚合酶链式反应(qpcr)。
96.特异性的增加与在靶体内环境中富集的增加相关，在一些情况下，该富集用本文在图2-14中提供的富集评分来表示。作为非限制性实例，在本文中被证明与参考aav9相比在大脑中正向富集(富集评分为大约0.950)并且不在肝脏中富集(富集评分为～0)的aav.cap-b10(seq id no:3943；dgaatkn)与参考aav9相比还在大脑中表现出报告基因表达的增加并且在肝脏中不表现出报告基因表达的增加(例如，通过荧光素酶报告物测定所测量的)。在不受特定理论的束缚的情况下，本公开的发明人将针对本文公开的所有raav预期这种相关性，并且进一步地预期更显著的富集评分(无论是负向还是正向)将与对一种或多种体内环境具有更显著的特异性(如通过基因表达产物在一种或多种体内环境中的所测得水平所指示的)相关。
97.本文公开的转导效率可以通过以下中的至少一种来测量：(1)靶体内环境或脱靶体内环境中表达由本文公开的经修饰的aav衣壳蛋白衣壳化的异源核酸的细胞的数量，以及(2)异源核酸在单个细胞中的表达量。当与参考aav相比时，观察到靶体内环境中raav介导的转导的存在或水平增加时，可以推断出对靶体内环境的特异性。当与参考aav相比时，观察到脱靶体内环境中不存在raav介导的转导或raav介导的转导的水平降低时，可以推断出对脱靶体内环境缺乏特异性或对脱靶体内环境的特异性降低。
98.已证明天然aav血清型对各种组织和器官表现出不同的向性。本公开的raav颗粒包含经修饰的(例如，嵌合的)aav9衣壳。与aav血清型1-8相比，已证明aav9对中枢神经系统(cns)、肺、心脏、肝脏、肌肉和睾丸表现出强向性。在通过小鼠尾静脉注射静脉内施用的aav血清型1-9的直接比较中，与aav血清型1-8相比，aav9对肝脏、肺、肌肉、大脑、睾丸和心脏的病毒转导特异性增加。另外，与aav血清型1-8相比，aav9在肝脏、肌肉、大脑和心脏中表现出高水平的转导效率。然而，本文公开的7聚体可以被工程化到来自除aav9以外的aav血清型(如aav2或aav8)的衣壳蛋白中。
99.来自如aav9等天然aav血清型的具有特定于肝脏的向性的aav衣壳蛋白激活先天免疫应答，这在一些情况下引起受试者的严重炎性应答，从而可能导致多器官衰竭。通过提高天然aav血清型对靶体内组织(例如，大脑)的转导效率并降低aav衣壳蛋白对肝脏的特异性，本公开的raav颗粒降低了aav介导的转基因递送的免疫原性并防止了先天免疫应答的激活。
100.raav可以包括嵌合aav衣壳。“嵌合”aav衣壳是指具有外源氨基酸或氨基酸序列(例如，7聚体取代)的衣壳。raav可以包括镶嵌aav衣壳。“镶嵌”aav衣壳是指由两种或更多种衣壳蛋白或多肽构成的衣壳，该衣壳蛋白或多肽各自衍生自不同的aav血清型。raav可能是转壳的结果，在一些情况下，该转壳是指将反向末端重复序列(itr)从第一血清型包装到第二血清型的衣壳中，其中第一血清型和第二血清型不相同。在一些情况下，亲本aav血清型的衣壳基因是假型的，这意味着来自第一aav血清型(例如，aav2)的itr被用于来自第二aav血清型(例如，aav9)的衣壳中，其中第一aav血清型和第二aav血清型不相同。作为非限制性实例，包括aav2 itr和aav9衣壳蛋白的假型aav血清型可以表示为aav2/9。raav可以另外地或可替代地包括已经被工程化以表达外源配体结合部分(例如，受体)或被修饰的天然受体的衣壳。例如，本文描述的7聚体取代可以改变亲本aav的配体结合功能，以提供对特定
细胞表面抗原的增加的特异性。
101.在一些情况下，本文公开的参考aav是aav9，因为它提供了具有对cns、肺、心脏、肝脏、肌肉和睾丸的强向性的天然aav的最佳比较。然而，参考aav可以是任何血清型，例如，选自由以下组成的组的血清型：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12或其变体。例如，参考aav可以具有选自由aav-php.b、aav-php.eb和aav-php.s组成的组的血清型。在许多情况下，参考aav是亲本aav，例如，变体aav从其工程化的对应的未经修饰的aav。
102.本公开的raav衣壳蛋白包括在aav衣壳蛋白的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的取代。由其产生本公开的经工程化的aav衣壳蛋白的aav衣壳蛋白被称为“亲本”aav衣壳蛋白或“对应的未经修饰的衣壳蛋白”。在一些情况下，亲本aav衣壳蛋白具有选自由以下组成的组的血清型：aav1、aav2、raav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11和aav12。aav-1的完整基因组在genbank登录号nc_002077中提供；aav-2的完整基因组在genbank登录号nc_001401和srivastava等人,《病毒学期刊(j.virol.)》,45:555-564(1983)中提供；aav-3的完整基因组在genbank登录号nc_1829中提供；aav-4的完整基因组在genbank登录号nc_001829中提供；aav-5基因组在genbank登录号af085716中提供；aav-6的完整基因组在genbank登录号nc_00 1862中提供；aav-7和aav-8基因组的至少一部分分别在genbank登录号ax753246和ax753249中提供；aav-9基因组在gao等人,《病毒学期刊》,78:6381-6388(2004)中提供；aav-10基因组在《分子疗法(mol.ther.)》,73(1):67-76(2006)中提供；aav-11基因组在《病毒学(virology)》,330(2):375-383(2004)中提供；aav-12基因组的部分在genbank登录号dq813647中提供；aav-13基因组的部分在genbank登录号eu285562中提供。
103.在一些情况下，亲本aav衍生自具有选自由以下组成的组的血清型的aav：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11和aav12。换句话说，亲本aav是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11或aav12的变体。aav变体是指与aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11或aav12具有70％或更高的序列同一性，例如与aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11和aav12具有80％、85％或90％或更高；具有91％、92％、93％、94％、95％或更高，在一些情况下具有96％、97％、98％或99％的序列同一性的aav，变体可以包含例如在aav衣壳蛋白的氨基酸序列内包括异源氨基酸或异源氨基酸序列的aav。异源氨基酸可以天然存在于不同的aav衣壳蛋白中。在一些情况下，亲本aav衣壳描述于us2019/0055578、us2018/0230489、us2017/0067908、us2019/0048041、us9585971或us2017/0166926中，所有该文献均全文并入本文。
104.在一些情况下，亲本aav是aav9。在一些情况下，aav9衣壳蛋白的氨基酸序列包括seq id no:1。在一些情况下，亲本aav衣壳蛋白序列与seq id no:1或seq id no:1的部分70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源。在一些情况下，亲本aav衣壳蛋白包括seq id no:1中提供的整个vp1区域(例如，氨基酸1-736)。在一些情况下，亲本aav衣壳蛋白包括seq id no:1中的氨基酸217-736，其是在vp1、vp2和vp3 aav9衣壳蛋白中发现的共同区域。在一些情况下，aav衣壳蛋白包括seq id no:1中的氨基酸64-736，其是在vp1和vp2中发现的共同区域。亲本aav衣壳蛋白序列可以包
743、200-743、210-743、220-743、230-743、240-743、250-743、260-743、270-743、280-743、290-743、300-743、310-743、320-743、330-743、340-743、350-743、360-743、370-743、380-743、390-743、400-743、410-743、420-743、430-743、440-743和450-743。
109.在一些情况下，在选自aav9(vp1编号)内的452-458的任一个氨基酸位置或其变体中的等效氨基酸位置之后引入插入。aav9(vp1)的氨基酸序列在seq id no:1中提供。在一些情况下，取代是在选自aav9(vp1编号)内的452-458的任一个氨基酸位置或其变体中的等效氨基酸位置处的氨基酸的取代。在一些情况下，取代是在氨基酸位置452处的氨基酸的取代。在一些情况下，取代是在氨基酸位置453处的氨基酸的取代。在一些情况下，取代是在氨基酸位置454处的氨基酸的取代。在一些情况下，取代是在氨基酸位置455处的氨基酸的取代。在一些情况下，取代是在氨基酸位置456处的氨基酸的取代。在一些情况下，取代是在氨基酸位置457处的氨基酸的取代。在一些情况下，取代是在氨基酸位置458处的氨基酸的取代。在一些情况下，取代包括一个氨基酸的取代。在一些情况下，取代包括两个氨基酸的取代。在一些情况下，取代包括三个氨基酸的取代。在一些情况下，取代包括四个氨基酸的取代。在一些情况下，取代包括五个氨基酸的取代。在一些情况下，取代包括六个氨基酸的取代。在一些情况下，取代包括七个氨基酸的取代。两个或更多个氨基酸的取代或插入可以是连续的。两个或更多个氨基酸的取代或插入可以不是连续的。
110.在seq id no:1(aav9)、seq id no:3(aav-php.b)、seq id no:4(aav-php.s)和seq id no:5(aav-php.eb)内的根据vp1编号的位置452-458处的氨基酸表示为“ngsgqnq”(seq id no:545)。在一些情况下，在seq id no:2(aav5)内的位置452-458处的氨基酸由“nlagrya”(seq id no:45478)表示。在一些情况下，取代是在aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置n452、g453、s454、g455、q456、n457或q458或其组合处。在一些情况下，取代是在aav5衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置n452、l453、a454、g455、g455、r456、y457或a458或其组合处。在一些情况下，被取代的一个或多个氨基酸位于氨基酸452-453处，其可以包含在位置452和453处的经取代的氨基酸。在一些情况下，两个氨基酸在选自由以下组成的组的氨基酸位置处被取代：452-453、453-455、455-456、456-457和457-458。在一些情况下，三个氨基酸在选自由以下组成的组的氨基酸位置处被取代：452-454、453-455、454-456、455-457和456-458。在一些情况下，四个氨基酸在选自由以下组成的组的氨基酸位置处被取代：452-455、452-456、453-457、454-458。在一些情况下，五个氨基酸在选自由以下组成的组的氨基酸位置处被取代：452-456、453-457和454-458。在一些情况下，六个氨基酸在氨基酸位置452-457或453-458处被取代。在一些情况下，七个氨基酸在氨基酸位置452-458处被取代。
111.本文描述的raav衣壳蛋白可以是分离的和纯化的。aav可以通过本领域标准方法，如通过柱色谱法或氯化铯梯度来分离和纯化。用于从辅助病毒中纯化aav的方法是本领域已知的，并且可以包含在例如以下中描述的方法：clark等人,《人类基因疗法(hum.gene ther.)》,10(6):1031-1039(1999)；schenpp和clark,《分子医学方法(methods mol.med.)》,69:427-443(2002)；美国专利第6,566,118号和wo 98/09657。
112.raav衣壳蛋白可以缀合到纳米颗粒、第二分子或病毒衣壳蛋白。在一些情况下，纳米颗粒或病毒衣壳蛋白将使本文描述的治疗性核酸衣壳化。在一些情况下，第二分子是治疗剂，例如小分子、抗体、抗原结合片段、肽或蛋白质，如本文描述的那些。在一些情况下，第
二分子是可检测的部分。例如，缀合到可检测部分的经修饰的aav衣壳蛋白可以用于体外、离体或体内生物医学研究应用，该可检测部分用于可视化经修饰的衣壳蛋白。与可检测部分缀合的经修饰的aav衣壳蛋白也可以用于诊断目的。
113.靶向中枢神经系统的raav衣壳蛋白
114.本文公开了具有包括期望的向性的变体衣壳蛋白的重组aav(raav)，这些变体衣壳蛋白的特征在于在对应的亲本aav衣壳蛋白中的上述氨基酸位置处取代或插入了至少一个氨基酸。在一些情况下，raav衣壳蛋白具有期望的向性，该期望的向性包括对受试者的靶体内环境的特异性增加。在一些情况下，靶体内环境包括中枢神经系统(cns)或外周神经系统(pns)。本文描述的raav衣壳蛋白的向性的许多优点之一是其能够靶向cns并穿透血脑屏障(bbb)。在一些情况下，相对于对应的亲本aav衣壳蛋白的向性，期望的向性进一步包括对脱靶体内环境的特异性降低。在一些情况下，脱靶体内环境包括外周器官，如肝脏。本文描述的raav衣壳蛋白的另一个优点是其能够避免在肝脏中表达异源核酸，从而降低了肝毒性和有效治疗所需的病毒剂量。
115.体内环境可以是细胞。该细胞可以是选自由中枢神经系统(cns)细胞和外周神经系统(pns)细胞组成的组的细胞类型。cns细胞的非限制性实例包含神经元和胶质细胞。胶质细胞可以选自由少突胶质细胞、室管膜细胞和星形胶质细胞组成的组。pns细胞的非限制性实例包含神经元或胶质细胞。该胶质细胞可以选自由雪旺氏细胞、卫星细胞和肠神经胶质细胞组成的组。
116.体内环境可以是组织，如来自器官或器官系统的组织。该器官可以是大脑或脊髓。该组织可以是器官的区域，例如，大脑、小脑、脑干、皮质、纹状体、丘脑、侧脑室、壳核、下丘脑、延髓、脑桥、海马体、杏仁核、运动皮层或其组合。
117.本文公开了raav衣壳蛋白，与参考aav相比，这些raav衣壳蛋白包括赋予了对受试者的cns或pns的增加的特异性和/或增加的转导效率的氨基酸序列。在一些情况下，与参考aav相比，氨基酸序列还赋予了对外周器官(例如，肝脏)的降低的特异性或降低的转导效率。在一些情况下，该氨基酸序列包括在aav衣壳蛋白(例如，亲本aav)的氨基酸序列中的选自由452、453、454、455、456、457和458组成的组的氨基酸位置处的至少一个氨基酸的取代。在一些实施例中，亲本aav是aav9或其变体。
118.本文提供了与参考aav相比对cns或pns具有增加的特异性和/或增加的转导效率的raav衣壳蛋白，这些raav衣壳蛋白包括氨基酸(x1)，其中x1是a、d、g、l、n、q、s或t。该raav衣壳蛋白可以包括至少两个氨基酸，其中x1是a、d、g、l、n、q、s或t；并且x2是a、g、n、p、q、r、s或t。该raav可以包括至少三个氨基，其中x1是a、d、g、l、n、q、s或t；并且x2是a、g、n、p、q、r、s或t；并且x3是a、d、g、n、s或t。该raav可以包括至少四个氨基酸，其中x1是a、d、g、l、n、q、s或t；x2是a、g、n、p、q、r、s或t；x3是a、d、g、n、s或t；并且x4是a、d、g、k、n、p、q、s或t。该raav可以包括至少五个氨基酸，其中x1是a、d、g、l、n、q、s或t；x2是a、g、n、p、q、r、s或t；x3是a、d、g、n、s或t；x4是a、d、g、k、n、p、q、s或t；并且x5是a、g、k、n、p、r、s或t。该raav可以包括至少六个氨基酸，其中x1是a、d、g、l、n、q、s或t；x2是a、g、n、p、q、r、s或t；x3是a、d、g、n、s或t；x4是a、d、g、k、n、p、q、s或t；x5是a、g、k、n、p、r、s或t；并且x6是a、g、k、n、p、r、s、t或v。该raav可以包括至少七个氨基酸，其中x1是a、d、g、l、n、q、s或t；x2是a、g、n、p、q、r、s或t；x3是a、d、g、n、s或t；x4是a、d、g、k、n、p、q、s或t；x5是a、g、k、n、p、r、s或t；x6是a、g、k、n、p、r、s、t或v；并且x7是
a、g、k、l、r、s、t或v。
119.本文提供了与参考aav相比对cns或pns具有增加的特异性和/或增加的转导效率并且与参考aav相比对周围器官(例如，肝脏)具有降低的特异性和/或降低的转导效率的raav衣壳蛋白。在一些情况下，该raav包括氨基酸(x1)，其中x1是g、a、v、n、s、h、l、e或q。该raav衣壳蛋白可以包括至少两个氨基酸，其中x1是g、a、v、n、s、h、l、e或q；并且x2是a、i、t、p、n、r、t、g、s、k、h或q。该raav可以包括至少三个氨基，其中x1是g、a、v、n、s、h、l、e或q；并且x2是a、i、t、p、n、r、t、g、s、k、h或q；并且x3是s、n、d、a、t、h、k、q。该raav可以包括至少四个氨基酸。在一些实施例中，x1是g、a、v、n、s、h、l、e或q；x2是a、i、t、p、n、r、t、g、s、k、h或q；x3是n、d、a、t、h、k、q；并且x4是n、g、t、s、d、p、r、t或q。该raav可以包括至少五个氨基酸，其中x1是g、a、v、n、s、h、l、e或q；x2是a、i、t、p、n、r、t、g、s、k、h或q；x3是n、d、a、t、h、k、q；x4是n、g、t、s、d、p、r、t或q；并且x5是s、k、p、t、g、d、p、n或v。该raav可以包括至少六个氨基酸，其中x1是g、a、v、n、s、h、l、e或q；x2是a、i、t、p、n、r、t、g、s、k、h或q；x3是n、d、a、t、h、k、q；x4是n、g、t、s、d、p、r、t或q；x5是s、k、p、t、g、d、p、n或v；并且x6是t、a、r、s、n、g、d、p或v。该raav可以包括至少七个氨基酸，其中x1是g、a、v、n、s、h、l、e或q；x2是a、i、t、p、n、r、t、g、s、k、h或q；x3是n、d、a、t、h、k、q；x4是n、g、t、s、d、p、r、t或q；x5是s、k、p、t、g、d、p、n或v；x6是t、a、r、s、n、g、d、p或v；并且x7是g、n、s、l、a、e、k或q。
120.在一些情况下，该raav在一些情况下包括氨基酸(x1)，其中x1是a、d、e、g、h、m、n、q、s、t或v。该raav可以包括至少两个氨基酸，其中x1是a、d、e、g、h、m、n、q、s、t或v；并且x2是a、d、e、g、k、n、q、s、t或v。该raav可以包括至少三个氨基酸，其中x1是a、d、e、g、h、m、n、q、s、t或v；x2是a、d、e、g、k、n、q、s、t或v；并且x3是a、d、e、g、k、n、q、s、t或v。该raav可以包括至少四个氨基酸，其中x1是a、d、e、g、h、m、n、q、s、t或v；x2是a、d、e、g、k、n、q、s、t或v；x3是a、d、e、g、k、n、q、s、t或v；并且x4是a、d、e、g、k、n、p、q、s或t。该raav可以包括至少五个氨基酸，其中x1是a、d、e、g、h、m、n、q、s、t或v；x2是a、d、e、g、k、n、q、s、t或v；x3是a、d、e、g、k、n、q、s、t或v；x4是a、d、e、g、k、n、p、q、s或t；并且x5是a、d、e、g、h、k、n、p、q、s或t。该raav可以包括至少六个氨基酸，其中x1是a、d、e、g、h、m、n、q、s、t或v；x2是a、d、e、g、k、n、q、s、t或v；x3是a、d、e、g、k、n、q、s、t或v；x4是a、d、e、g、k、n、p、q、s或t；x5是a、d、e、g、h、k、n、p、q、s或t；并且x6是a、d、e、g、k、n、p、s、t或v。该raav可以包括至少七个氨基酸，其中x1是a、d、e、g、h、m、n、q、s、t或v；x2是a、d、e、g、k、n、q、s、t或v；x3是a、d、e、g、k、n、q、s、t或v；x4是a、d、e、g、k、n、p、q、s或t；x5是a、d、e、g、h、k、n、p、q、s或t；x6是a、d、e、g、k、n、p、s、t或v；并且x7是a、e、g、h、k、l、n、q、s、t或v。
121.在一些情况下，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7是连续的(x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7)。可替代地，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7不是连续的。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的任何两个是连续的。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的任何三个是连续的。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的任何四个是连续的。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的任何五个是连续的。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的任何六个是连续的。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的任何七个是连续的。在一些实施例中，x1在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置452处。在一些实施例中，x2在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置453处。在一些实施例中，x3在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置454处。在一些实施例中，x4在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置
455处。在一些实施例中，x5在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置456处。在一些实施例中，x6在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置457处。在一些实施例中，x7在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置458处。在一些实施例中，raav的氨基酸序列在亲本aav9衣壳蛋白或其变体中的氨基酸452-458处不包括氨基酸序列ilgtgts(seq id no:45479)或qssqtpr(seq id no:45479)。
122.本文公开了raav衣壳蛋白，这些raav衣壳蛋白包括在seq id no:11-12739中的任一个中提供的氨基酸序列中的一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，这些raav衣壳蛋白包括在seq id no:11-12739中的任一个中提供的氨基酸序列中的两个氨基酸的取代。在一些实施例中，这些raav衣壳蛋白包括在seq id no:11-12739中的任一个中提供的氨基酸序列中的三个氨基酸的取代。在一些实施例中，这些raav衣壳蛋白包括在seq id no:11-12739中的任一个中提供的氨基酸序列中的四个氨基酸的取代。在一些实施例中，这些raav衣壳蛋白包括在seq id no:11-12739中的任一个中提供的氨基酸序列中的五个氨基酸的取代。在一些实施例中，这些raav衣壳蛋白包括在seq id no:11-12739中的任一个中提供的氨基酸序列中的六个氨基酸的取代。
123.本文公开了对中枢神经系统(cns)或外周神经系统(pns)具有增加的特异性和/或增加的转导效率的raav衣壳蛋白。示例性取代包含aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸序列中的n452d、n452a、n452g、n452l、n452q、n452s、n452t、g453i、g453n、g453s、g453p、g453r、g453t、s454a、s454q、s454d、s454g、s454n、s454t、g455a、g455s、g455d、g455k、g455n、g455p、g455q、g455t、q456t、q456s、q456a、q456g、q456k、q456n、q456r、q456p、n457k、n457a、n457g、n457p、n457r、n457s、n457t、n457v、q458n、q458a、q458g、q458k、q458l、q458r、q458s、q458t或q458v。在一些实施例中，取代是氨基酸序列lqtsspg(seq id no:2933)的至少或约一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，氨基酸序列是qqgkqsv(seq id no:79)。在一些实施例中，氨基酸序列是sintktn(seq id no:45475)。在一些实施例中，氨基酸序列是sngtkqt(seq id no:442)。在一些实施例中，氨基酸序列是gsgktaa(seq id no:88)。在一些实施例中，氨基酸序列是mgdkptr(seq id no:2466)。在一些实施例中，氨基酸序列是dgaatkn(seq id no:3943)。在一些实施例中，氨基酸序列是qpsggnt(seq id no:2672)。在一些实施例中，氨基酸序列是ergantk(seq id no:5192)。在一些实施例中，氨基酸序列是ttgghss(seq id no:2743)。在一些实施例中，氨基酸序列是gttktse(seq id no:3064)。在一些实施例中，氨基酸序列是gtgtsvl(seq id no:11958)。在一些实施例中，氨基酸序列是nqsgtkg(seq id no:780)。在一些实施例中，氨基酸序列是dgqssks(seq id no:2764)。在一些实施例中，氨基酸序列是kgpgqmg(seq id no:45476)。在一些实施例中，氨基酸序列是gtpskag(seq id no:2741)。
124.本文还提供了对cns和pns具有增加的特异性和/或增加的转导效率并且对脱靶体内环境(如肝脏)具有降低的特异性和/或降低的转导效率的raav衣壳蛋白。示例性取代包含aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸序列中的n452d、n452g、n452a、n452v、n452s、n452h、n452l、n452e、n452q、g452a、g452i、g452t、g452p、g452r、g452t、g452s、g452k、g452h、s454a、s454n、s454d、s454g、s454t、s454h、s454k、s454q、g455a、g455n、g455t、g455s、g455d、g455p、g455r、g455q、q456t、q456s、q456k、q456p、q456g、q456d、q456v、q456a、q456n、n457k、n457t、n457a、n457r、n457s、n457g、n457d、n457p、n457v、q458n、q458g、
q458s、q458l、q458a、q458e和q458k。另外的示例性取代包含n452a、n452d、n452e、n452g、n452h、n452m、n452n、n452q、n452s、n452t、n452v、g453a、g453d、g453e、g453g、g453k、g453n、g453q、g453s、g453t、g453v、s454a、s454d、s454e、s454g、s454k、s454n、s454q、s454s、s454t、s454v、g455a、g455d、g455e、g455g、g455k、g455n、g455p、g455q、g455s、g455t、q456a、q456d、q456e、q456h、q456h、q456k、q456n、q456p、q456q、q456s、q456t、n457a、n457d、n457e、n457g、n457k、n457n、n457p、n457s、n457t、n457v、q458a、q458e、q458g、q458h、q458k、q458l、q458n、q458q、q458s、q458t和q458v。另外的示例性取代包含n452a、n452d、n452e、n452g、n452h、n452k、n452l、n452m、n452n、n452q、n452s、n452t、n452v、g453a、g453d、g453g、g453h、g453m、g453n、g453p、g453q、g453s、g453t、g453v、s454a、s454d、s454e、s454g、s454k、s454n、s454q、s454s、s454t、s454v、g455a、g455d、g455e、g455g、g455k、g455n、g455p、g455q、g455s、g455t、q456a、q456d、q456g、q456k、q456n、q456p、q456q、q456s、q456t、n457a、n457g、n457h、n457l、n457m、n457n、n457p、n457q、n457s、n457t、n457v、q458a、q458d、q458e、q458g、q458h、q458i、q458k、q458l、q458n、q458q、q458r、q458s、q458t和q458v。在一些实施例中，取代是氨基酸序列dgaatkn(seq id no:3943)的至少或约一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，取代是氨基酸序列dgqssks(seq id no:2764)的至少或约一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。
125.在一些情况下，氨基酸的取代在aav9或其变体的衣壳氨基酸序列中的选自452-458的氨基酸位置处。在一些情况下，氨基酸的取代在seq id no:1提供的衣壳氨基酸序列中的选自452-458的氨基酸位置处。在一些情况下，氨基酸的取代在aav5或其变体的衣壳氨基酸序列中的选自452-458的氨基酸位置处。在一些情况下，氨基酸的取代在seq id no:2提供的衣壳氨基酸序列中的选自452-458的氨基酸位置处。在一些情况下，氨基酸的取代在aavv-php.b衣壳蛋白序列(seq id no:3)中的选自452-458的氨基酸位置处。在一些情况下，氨基酸的取代在aav-php.s衣壳蛋白序列(seq id no:4)中的选自452-458的氨基酸位置处。在一些情况下，氨基酸的取代在aav-php.eb衣壳蛋白序列(seq id no:5)中的选自452-458的氨基酸位置处。在一些实施例中，本公开的raav包括在亲本aav衣壳蛋白中的选自452-458的氨基酸位置处的氨基酸的取代，以及在亲本aav衣壳蛋白中的氨基酸位置588-589处的氨基酸或氨基酸序列的插入。
126.本公开的raav衣壳蛋白还可以具有在亲本aav9衣壳蛋白或其变体中的氨基酸位置588-589处的氨基酸序列的插入。在一些实施例中，氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白中的氨基酸位置588-589处的x1lavpfk(seq id no:45481)，其中x1是除t、s或n以外的任何氨基酸。在一些实施例中，氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的x1x2avpfk(seq id no:45482)，其中x2是除l或v以外的任何氨基酸。在一些实施例中，氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的x1x2x3vpfk(seq id no:45483)，其中x3是除a、s、q、p和t以外的任何氨基酸。在一些实施例中，氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白中的氨基酸位置588-589处的x1x2x3x4pfk(seq id no:45484)，其中x4是除v、t、q、n、l和m以外的任何氨基酸。在一些实施例中，氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白中的氨基酸位置588-589处的tlax4pfk(seq id no:45485)，其中x是除v、t、q、n、l和m以外的任何氨基酸。在一些实施例中，该raav进一步包
括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体中的氨基酸位置587处的氨基酸的取代。在一些实施例中，该取代是a587d。在一些实施例中，该取代是用除d以外的氨基酸进行的取代。在一些实施例中，该raav进一步包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体中的氨基酸位置588处的氨基酸的取代。在一些实施例中，该取代是q588g。在一些实施例中，该取代是用除g以外的氨基酸进行的取代。
127.在一些实施例中，该raav衣壳具有变体aav衣壳蛋白(例如，raav衣壳蛋白)，该变体aav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列lqtsspg(seq id no:2933)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:3)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列lqtsspg(seq id no:2933)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列lqtsspg(seq id no:2933)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46386中提供的氨基酸序列。
128.在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列qqgkqsv(seq id no:79)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:3)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列qqgkqsv(seq id no:79)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列qqgkqsv(seq id no:79)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46387中提供的氨基酸序列。
129.在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列sintktn(seq id no:45475)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:3)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列sintktn(seq id no:45475)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列sintktn(seq id no:45475)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46368中提
供的氨基酸序列。
130.在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在由seq id no:1表示的亲本aav9衣壳蛋白中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列sngtkqt(seq id no:442)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在由seq id no:3或seq id no:5表示的亲本aav9变体衣壳蛋白中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列sngtkqt(seq id no:442)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46389中提供的氨基酸序列。
131.在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在由seq id no:1表示的亲本aav9衣壳蛋白中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列gsgktaa(seq id no:88)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在由seq id no:3或seq id no:5表示的亲本aav9变体衣壳蛋白中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列gsgktaa(seq id no:88)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46390中提供的氨基酸序列。
132.在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在由seq id no:1表示的亲本aav9衣壳蛋白中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列mgdkptr(seq id no:2466)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在由seq id no:3或seq id no:5表示的亲本aav9变体衣壳蛋白中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列mgdkptr(seq id no:2466)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46391中提供的氨基酸序列。
133.在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在由seq id no:1表示的亲本aav9衣壳蛋白中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列dgaatkn(seq id no:3943)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在由seq id no:3或seq id no:5表示的亲本aav9变体衣壳蛋白中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列dgaatkn(seq id no:3943)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的
tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46384中提供的氨基酸序列。
134.在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列qpsggnt(seq id no:2672)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:3)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列qpsggnt(seq id no:2672)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列qpsggnt(seq id no:2672)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46392中提供的氨基酸序列。
135.在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列ergantk(seq id no:5192)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:3)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列ergantk(seq id no:5192)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列ergantk(seq id no:5192)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46393中提供的氨基酸序列。
136.在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列ttgghss(seq id no:2743)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:3)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列ttgghss(seq id no:2743)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列ttgghss(seq id no:2743)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46394中提供的氨基酸序列。
137.在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的
氨基酸位置452-458处的氨基酸序列gttktse(seq id no:3064)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:3)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列gttktse(seq id no:3064)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列gttktse(seq id no:3064)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46395中提供的氨基酸序列。
138.在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列gtgtsvl(seq id no:11958)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:3)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列gtgtsvl(seq id no:11958)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列gtgtsvl(seq id no:11958)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46396中提供的氨基酸序列。
139.在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列nqsgtkg(seq id no:780)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:3)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列nqsgtkg(seq id no:780)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列nqsgtkg(seq id no:780)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46397中提供的氨基酸序列。
140.在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列dgqssks(seq id no:2764)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳
蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列dgqssks(seq id no:2764)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列dgqssks(seq id no:2764)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46385中提供的氨基酸序列。
141.在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列kgpgqmg(seq id no:45476)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:3)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列kgpgqmg(seq id no:45476)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列kgpgqmg(seq id no:45476)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46398中提供的氨基酸序列。
142.在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列gtpskag(seq id no:2741)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列gtpskag(seq id no:2741)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列gtpskag(seq id no:2741)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸。在一些实施例中，该氨基酸序列的插入包括在亲本aav9衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的tlavpfk(seq id no:45477)。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46399中提供的氨基酸序列。
143.表1提供了基于在两个轮次的体内选择后在大脑中的正向富集和在肝脏中的负向富集来排名的表现最佳的raav衣壳蛋白的氨基酸序列以及对该氨基酸序列进行编码的dna序列。表2提供了基于在两个轮次的体内选择后仅在大脑中的富集来排名的表现最佳的raav衣壳蛋白的氨基酸序列以及对应的dna序列。实例3提供了有关如何计算富集评分的细节。如果aav变体在组织中的富集评分小于或等于0，则确定该aav变体使该组织去靶。
144.表1：靶向cns和使肝脏去靶的raav的7氨基酸靶向肽的列表
145.[0146][0147]
表2：靶向cns的raav的7氨基酸靶向肽的列表
[0148]
[0149][0150]
靶向器官或组织的经修饰的aav衣壳蛋白
[0151]
本文公开了包括期望的向性的重组aav(raav)衣壳蛋白，这些raav衣壳蛋白的特征在于在亲本aav衣壳蛋白(例如，aav5或aav9)中的上述氨基酸位置处取代或插入了至少一个氨基酸。本公开的aav衣壳蛋白被工程化以具有期望的向性，该期望的向性包括对受试者(如器官或器官系统)的靶体内环境的特异性增加。本文描述的raav衣壳蛋白的向性的许多优点之一是其能够选择性且高效地在器官或器官系统中表达异源核酸，同时避免异源核酸在脱靶器官中表达，从而降低了毒性和有效治疗所需的病毒剂量。
[0152]
体内环境可以是组织或细胞。体内环境可以是组织，如来自器官或器官系统的组织。器官或器官系统的非限制性实例包含肝脏、肠、心脏、肺、生殖器官、肌肉、动物脂肪、胰腺、大脑和脾脏。生殖器官的非限制性实例包含卵巢和睾丸。体内环境可以是细胞。该细胞可以是选自由以下组成的组的细胞类型：中枢神经系统(cns)细胞、外周神经系统(pns)细胞、肝细胞、肠细胞、肺细胞、心脏细胞、动物脂肪细胞、肌肉细胞、肾脏细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、脾脏细胞，生殖器官细胞和胃细胞。cns细胞可以是神经元或胶质细胞。该胶质细胞可以选自由少突胶质细胞、室管膜细胞和星形胶质细胞组成的组。pns细胞可以是神经元或胶质细胞。该胶质细胞可以选自由雪旺氏细胞、卫星细胞和肠神经胶质细胞组成的组。肝脏细胞可以是肝细胞。肠细胞可以选自由以下组成的组：肠上皮细胞、杯状细胞(goblet cell)、肠内分泌细胞、杯形细胞(cup cell)、簇状细胞和帕内特细胞(paneth cell)。肺细胞可以选自由以下组成的组：肺泡i型上皮细胞、肺泡ii型上皮细胞、肺泡i型肺细胞、肺泡ii型肺细胞、毛细血管内皮细胞和肺泡巨噬细胞。心脏细胞可以是心肌细胞。胃细胞可以选自由以下组成的组：粘液细胞、壁细胞、主细胞和g细胞。肌肉细胞可以是肌细胞。
[0153]
经优化用于靶向受试者体内特定器官或组织的本公开的raav具有包括seq id no:25469-35471中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，经优化用于靶向心脏的raav具有包括在seq id no:25469-26205中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，经优化用于靶向肺的raav具有包括在seq id no:32537-34198中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，经优化用于靶向肝脏的raav具有包括在seq id no:30720-30923中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，经优化用于靶向肠的raav具有包括在seq id no:26206-26873中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，经优化用于靶向胃的raav具有包括在seq id no:31873-32060中提供的氨基酸序列
的氨基酸序列。在一些实施例中，经优化用于靶向脾脏的raav具有包括在seq id no:31468-31872中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，经优化用于靶向肾脏的raav具有包括在seq id no:26874-30719中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，经优化用于靶向脂肪(动物脂肪)的raav具有包括在seq id no:34199-35471中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，经优化用于靶向肌肉的raav具有包括在seq id no:30924-31451中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。该肌肉可以是心肌。该肌肉可以是骨骼肌。在一些实施例中，经优化用于靶向胰腺的raav具有包括seq id no:31452-31467中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，经优化用于靶向生殖器官(如睾丸)的raav包含包括seq id no:32061-32536中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些情况下，该生殖器官是卵巢。
[0154]
本文公开了包括期望的向性的raav衣壳蛋白，这些raav衣壳蛋白的特征在于在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸序列中的选自452-458的氨基酸位置处的至少一个氨基酸的取代。该raav衣壳蛋白可以包括亲本aav衣壳蛋白中的至少一个氨基酸的取代。在一些情况下，x1是k、r、n或t。该raav衣壳蛋白可以包括亲本aav衣壳蛋白中的至少两个氨基酸的取代或插入，其中x1是k、r、n或t；并且x2是d、e、n或v。该raav衣壳蛋白可以包括亲本aav衣壳蛋白中的至少三个氨基酸的取代或插入，其中x1是k、r、n或t；x2是d、e、n或v；并且x3是n、s、l或p。该raav衣壳蛋白可以包括亲本aav衣壳蛋白中的至少四个氨基酸的取代或插入，其中x1是k、r、n或t；x2是d、e、n或v；x3是n、s、l或p；并且x4是t、s、p或l。该raav衣壳蛋白可以包括亲本aav衣壳蛋白中的至少五个氨基酸的取代或插入，其中x1是k、r、n或t；x2是d、e、n或v；x3是n、s、l或p；x4是t、s、p或l；并且x5是p、r或s。该raav衣壳蛋白可以包括亲本aav衣壳蛋白中的至少六个氨基酸的取代或插入，其中x1是k、r、n或t；x2是d、e、n或v；x3是n、s、l或p；x4是t、s、p或l；x5是p、r或s；并且x6是g、s、n或t。该raav衣壳蛋白可以包括亲本aav衣壳蛋白中的至少七个氨基酸的取代或插入，其中x1是k、r、n或t；x2是d、e、n或v；x3是n、s、l或p；ix4是t、s、p或l；x5是p、r或s；x6是g、s、n或t；并且x7是r、l或e。
[0155]
在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7是连续的(x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7)。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的任何两个是连续的。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的任何三个是连续的。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的任何四个是连续的。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的任何五个是连续的。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的任何六个是连续的。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的任何七个是连续的。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7不是连续的。在一些实施例中，x1在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置452处。在一些实施例中，x2在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置453处。在一些实施例中，x3在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置454处。在一些实施例中，x4在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置455处。在一些实施例中，x5在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置456处。在一些实施例中，x6在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置457处。在一些实施例中，x7在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置458处。
[0156]
本文公开了raav衣壳蛋白，这些raav衣壳蛋白包括在seq id no:25469-35471中的任一个中提供的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，在选自seq id no:25469-26205的氨基酸序列中提供该至少一个、两个、三个、四
个、五个、六个或七个氨基酸。在一些实施例中，在选自seq id no:26206-26873的氨基酸序列中提供该至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸。在一些实施例中，在选自seq id no:26874-30719的氨基酸序列中提供该至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸。在一些实施例中，在选自seq id no:30720-30923的氨基酸序列中提供该至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸。在一些实施例中，在选自seq id no:30924-31451的氨基酸序列中提供该至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸。在一些实施例中，在选自seq id no:31452-31467的氨基酸序列中提供该至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸。在一些实施例中，在选自seq id no:31468-31872的氨基酸序列中提供该至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸。在一些实施例中，在选自seq id no:31873-32060的氨基酸序列中提供该至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸。在一些实施例中，在选自seq id no:32061-32536的氨基酸序列中提供该至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸。在一些实施例中，在选自seq id no:32537-34198的氨基酸序列中提供该至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸。在一些实施例中，在选自seq id no:34199-35471的氨基酸序列中提供该至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸。在一些实施例中，该取代包括n452k、n452r、n452t、g453d、g453l、g453e、g453v、g453n、g453s、g453l、g453p、s454l、s454p、s454a、s454d、s454g、s454t、g455t、g455s、g455p、g455l、q456p、q456r、q456s、n457g、n457s、n457t、q458r、q458l或q458i或其组合。
[0157]
本文公开了raav衣壳蛋白，这些raav衣壳蛋白包括本文提供的氨基酸序列的至少或约一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，氨基酸序列是kdntpgr(seq id no:32538)。在一些实施例中，氨基酸序列是nnlprnl(seq id no:32867)。在一些实施例中，氨基酸序列是resspsl(seq id no:29065)。在一些实施例中，氨基酸序列是rvplsti(seq id no:26933)。
[0158]
在一些情况下，氨基酸的取代在aav9或其变体的衣壳氨基酸序列中的选自452-458的氨基酸位置处。在一些情况下，氨基酸的取代在seq id no:1提供的衣壳氨基酸序列中的选自452-458的氨基酸位置处。在一些情况下，氨基酸的取代在aav5或其变体的衣壳氨基酸序列中的选自452-458的氨基酸位置处。在一些情况下，氨基酸的取代在seq id no:2提供的衣壳氨基酸序列中的选自452-458的氨基酸位置处。在一些情况下，氨基酸的取代在aavv-php.b衣壳蛋白序列(seq id no:3)中的选自452-458的氨基酸位置处。在一些情况下，氨基酸的取代在aav-php.s衣壳蛋白序列(seq id no:4)中的选自452-458的氨基酸位置处。在一些情况下，氨基酸的取代在aav-php.eb衣壳蛋白序列(seq id no:5)中的选自452-458的氨基酸位置处。在一些实施例中，本公开的raav包括在亲本aav衣壳蛋白中的选自452-458的氨基酸位置处的氨基酸的取代，以及在亲本aav衣壳蛋白中的氨基酸位置588-589处的氨基酸或氨基酸序列的插入。
[0159]
本公开的raav衣壳蛋白还可以具有在亲本aav9或aav5衣壳蛋白或其变体中的氨基酸位置588处的氨基酸序列的插入。在一些实施例中，氨基酸序列的插入包括在亲本aav9 aav5衣壳蛋白中的氨基酸位置588-589处的x1lavpfk(seq id no:45481)，其中x1是除t、s或n以外的任何氨基酸。在一些实施例中，氨基酸序列的插入包括在亲本aav9或aav5衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的x1x2avpfk(seq id no:45482)，其中x2是除l或v以外的任何
氨基酸。在一些实施例中，氨基酸序列的插入包括在亲本aav9或aav5衣壳蛋白的氨基酸位置588-589处的x1x2x3vpfk(seq id no:45483)，其中x3是除a、s、q、p和t以外的任何氨基酸。在一些实施例中，氨基酸序列的插入包括在亲本aav9或aav5衣壳蛋白中的氨基酸位置588-589处的x1x2x3x4pfk(seq id no:45484)，其中x4是除v、t、q、n、l和m以外的任何氨基酸。在一些实施例中，氨基酸序列的插入包括在亲本aav9或aav5衣壳蛋白中的氨基酸位置588-589处的tlax4pfk(seq id no:45485)，其中x是除v、t、q、n、l和m以外的任何氨基酸。在一些实施例中，该raav进一步包括在亲本aav9或aav5衣壳蛋白或其变体中的氨基酸位置587处的氨基酸的取代。在一些实施例中，该取代是a587d。在一些实施例中，该取代是用除d以外的氨基酸进行的取代。在一些实施例中，该raav进一步包括在亲本aav9或aav5衣壳蛋白或其变体中的氨基酸位置588处的氨基酸的取代。在一些实施例中，该取代是q588g。在一些实施例中，该取代是用除g以外的氨基酸进行的取代。
[0160]
在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列kdntpgr(seq id no:32538)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:3)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列kdntpgr(seq id no:32538)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列kdntpgr(seq id no:32538)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav5衣壳蛋白(seq id no:2)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列kdntpgr(seq id no:32538)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav5变体衣壳蛋白中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列kdntpgr(seq id no:32538)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46400中提供的氨基酸序列。
[0161]
在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括
[0162]
在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列nnlprnl(seq id no:32867)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:3)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列nnlprnl(seq id no:32867)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列nnlprnl(seq id no:32867)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav5衣壳蛋白(seq id no:2)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列nnlprnl(seq id no:32867)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav5变体衣壳蛋白中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列nnlprnl(seq id no:32867)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处
的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46401中提供的氨基酸序列。
[0163]
在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列resspsl(seq id no:29065)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:3)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列resspsl(seq id no:29065)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列resspsl(seq id no:29065)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav5衣壳蛋白(seq id no:2)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列resspsl(seq id no:29065)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav5变体衣壳蛋白中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列resspsl(seq id no:29065)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46402中提供的氨基酸序列。
[0164]
在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白(seq id no:1)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列rvplsti(seq id no:26933)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:3)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列rvplsti(seq id no:26933)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9变体衣壳蛋白(seq id no:5)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列rvplsti(seq id no:26933)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav5衣壳蛋白(seq id no:2)中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列rvplsti(seq id no:26933)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav5变体衣壳蛋白中的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列rvplsti(seq id no:26933)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav9衣壳蛋白或其变体的氨基酸位置588-589处的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括seq id no:46403中提供的氨基酸序列。
[0165]
异源核酸
[0166]
本文公开了包括治疗性核酸的异源核酸，这些治疗性核酸可用于治疗或预防本文所公开的疾病或病状或该疾病或病状的症状。在一些实施例中，这些治疗性核酸编码治疗性基因表达产物。基因表达产物的非限制性实例包含用于治疗、预防和/或改善疾病或病状、或疾病或病状的症状的蛋白质、多肽、肽、酶、抗体、抗原结合片段、核酸(rna、dna、反义寡核苷酸、sirna等)以及基因编辑组件。在一些情况下，这些治疗性核酸通过raav(如本文公开的那些)而安置于生物体、受试者的细胞、组织或器官中。
[0167]
本文公开了raav，这些raav各自包括病毒基因组(例如，单链dna分子(ssdna))。在一些情况下，病毒载体包括各自约145个碱基的两个反向末端重复(itr)序列，该两个itr序列侧接异源核酸或转基因。在一些实施例中，转基因包括治疗性核酸，并且在一些情况下，包括在开放阅读框(orf)中与治疗性核酸顺式的启动子。该启动子能够启动靶细胞的细胞核中治疗性核酸的转录。itr序列可以来自任何aav血清型。aav血清型的非限制性实例包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11和aav12。在一些情况下，itr来自aav2。在一些情况下，itr来自aav9。
[0168]
本文公开了可以包括任何数量的核苷酸的转基因。在一些情况下，转基因可以包括少于约100个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约100个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约200个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约300个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约400个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约500个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约1000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约5000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约10,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约20,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约30,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约40,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括至少约50,000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括约500到约5000个核苷酸。在一些情况下，转基因可以包括约5000到约10,000个核苷酸。在本文公开的任何情况下，转基因可以包括dna、rna或dna和rna的杂合体。在一些情况下，转基因可以是单链的。在一些情况下，转基因可以是双链的。
[0169]
本文公开了可用于调节靶基因或其基因表达产物的表达或活性的转基因。在一些情况下，转基因由本文描述的raav颗粒的raav衣壳蛋白衣壳化。在一些情况下，将raav颗粒递送到受试者以治疗受试者的本文公开的疾病或病状。在一些情况下，递送是全身性的(例如，静脉内、鼻内)。
[0170]
本文公开的转基因可用于以与健康或正常个体的水平类似的水平表达内源基因。这在治疗与基因表达产物的低表达或表达不足有关的疾病或病状中特别有用。在一些实施例中，本文公开的转基因可用于过表达内源基因，使得内源基因的表达水平高于健康或正常个体的表达水平。另外，转基因可以用于表达外源基因(例如，如抗体、肽、核酸或基因编辑组件等活性剂)。在一些实施例中，治疗性基因表达产物能够改变、增强、增加或诱导细胞中一种或多种内源生物学过程的活性。在一些实施例中，本文公开的转基因可用于减少表达内源基因，例如显性负基因。在一些实施例中，治疗性基因表达产物能够改变、抑制、减少、预防、消除或削弱细胞中一种或多种内源生物学过程的活性。在一些方面，基因表达的增加是指增加至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。在一方面，靶基因的蛋白质产物可以增加至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。在一些方面，基因表达的降低是指增加至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。在一方面，靶基因的蛋白质产物可以降低至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。
[0171]
当内源序列(内源或部分转基因)与转基因一起表达时，内源序列可以是全长序列(野生型或突变体)或部分序列。内源序列可以是功能性的。这些全长或部分序列的功能的非限制性实例包含增加由转基因(例如，治疗性基因)表达和/或充当载体的多肽的血清半
衰期。
[0172]
可以将转基因插入到内源基因中，使得表达内源基因的全部、一些或者不表达内源基因。例如，可以将本文描述的转基因插入到内源性基因座中，使得内源序列中的一些(到转基因的n末端和/或c末端)内源序列或没有任何内源序列被表达为例如与转基因的融合体。在其它情况下，将转基因(例如，具有或不具有如用于内源基因的编码序列等另外的编码序列)整合到任何内源基因座中，例如安全港基因座。例如，可以将共济蛋白(fxn)转基因插入到内源fxn基因中。可以将转基因插入到任何基因(例如，本文描述的基因)中。
[0173]
本公开的至少一个优点是实际上任何治疗性核酸均可以用于表达任何治疗性基因表达产物。在一些情况下，治疗性基因表达产物是治疗性蛋白或肽(例如，抗体、抗原结合片段、肽或蛋白质)。在一个实施例中，由治疗性核酸编码的蛋白质的长度介于50-5000个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质的长度介于50-2000个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质的长度介于50-1000个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质的长度介于50-1500个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质的长度介于50-800个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质的长度介于50-600个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质的长度介于50-400个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质的长度介于50-200个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质的长度介于50-100个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的肽的长度介于4-50个氨基酸之间。在一些实施例中，编码的蛋白质是四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽或十肽。在一些实施例中，编码的蛋白质包括2-30个氨基酸(如5-30、10-30、2-25、5-25、10-25或10-20个氨基酸)的肽。在一些实施例中，编码的蛋白质包括至少11、12、13、14、15、17、20、25或30个氨基酸的肽或不超过50个氨基酸(例如，不超过35、30、25、20、17、15、14、13、12、11或10个氨基酸)的肽。
[0174]
治疗性蛋白质或肽的非限制性实例包含肾上腺素能激动剂、抗凋亡因子、凋亡抑制剂、细胞因子受体、细胞因子、细胞毒素、促红细胞生成剂、谷氨酸脱羧酶、糖蛋白、生长因子、生长因子受体、激素、激素受体、干扰素、白介素、白介素受体、激酶、激酶抑制剂、神经生长因子、轴突导向因子(netrin)、神经活性肽、神经活性肽受体、神经源性因子、神经源性因子受体、神经纤毛蛋白、神经营养因子、神经营养蛋白、神经营养蛋白受体、n-甲基-d-天冬氨酸拮抗剂、神经丛蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、蛋白质脱羧酶、蛋白质激酶、蛋白质激酶抑制剂、蛋白水解蛋白、蛋白水解蛋白抑制剂、臂板蛋白、臂板蛋白受体、5-羟色胺转运蛋白、5-羟色胺摄取抑制剂、5-羟色胺受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂受体和肿瘤抑制剂。在某些实施例中，治疗性蛋白质或肽选自由以下组成的组：脑源性神经营养因子(bdnf)、睫状神经营养因子(cntf)、巨噬细胞集落刺激因子(csf)、表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、促性腺激素、干扰素-γ(ifn)、胰岛素样生长因子1(ifg-1)、神经生长因子(ngf)、血小板源性生长因子(pdgf)、色素上皮源性因子(pedf)、转化生长因子(tgf)、转化生长因子-β(tgf-b)、肿瘤坏死因子(tnf)、血管内皮生长因子(vegf)、催乳素、生长激素、x连锁凋亡抑制蛋白1(xiap1)、白介素1(il-1)、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-10、病毒性il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17和il-18。
[0175]
治疗性基因表达产物可以包括基因编辑组件。基因编辑组件的非限制性实例包含crispr/cas、人工位点特异性rna核酸内切酶(asre)、锌指核酸内切酶(zfn)和转录因子(如
效应子核酸酶(talen))所需的那些。在非限制性实例中，鉴定了患有亨廷顿氏病(huntington's disease)的受试者。然后，向该受试者全身性施用第一量的raav，该raav使编码zfn的病毒载体衣壳化，该zfn被工程化以抑制亨廷顿蛋白(htt)基因的转录。在一些情况下，施用途径是静脉内。raav将包含经修饰的aav衣壳蛋白，该经修饰的aav衣壳蛋白包含表1-2或seq id no:11-12739中的任一个中提供的氨基酸序列，以便在重新靶向脱靶器官(如肝脏)的同时使zfn适当地靶向神经系统。如果需要，向该受试者施用第二或第三剂量的raav，直到在该受试者的神经系统中表达治疗有效量的zfn。在另一个非限制性实例中，鉴定了患有囊性纤维化的受试者。然后，向该受试者全身性施用第一量的raav，该raav使编码zfn的转基因衣壳化，该zfn被工程化以抑制囊性纤维化跨膜传导调节剂(cftr)基因的转录。在一些情况下，施用途径是鼻内(例如，鼻内喷雾)。raav将包含经修饰的aav衣壳蛋白，该经修饰的aav衣壳蛋白包含在seq id no:32537-34198中的任一个中提供的氨基酸序列，以便允许zfn适当地靶向肺。如果需要，向该受试者施用第二或第三剂量的raav，直到在该受试者的肺中表达治疗有效量的zfn。
[0176]
治疗性核酸可以包括非蛋白质编码基因，例如，编码反义rna、rnai、shrna和微小rna(mirna)、mirna海绵(sponge)或诱饵(decoy)的序列，用于条件性基因缺失的重组酶递送、条件性(重组酶相关的)表达包含本文描述的基因编辑组件所需的那些。非蛋白质编码基因还可以编码trna、rrna、tmrna、pirna、双链rna、snrna、snorna和/或长非编码rna(incrna)。在一些情况下，非蛋白质编码基因可以调节靶基因或基因表达产物、非蛋白质编码基因的表达或活性。例如，本文描述的rna可以用于抑制靶细胞(例如，中枢神经系统(cns)或外周器官(例如，肺)中的细胞)中的基因表达。在一些情况下，基因表达的抑制是指至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％的抑制。在一些情况下，靶基因的蛋白质产物可以被抑制至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。该基因可以是野生型基因或具有至少一个突变的基因。靶蛋白可以是野生型蛋白质或具有至少一个突变的蛋白质。
[0177]
治疗性核酸可以调节与大脑疾病或病状有关的基因或由该基因表达的基因表达产物的表达或活性。例如，在一些情况下，治疗性核酸是本文描述的基因或该基因的经修饰的版本。在另一个实例中，治疗性核酸包括效应子基因表达产物，如对靶向其中的基因具有特异性的基因编辑组件。基因的非限制性实例包含肌聚糖α(sgca)、谷氨酸脱羧酶65(gad65)、谷氨酸脱羧酶67(gad67)、cln2基因、神经生长因子(ngf)、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)、神经营养素(neurturin)、运动神经元存活基因1、端粒(smn1)、[3-葡萄糖脑苷脂酶(gcase)、共济蛋白(fxn)、亨廷顿蛋白(htn)、甲基-cpg结合蛋白2(mecp2)、过氧化物酶体生物发生因子(pex)、颗粒蛋白前体(grn)、抗微管蛋白剂、铜锌超氧化物歧化酶(sod1)、葡萄糖基神经酰胺酶β(gba)、npc细胞内胆固醇转运体1(npc1)和nps3。在一些实施例中，过氧化物酶体生物发生因子(pex)选自由以下组成的组：pex1、pex2、pex3、pex4、pex5、pex6、pex7、pex10、pex11β、pex12、pex13、pex14、pex16、pex19和pex26。在一些情况下，基因或基因表达产物被抑制。在一些情况下，基因或基因表达产物被增强。
[0178]
治疗性核酸调节与特定器官(例如，肺、心脏、肝脏、肌肉、眼睛)的疾病或病状有关的基因或由该基因表达的基因表达产物的表达或活性。基因的非限制性实例包含囊性纤维化跨膜传导调节剂(cftr)、因子x(fix)、rpe65、类视黄醇异构水解酶(rpe65)、肌聚糖α
(sgca)和肌浆网/内质网ca2+-atp酶(serca2a)。在一些实施例中，治疗性基因表达产物源自人、鼠、鸟类、猪、牛、绵羊、猫、犬、马、epine、山羊、狼或灵长类动物。在一些情况下，基因或基因表达产物被抑制。在一些情况下，基因或基因表达产物被增强。
[0179]
本文公开了包括遗传信息(例如，异源核酸)的经修饰的病毒基因组，这些经修饰的病毒基因组通过病毒包装组装到raav中。在一些情况下，该病毒基因组来自选自由以下组成的组的aav血清型：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11和aav12。在一些情况下，该病毒基因组来自选自由aav-php.b、aav-php.eb和aav-php.s组成的组的经修饰的aav血清型。
[0180]
如本文描述的病毒基因组等病毒基因组可以包括转基因，该转基因在一些情况下编码异源基因表达产物(例如，治疗性基因表达产物、重组衣壳蛋白等)。转基因与侧接该转基因的两个反向末端重复序列(itr)是顺式的。转基因可以包括编码治疗性基因表达产物的治疗性核酸。由于raav的包装能力有限(～2.5kb)，在一些情况下，较长的转基因可能会在两个aav载体之间分裂，第一个具有3'剪接供体并且第二个具有5'剪接受体。在细胞共感染后，形成串联体，将该串联体剪接在一起以表达全长转基因。
[0181]
在一些情况下，病毒基因组是包括转基因的单链病毒dna。aav载体可以是游离的。在一些情况下，病毒基因组是串联体。游离病毒基因组可以在靶细胞中发展出不整合到靶细胞的基因组中的类似染色质的组织结构。当感染到非分裂细胞中时，靶细胞中的游离病毒基因组的稳定性实现了长期转基因表达。可替代地，aav载体主要在特定位点(例如，人染色体19上的aavs1)将转基因整合到靶细胞的基因组中。
[0182]
通常插入转基因，使得其表达由整合位点处的内源启动子(即驱动转基因插入其中的内源基因的表达的启动子)驱动。在一些情况下，转基因包括启动子和/或增强子，例如组成型启动子或诱导型或组织/细胞特异性启动子。作为非限制性实例，启动子可以是cmv启动子、cmv-β-肌动蛋白-内含子-β-球蛋白杂交启动子(cag)、cba启动子、frda或fxn启动子、ubc启动子、gusb启动子、nse启动子、突触蛋白启动子、mecp2启动子、gfap启动子、h1启动子、u6启动子、nfl启动子、nfh启动子、scn8a启动子或pgk启动子。作为非限制性实例，启动子可以是组织特异性表达元件，包含但不限于人延伸因子lα亚基(ef1α)、即刻早期巨细胞病毒(cmv)、鸡β-肌动蛋白(cba)和其衍生的cag、β葡萄糖醛酸酶(gusb)和泛素c(ubc)。转基因可以包含用于神经元的组织特异性表达元件，如但不限于神经元特异性烯醇化酶(nse)、血小板源性生长因子(pdgf)、血小板源性生长因子b链(pdgf-β)、突触蛋白(syn)、甲基-cpg结合蛋白2(mecp2)、ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(camkii)、代谢型谷氨酸受体2(mglur2)、nfl、nfh、np32、ppe、enk和eaat2启动子。转基因可以包括用于星形胶质细胞的组织特异性表达元件，如但不限于胶质原纤维酸性蛋白(gfap)和eaat2启动子。转基因可以包括用于少突胶质细胞的组织特异性表达元件，如但不限于髓鞘碱性蛋白(mbp)启动子。在一个实施例中，转基因包括位于编码的治疗性核酸的第一外显子上游大约～5kb处的区域，更具体地，位于编码的共济蛋白基因的第一外显子上游大约4.9kb处存在17bp的区域，以便允许与frda启动子一起表达(参见例如puspasari等人“人fxn基因表达的长距离调节(long range regulation of human fxn gene expression)”，《plos one(公共科学图书馆
·
综合)》,2011；该文献的内容通过全文引用的方式并入本文)。
[0183]
在一些实施例中，该启动子小于1kb。该启动子的长度可以为200、210、220、230、
240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或大于800。该启动子的长度可以介于200-300之间、介于200-400之间、介于200-500之间、介于200-600之间、介于200-700之间、介于200-800之间、介于300-400之间、介于300-500之间、介于300-600之间、介于300-700之间、介于300-800之间、介于400-500之间、介于400-600之间、介于400-700之间、介于400-800之间、介于500-600之间、介于500-700之间、介于500-800之间、介于600-700之间、介于600-800之间或介于700-800之间。该启动子可以在靶组织(如但不限于中枢神经系统和外周器官(例如，肺))中提供治疗性基因表达产物的表达持续一定时间段。治疗性基因表达产物的表达可以持续1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3周、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年、23年、24年、25年、26年、27年、28年、29年、30年、31年、32年、33年、34年、35年、36年、37年、38年、39年、40年、41年、42年、43年、44年、45年、46年、47年、48年、49年、50年、55年、60年、65年或多于65年。有效载荷的表达可以持续1-5小时、1-12小时、1-2天、1-5天、1-2周、1-3周、1-4周、1-2个月、1-4个月、1-6个月、2-6个月、3-6个月、3-9个月、4-8个月、6-12个月、1-2年、1-5年、2-5年、3-6年、3-8年、4-8年、或5-10年、或10-15年、或15-20年、或20-25年、或25-30年、或30-35年、或35-40年、或40-45年、或45-50年、或50-55年、或55-60年、或60-65年。
[0184]
本实施例的异源核酸和转基因也可以包含质粒载体。质粒载体可用于产生本文描述的重组aav(raav)颗粒。aav载体可以包括辅助病毒的基因组。重组raav的组装和将含有异源核酸的转基因包装到raav中需要辅助病毒蛋白。辅助病毒基因是在细胞中表达时辅助aav复制的腺病毒基因e4、e2a和va。在一些实施例中，aav载体包括e2。在一些实施例中，aav载体包括e4。在一些实施例中，aav载体包括va。在一些情况下，aav载体包括辅助病毒蛋白之一或其任何组合。
[0185]
质粒载体可以包括病毒基因组，该病毒基因组包括编码本文描述的重组aav(raav)衣壳蛋白的核酸。病毒基因组可以在第一开放阅读框(orf1)中包括编码rep蛋白的复制(rep)基因和编码aap蛋白的衣壳(cap)基因或者在第二开放阅读框(orf2)中包括cap蛋白。rep蛋白选自由以下组成的组：rep78、rep68、rep52和rep40。在一些情况下，修饰cap基因以编码本文描述的经修饰的aav衣壳蛋白。野生型cap基因编码三种蛋白vp1、vp2和vp3。在一些情况下，vp1被修饰。在一些情况下，vp2被修饰。在一些情况下，vp3被修饰。在一些情况下，所有三个vp1-vp3被修饰。aav载体可以包括编码野生型rep78、rep68、rep52、rep40和aap蛋白的核酸。
[0186]
在一些情况下，该质粒载体是细菌。在一些情况下，该质粒载体衍生自大肠杆菌(escherichia coli.)。在一些情况下，该核酸序列在5'到3'方向上包括：(1)5'反向末端重
复(itr)序列、(2)复制(rep)基因、(3)衣壳(cap)基因和(4)3'itr，其中该cap基因编码本文描述的aav衣壳蛋白。在一些情况下，该质粒载体编码假型aav衣壳蛋白。在一些情况下，该cap基因衍生自seq id no:6-10中的任一个中提供的脱氧核糖核酸(dna)。
[0187]
在一些情况下，该5'itr和该3'itr衍生自aav2血清型。在一些情况下，该5'itr和该3'itr衍生自aav5血清型。在一些情况下，该5'itr和该3'itr衍生自aav9血清型。
[0188]
本文公开了包括seq id no:12740-25468和35472-45474(其是编码本公开的raav衣壳蛋白的dna序列)中的任一个的质粒载体。在一些情况下，质粒载体包括与seq id no:46404-46423中提供的dna序列中的任一个dna序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的cap基因。本公开的质粒载体可以包括vp1 cap基因，其包括seq id no:6-10中的任一个。aav载体可以包括seq id no:6-10中的任一个的70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
[0189]
还公开了编码包括本公开的变体aav衣壳蛋白(例如，raav衣壳蛋白)的raav衣壳的核酸。在一些情况下，这些raav衣壳蛋白包括seq id no:46404-46423中的任一个中提供的dna序列，其编码在氨基酸位置452-458处具有7聚体取代的全长vp1蛋白。在一些情况下，该7聚体由seq id no:46364-46383中的任一个中提供的dna序列编码。
[0190]
此处提供了编码本公开的raav衣壳蛋白的质粒载体，这些质粒载体包括：(a)在图2-14中的任一个中提供的编码7聚体氨基酸序列的核酸序列；以及(b)核酸序列，该核酸序列是seq id no:6-10中的任一个的70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些情况下，将aav9(seq id no:6)修饰为包含seq id no:12740-25468和35472-45474中的任一个。在一些情况下，将aav-php.eb(seq id no:10)修饰为包含seq id no:12740-25468和35472-45474中的任一个。在一些情况下，将aav5(seq id no:7)修饰为包含seq id no:35472-45474中的任一个。在一些情况下，将aav-php.b(seq id no:8)修饰为包含seq id no:seq id no:12740-25468和35472-45474中的任一个。在一些情况下，将aav-php.s vp1(seq id no:9)修饰为包含seq id no:12740-25468和35472-45474中的任一个。本文描述的aav载体可以用于通过本文描述的方法产生变体aav衣壳。
[0191]
方法
[0192]
产生raav的方法
[0193]
本文公开了产生重组aav(raav)的方法。在一些情况下，使用本领域已知的合适方法将在靶细胞(例如，hek293细胞)中产生aav所需的所有元件瞬时转染到靶细胞中。例如，本公开的raav可以通过共转染三个质粒载体(具有含itr质粒的携带转基因(例如，治疗性核酸)的第一载体；携带aav rep和cap基因的第二载体；以及(3)提供从腺病毒分离的辅助基因的第三载体)产生。本文描述的方法产生不含腺病毒的高滴度aav载体。此处公开的cap基因包括seq id no:12740-25468和35472-45474中的任一个，其是编码本公开的经修饰的aav衣壳蛋白的dna序列。在一些情况下，使用在以下中描述的方法产生本公开的raav：challis,r.c.等人“用于在啮齿动物中广泛和靶向基因递送的全身性aav载体(systemic aav vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents)”.《自然实验手册(nat.protoc.)》14,379(2019)，该文献通过全文引用的方式特此并入。简而言之，使用聚乙烯亚胺(pei)执行hek293t细胞(atcc)的三重转染，在120小时后从细胞裂解液和培养
基中收集病毒并通过碘克沙醇纯化。
[0194]
本文公开了制造方法，这些制造方法包括：(a)将包括以下的核酸引入到细胞中：(i)编码治疗性基因表达产物的第一核酸序列，该第一核酸序列由5'和3'反向末端重复(itr)序列封闭；(ii)编码病毒基因组的第二核酸序列，该第二核酸序列包括5'itr序列、复制(rep)基因、衣壳(cap)基因和3'itr，其中该cap基因编码本文描述的aav衣壳蛋白；以及(iii)编码选自由e4orf6、e2a和va rna组成的组的第一辅助病毒蛋白和任选地包括ela或elb55k的第二辅助病毒蛋白的第三核酸序列；(b)在该细胞中表达本文描述的aav衣壳蛋白；(c)组装包括本文公开的aav衣壳蛋白的aav颗粒；以及(d)将该第一核酸序列包装在该aav颗粒中。在一些情况下，aav颗粒是raav衣壳，当在受试者的靶组织(例如，cns、pns、肺)中测量时，相对于参考aav衣壳，该raav衣壳的特异性增加，并且当在脱靶组织(例如，肝脏)中测量时，相对于参考aav衣壳，该raav衣壳的特异性降低。在一些情况下，这些方法进一步包括包装编码治疗性基因表达产物的第一核酸序列，使得其由raav衣壳蛋白衣壳化。在一些实施例中，使用合适的病毒纯化方法(如本文所述的那些)分离、浓缩和纯化raav颗粒。
[0195]
在非限制性实例中，通过使用标准转染方案(例如，用pei)对前体细胞(例如，hek293t)细胞进行三重转染来产生raav。在一定时间段后(例如，转染后72小时)从培养基中收获病毒颗粒，并且在稍后的时间点(例如，转染后120小时)从细胞和培养基中收获病毒颗粒。培养基中存在的病毒通过用8％聚乙二醇和500mm氯化钠沉淀进行浓缩，并且将沉淀的病毒添加到由收集的细胞制备的裂解物中。通过碘克沙醇(optiprep，西格马(sigma))逐步梯度(15％、25％、40％和60％)纯化病毒。将病毒浓缩并在pbs中调配。通过使用qpcr和作为对照的线性化的基因组质粒测量dnasel抗性载体基因组拷贝(vg)的数量来确定病毒滴度。
[0196]
rep蛋白可以选自由以下组成的组：rep78、rep68、rep52和rep40。aav辅助病毒的基因组包括选自由e2、e4和va组成的组的aav辅助基因。在一些情况下，该第一核酸序列和该第二核酸序列是反式的。在一些情况下，该第一核酸序列和该第二核酸序列是顺式的。在一些情况下，该第一核酸序列、该第二核酸序列和该第三核酸序列是反式的。
[0197]
该细胞可以选自由以下组成的组：人、灵长类动物、鼠、猫、犬、猪、绵羊、牛、马、epine、山羊和狼宿主细胞。在一些情况下，该细胞是祖细胞或前体细胞，如干细胞。在一些情况下，该干细胞是间充质细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞(ipsc)、成纤维细胞或其它组织特异性干细胞。该细胞可以是永生的。在一些情况下，该胚胎干细胞是人胚胎干细胞。在一些情况下，该人胚胎干细胞是人胚胎肾293(hek-293)细胞。在一些情况下，该细胞是分化的细胞。基于所提供的公开，预期此系统可以与任何转基因株系结合使用，该转基因株系在所关注的靶细胞类型中表达重组酶，以开发更高效地转导该靶细胞群体的aav衣壳。
[0198]
raav介导地递送异源核酸的方法
[0199]
本文公开了向有需要的受试者递送异源核酸(例如，本文公开的治疗性核酸或转基因)的方法。转基因可以由重组aav(raav)衣壳蛋白或raav颗粒(如本文描述的那些)衣壳化。
[0200]
方法可以是离体的，例如科学研究目的或用于产生过继性细胞疗法。受试者可以是人原代细胞或成熟细胞或细胞系。受试者可以是来自猴、仓鼠或小鼠的细胞。在任一种情况下，递送可以包含使组合物与细胞或细胞系接触。
[0201]
方法可以是体内的，例如治疗有需要的受试者的疾病或病状。在一些情况下，受试者可以是哺乳动物，如人或非人灵长类动物，在该情况下，组合物的递送可以包括将组合物施用于受试者。在一些实施例中，异源核酸的递送包括使用本文描述的施用途径中的任一种施用途径向受试者施用该组合物。在非限制性实例中，可以将使芳香族l-氨基酸脱羧酶缺乏症(aadc)基因衣壳化的raav静脉内施用到受试者以治疗aadc缺乏症。
[0202]
在一些实施例中，增加靶体内或离体组织中异源核酸转导的方法包括递送本文描述的raav颗粒，该raav被工程化以在靶体内环境(例如，组织或细胞类型)中具有增加的转导效率。在一些情况下，增加的转导效率包括相对于参考aav增加1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、75倍或100倍或更多倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少30倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少40倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少50倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少60倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少80倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少90倍。在一些情况下，增加的转导效率为至少100倍。
[0203]
在一些实施例中，降低脱靶体内或离体组织中异源核酸转导的方法包括递送本文描述的raav颗粒，该raav被工程化以使转导效率相对于参考aav降低1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、75倍或100倍或更多倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少20倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少30倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少40倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少50倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少60倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少80倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少90倍。在一些情况下，脱靶基因转移降低至少100倍。
[0204]
还提供了将异源核酸递送到靶体内环境的方法，这些方法包括递送本文描述的raav颗粒，该raav颗粒被工程化以与参考aav相比在靶体内或离体组织(例如，器官或细胞类型)中具有增加的特异性。在一些实施例中，raav颗粒已经被工程化以对脱靶体内或离体组织的特异性降低。在一些情况下，方法包括检测raav对靶体内或离体组织的特异性是否比参考aav对靶体内或离体组织的特异性高，其包含测量由raav衣壳化的异源核酸表达的基因表达产物(例如，rna或蛋白质)在获自受试者的靶体内环境的组织样品中的水平；并且将测得的水平与对照水平(例如由参考aav(例如，aav9)衣壳化的异源核酸表达的基因表达产物)进行比较。用于测量基因表达产物的表达的合适方法荧光素酶报告基因测定和定量聚合酶链式反应(qpcr)。
[0205]
在一些情况下，参考aav具有选自由以下组成的组的血清型：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12或其变体。例如，参考aav可以具有选自由aav-php.b、aav-php.eb和aav-php.s组成的组的血清型。
[0206]
递送到中枢神经系统或外周神经系统
[0207]
本文提供了将异源核酸递送到靶体内环境的方法，这些方法包括将组合物递送到
受试者的选自由中枢神经系统(cns)和外周神经系统(pns)组成组的靶体内环境，该组合物包括具有raav衣壳蛋白的raav颗粒，该raav衣壳蛋白使编码异源核酸(例如，治疗性核酸)的病毒载体衣壳化。在一些实施例中，使异源核酸衣壳化的raav颗粒包括raav衣壳蛋白，该raav衣壳蛋白被工程化为与参考aav相比，对受试者的cns或pns的特异性增加，并且在一些情况下，对cns或pns的转导效率增加，即使当全身施用于受试者时也是如此。
[0208]
方法包括递送包括raav衣壳蛋白的raav颗粒，与参考aav(例如，aav9、aav5)相比，该raav衣壳蛋白对受试者的cns或pns的特异性和/或转导效率增加。在一些情况下，该raav衣壳蛋白对外周器官(例如，肝脏)的特异性和/或转导效率降低。在一些情况下，递送是全身性的。可替代地，递送是直接的(例如，递送到cns或pns的受感染区中)。该raav衣壳蛋白可以包括亲本aav的氨基酸序列中的氨基酸序列中的至少一个氨基酸的取代，其中x1是a、d、g、l、n、q、s或t。该raav衣壳蛋白可以包括亲本aav的氨基酸序列中的至少两个氨基酸的取代，其中x1是a、d、g、l、n、q、s或t；并且x2是a、g、n、p、q、r、s或t。该raav可以包括亲本aav的氨基酸序列中的至少三个氨基的取代，其中x1是a、d、g、l、n、q、s或t；并且x2是a、g、n、p、q、r、s或t；并且x3是a、d、g、n、s或t。该raav可以包括亲本aav的氨基酸序列中的至少四个氨基酸的取代，其中x1是a、d、g、l、n、q、s或t；x2是a、g、n、p、q、r、s或t；x3是a、d、g、n、s或t；并且x4是a、d、g、k、n、p、q、s或t。该raav可以包括亲本aav的氨基酸序列中的至少五个氨基酸的取代，其中x1是a、d、g、l、n、q、s或t；x2是a、g、n、p、q、r、s或t；x3是a、d、g、n、s或t；x4是a、d、g、k、n、p、q、s或t；并且x5是a、g、k、n、p、r、s或t。该raav可以包括亲本aav的氨基酸序列中的至少六个氨基酸的取代，其中x1是a、d、g、l、n、q、s或t；x2是a、g、n、p、q、r、s或t；x3是a、d、g、n、s或t；x4是a、d、g、k、n、p、q、s或t；x5是a、g、k、n、p、r、s或t；并且x6是a、g、k、n、p、r、s、t或v。该raav可以包括亲本aav的氨基酸序列中的至少七个氨基酸的取代，其中x1是a、d、g、l、n、q、s或t；x2是a、g、n、p、q、r、s或t；x3是a、d、g、n、s或t；x4是a、d、g、k、n、p、q、s或t；x5是a、g、k、n、p、r、s或t；x6是a、g、k、n、p、r、s、t或v；并且x7是a、g、k、l、r、s、t或v。
[0209]
在一些情况下，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7是连续的(x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7)。x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的任何两个、三个、四个、五个、六个或七个可以是连续的。在一些实施例中，x1在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置452处。在一些实施例中，x2在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置453处。在一些实施例中，x3在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置454处。在一些实施例中，x4在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置455处。在一些实施例中，x5在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置456处。在一些实施例中，x6在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置457处。在一些实施例中，x7在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置458处。
[0210]
本文公开的方法提供了递送包括raav衣壳蛋白的raav颗粒，与参考aav相比，该raav衣壳蛋白对受试者的cns或pns的特异性和/或转导效率增加，其中取代包括在aav9衣壳蛋白(vp1编号)、其变体或在不同aav血清型中的等效氨基酸位置的氨基酸序列中的n452d、n452a、n452g、n452l、n452q、n452s、n452t、g453i、g453n、g453s、g453p、g453r、g453t、s454a、s454q、s454d、s454g、s454n、s454t、g455a、g455s、g455d、g455k、g455n、g455p、g455q、g455t、q456t、q456s、q456a、q456g、q456k、q456n、q456r、q456p、n457k、n457a、n457g、n457p、n457r、n457s、n457t、n457v、q458n、q458a、q458g、q458k、q458l、q458r、q458s、q458t或q458v。在一些实施例中，方法包括递送包括raav衣壳蛋白的raav颗
粒，该raav衣壳蛋白包括在seq id no:11-12739中的任一个中提供的氨基酸序列中的一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。该取代可以包括来自选自由以下组成的组的氨基酸序列和表1或表2中提供的任何氨基酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸：lqtsspg(seq id no:2933)、qqgkqsv(seq id no:79)、sintktn(seq id no:45475)、sngtkqt(seq id no:442)、gsgktaa(seq id no:88)、mgdkptr(seq id no:2466)、qpsggnt(seq id no:2672)、ergantk(seq id no:5192)、ttgghss(seq id no:2743)、gttktse(seq id no:3064)、gtgtsvl(seq id no:11958)、nqsgtkg(seq id no:780)、kgpgqmg(seq id no:45476)和gtpskag(seq id no:2741)。在一些实施例中，适合于将异源核酸递送到受试者的cns或pns的raav衣壳蛋白也可以具有在氨基酸位置588(aav9 vp1编号)处的氨基酸序列的插入。在一些情况下，该raav衣壳蛋白对肝脏的特异性和/或转导效率降低。在一些实施例中，该取代在亲本aav9衣壳蛋白或其变体中的氨基酸452-458处不由氨基酸序列ilgtgts(seq id no:45479)或qssqtpr(seq id no:45480)组成。在一些实施例中，适合于将异源核酸递送到受试者的cns或pns的raav衣壳蛋白也可以具有在氨基酸位置588(aav9 vp1编号)处的氨基酸序列的插入。
[0211]
本文公开了包括将使异源核酸衣壳化的raav颗粒递送到受试者的cns或pns的方法，该raav颗粒包括：(i)该异源核酸对cns或pns的特异性和/或转导效率增加，以及(ii)该异源核酸对肝脏的特异性和/或转导效率降低，其中该raav颗粒具有raav衣壳蛋白，该raav衣壳蛋白包括在aav9衣壳蛋白或其变体或在不同aav血清型中的等效氨基酸位置的氨基酸序列中的选自由以下组成的组的取代：n452d、n452g、n452a、n452v、n452s、n452h、n452l、n452e、n452q、g452a、g452i、g452t、g452p、g452r、g452t、g452s、g452k、g452h、s454a、s454n、s454d、s454g、s454t、s454h、s454k、s454q、g455a、g455n、g455t、g455s、g455d、g455p、g455r、g455q、q456t、q456s、q456k、q456p、q456g、q456d、q456v、q456a、q456n、n457k、n457t、n457a、n457r、n457s、n457g、n457d、n457p、n457v、q458n、q458g、q458s、q458l、q458a、q458e和q458k。在一些情况下，取代是氨基酸序列dgaatkn(seq id no:3943)的至少或约一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些情况下，取代是氨基酸序列dgqssks(seq id no:2764)的至少或约一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些情况下，取代是表1或表2中提供的任何氨基酸序列。在一些实施例中，递送是全身性的。在一些实施例中，递送是直接的(例如，注射到体内环境中)。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白是aav9衣壳蛋白(例如，在seq id no:1中提供)。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白是aav9变体衣壳蛋白aav-php.b(seq id no:3)。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白是aav9变体衣壳蛋白aav-php.eb(seq id no:5)。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白进一步包括在亲本aav(aav9 vp1编号)的氨基酸序列的氨基酸位置588-589中的氨基酸的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，递送比通过参考aav(例如，aav9)进行的异源核酸的递送更具特异性。在一些实施例中，方法进一步包括减少或消除异源核酸递送在脱靶体内环境(如肝脏)中。在一些实施例中，递送的特征在于与参考aav在cns或pns中的转导效率相比，在cns或pns中的(例如，异源核酸的)转导效率增加。在一些实施例中，递送是全身性的(例如，静脉内)。在一些实施例中，受试者是人或非人灵长类动物。
[0212]
递送到靶器官或组织
[0213]
在一些情况下，递送异源核酸的方法包括向受试者的靶体内环境递送组合物，该组合物包括具有raav衣壳蛋白的raav颗粒，该raav衣壳蛋白使编码异源核酸(例如，治疗性核酸)的病毒载体衣壳化。在一些情况下，该靶体内环境是肝脏、肠、心脏、肺、生殖器官、肌肉、动物脂肪、胰腺、大脑或脾脏。在一些实施例中，使异源核酸衣壳化的raav颗粒包括raav衣壳蛋白，该raav衣壳蛋白被工程化为对受试者的靶体内环境的特异性增加，并且在一些情况下，对靶体内环境的转导效率增加，即使当全身施用于受试者时也是如此。
[0214]
本文公开了包括向受试者递送使异源核酸衣壳化的raav颗粒的方法，该raav包括raav衣壳蛋白，当在受试者的心脏中测量时，与参考aav(例如aav9、aav5)相比，该raav衣壳蛋白具有增加的异源核酸的特异性和/或转导效率。在一些实施例中，经优化用于靶向心脏的raav具有包括在seq id no:25469-26205中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，方法包括递送包括raav衣壳蛋白的raav颗粒，当在受试者的肺中测量时，与参考aav(例如，aav9、aav5)相比，该raav衣壳蛋白具有增加的异源核酸的特异性和/或转导效率。在一些实施例中，经优化用于靶向肺的raav具有包括在seq id no:32537-34198中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，方法包括递送包括raav衣壳蛋白的raav颗粒，当在受试者的肝脏中测量时，与参考aav(例如，aav9、aav5)相比，该raav衣壳蛋白具有增加的异源核酸的特异性和/或转导效率。在一些实施例中，经优化用于靶向肝脏的raav具有包括在seq id no:30720-30923中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，方法包括递送包括raav衣壳蛋白的raav颗粒，当在受试者的肠中测量时，与参考aav(例如，aav9、aav5)相比，该raav衣壳蛋白具有增加的异源核酸的特异性和/或转导效率。在一些实施例中，经优化用于靶向肠的raav具有包括在seq id no:26206-26873中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，方法包括递送包括raav衣壳蛋白的raav颗粒，当在受试者的胃中测量时，与参考aav(例如，aav9、aav5)相比，该raav衣壳蛋白具有增加的异源核酸的特异性和/或转导效率。在一些实施例中，经优化用于靶向胃的raav具有包括在seq id no:31873-32060中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，方法包括递送包括raav衣壳蛋白的raav颗粒，当在受试者的脾脏中测量时，与参考aav(例如，aav9、aav5)相比，该raav衣壳蛋白具有增加的异源核酸的特异性和/或转导效率。在一些实施例中，经优化用于靶向脾脏的raav具有包括在seq id no:31468-31872中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，方法包括递送包括raav衣壳蛋白的raav颗粒，当在受试者的肾脏中测量时，与参考aav(例如，aav9、aav5)相比，该raav衣壳蛋白具有增加的异源核酸的特异性和/或转导效率。在一些实施例中，经优化用于靶向肾脏的raav具有包括在seq id no:26874-30719中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，方法包括递送包括raav衣壳蛋白的raav颗粒，当在受试者的脂肪中测量时，与参考aav(例如，aav9、aav5)相比，该raav衣壳蛋白具有增加的异源核酸的特异性和/或转导效率。在一些实施例中，经优化用于靶向脂肪(动物脂肪)的raav具有包括在seq id no:34199-35471中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0215]
本文提供了包括向受试者递送raav颗粒的方法，该raav包括raav衣壳蛋白，与参考aav(例如aav9、aav5)相比，该raav衣壳蛋白针对受试者的肌肉具有增加的异源核酸的特异性和/或转导效率。在一些实施例中，经优化用于靶向肌肉的raav具有包括在seq id no:30924-31451中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。该肌肉可以是心肌。该肌肉可以是骨骼
肌。在一些实施例中，方法包括递送包括raav衣壳蛋白的raav颗粒，与参考aav(例如，aav9、aav5)相比，该raav衣壳蛋白针对受试者的胰腺具有增加的异源核酸的特异性和/或转导效率。在一些实施例中，经优化用于靶向胰腺的raav具有包括seq id no:31452-31467中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，方法包括递送包括raav衣壳蛋白的raav颗粒，与参考aav(例如，aav9、aav5)相比，该raav衣壳蛋白针对受试者的一个或多个生殖器官具有增加的异源核酸的特异性和/或转导效率。在一些实施例中，经优化用于靶向生殖器官(如睾丸)的raav包含包括seq id no:32061-32536中提供的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些情况下，该生殖器官是卵巢。
[0216]
适合于将异源核酸递送到肝脏、肠、心脏、肺、生殖器官、肌肉、动物脂肪、胰腺、大脑或脾脏的raav衣壳蛋白可以包括亲本aav衣壳蛋白中的至少一个氨基酸的取代。在一些实施例中，x1是k、r、n或t。该raav衣壳蛋白可以包括亲本aav衣壳蛋白中的至少两个氨基酸的取代或插入。在一些实施例中，x1是k、r、n或t；并且x2是d、e、n或v。该raav衣壳蛋白可以包括亲本aav衣壳蛋白中的至少三个氨基酸的取代或插入。在一些实施例中，x1是k、r、n或t；x2是d、e、n或v；并且x3是n、s、l或p。该raav衣壳蛋白可以包括亲本aav衣壳蛋白中的至少四个氨基酸的取代或插入。在一些实施例中，x1是k、r、n或t；x2是d、e、n或v；x3是n、s、l或p；并且x4是t、s、p或l。该raav衣壳蛋白可以包括亲本aav衣壳蛋白中的至少五个氨基酸的取代或插入。在一些实施例中，x1是k、r、n或t；x2是d、e、n或v；x3是n、s、l或p；x4是t、s、p或l；并且x5是p、r或s。该raav衣壳蛋白可以包括亲本aav衣壳蛋白中的至少六个氨基酸的取代或插入。在一些实施例中，x1是k、r、n或t；x2是d、e、n或v；x3是n、s、l或p；x4是t、s、p或l；x5是p、r或s；并且x6是g、s、n或t。该raav衣壳蛋白可以包括亲本aav衣壳蛋白中的至少七个氨基酸的取代或插入。在一些实施例中，x1是k、r、n或t；x2是d、e、n或v；x3是n、s、l或p；ix4是t、s、p或l；x5是p、r或s；x6是g、s、n或t；并且x7是r、l或i。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7是连续的(x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7)。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7中的任何两个、三个、四个、五个、六个或七个是连续的。在一些实施例中，x1、x2、x3、x4、x5、x6和x7不是连续的。在一些实施例中，x1在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置452处。在一些实施例中，x2在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置453处。在一些实施例中，x3在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置454处。在一些实施例中，x4在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置455处。在一些实施例中，x5在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置456处。在一些实施例中，x6在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置457处。在一些实施例中，x7在aav9衣壳蛋白或其变体内的氨基酸位置458处。在一些实施例中，该取代在亲本aav9衣壳蛋白或其变体中的氨基酸452-458处不由氨基酸序列ilgtgts(seq id no:45479)或qssqtpr(seq id no:45480)组成。在一些实施例中，适合于将异源核酸递送到受试者的靶体内环境的raav衣壳蛋白也可以具有在氨基酸位置588(aav9 vp1编号)处的氨基酸序列的插入。
[0217]
本文公开了包括将使异源核酸衣壳化的raav颗粒递送到受试者的靶体内环境的方法，该靶体内环境选自由以下组成的组：肝脏、肠、心脏、肺、生殖器官、肌肉、动物脂肪、胰腺、大脑和脾脏，该raav颗粒包括异源核酸对靶体内环境的增加的特异性和/或转导效率，其中该raav颗粒具有raav衣壳蛋白，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav衣壳蛋白的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列kdntpgr(seq id no:32538)、nnlprnl(seq id no:32867)、
resspsl(seq id no:29065)或rvplsti(seq id no:26933)的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白是aav9衣壳蛋白(例如，在seq id no:1中提供)。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白是aav5衣壳蛋白(例如，在seq id no:2中提供)。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白是aav9变体衣壳蛋白aav-php.b(seq id no:3)。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白是aav9变体衣壳蛋白aav-php.eb(seq id no:5)。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白进一步包括在亲本aav(aav9 vp1编号)的氨基酸序列的氨基酸位置588-589中的氨基酸的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，递送比通过参考aav(例如，aav9)进行的异源核酸的递送更具特异性。在一些实施例中，方法进一步包括与参考aav相比减少或消除异源核酸递送在脱靶体内环境(如肝脏)中。在一些实施例中，递送的特征在于与参考aav在靶体内环境中的转导效率相比，在靶体内环境中的(例如，异源核酸的)转导效率增加。在一些实施例中，递送是全身性的(例如，静脉内)。在一些实施例中，受试者是人或非人灵长类动物。
[0218]
治疗方法
[0219]
本文公开了治疗受试者的疾病或病状或该疾病或病状的症状的方法，这些方法包括向该受试者施用治疗有效量的本文公开的一种或多种组合物(例如，raav颗粒、aav载体、药物调配物和组合物)。在一些实施例中，该组合物是本文描述的raav衣壳蛋白。在一些实施例中，该组合物是本文描述的分离和纯化的raav衣壳蛋白。在一些实施例中，该raav颗粒使包括转基因的异源核酸(例如，治疗性核酸)衣壳化。在一些实施例中，该组合物是与本文公开的治疗剂缀合的本文描述的raav衣壳蛋白。在一些实施例中，该组合物是包括该raav颗粒和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施例中，将该一种或多种组合物单独施用到受试者(例如，独立疗法)。在一些实施例中，将该一种或多种组合物与另外的药剂组合施用。在一些实施例中，该组合物是用于该疾病或病状的第一线疗法。在一些实施例中，该组合物是用于该疾病或病状的第二线、第三线或第四线疗法。
[0220]
本文提供了治疗受试者的疾病或病状或该疾病或病状的症状的方法，这些方法包括：(a)诊断患有影响靶体内环境的疾病或病状的受试者；以及(b)通过向该受试者施用治疗有效量的本文公开的组合物(例如，raav颗粒、aav载体、药物组合物)来治疗该疾病或病状，其中该组合物被工程化以对靶体内环境的特异性增加。在一些情况下，该组合物被工程化以对脱靶体内环境(例如，肝脏)的特异性降低。
[0221]
本文公开了治疗受试者的患及靶体内环境的疾病或病状或该疾病或病状的症状的方法，这些方法包括：(a)向该受试者施用组合物(例如，raav颗粒、aav载体、药物组合物)；以及(b)与参考aav相比，以增加的特异性和/或转导效率将治疗性核酸表达到该受试者的靶体内环境中。在一些情况下，参考aav是aav9或aav5或其变体。
[0222]
治疗影响中枢神经系统(cns)或外周神经系统(pns)的疾病或病状的方法包括向受试者施用raav颗粒，该raav颗粒包括raav衣壳蛋白，该raav衣壳蛋白包括在亲本aav衣壳蛋白的氨基酸位置452-458处的氨基酸序列dgaatkn(seq id no:3943)或dgqssks(seq id no:2764)、lqtsspg(seq id no:2933)、qqgkqsv(seq id no:79)、sintktn(seq id no:45475)、sngtkqt(seq id no:442)、gsgktaa(seq id no:88)、mgdkptr(seq id no:2466)、qpsggnt(seq id no:2672)、ergantk(seq id no:5192)、ttgghss(seq id no:2743)、gttktse(seq id no:3064)、gtgtsvl(seq id no:11958)、nqsgtkg(seq id no:780)、
kgpgqmg(seq id no:45476)、gtpskag(seq id no:2741)以及表1、表2、图2或图3中提供的任何氨基酸序列的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，该raav衣壳蛋白包括在seq id no:46384-46399中的何一个中提供的氨基酸序列。
[0223]
在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白是aav9衣壳蛋白(例如，在seq id no:1中提供)。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白是aav9变体衣壳蛋白aav-php.b(seq id no:3)。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白是aav9变体衣壳蛋白aav-php.eb(seq id no:5)。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白进一步包括在亲本aav(aav9vp1编号)的氨基酸序列的氨基酸位置588-589中的氨基酸的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，递送比通过参考aav(例如，aav9)进行的异源核酸的递送更具特异性。在一些实施例中，方法进一步包括减少或消除异源核酸递送在脱靶体内环境(如肝脏)中。在一些实施例中，递送的特征在于与参考aav在cns或pns中的转导效率相比，在cns或pns中的(例如，异源核酸的)转导效率增加。在一些实施例中，递送是全身性的(例如，静脉内)。在一些实施例中，受试者是人或非人灵长类动物。
[0224]
治疗患及选自由以下组成的组的靶体内环境的疾病或病状的方法包括向受试者施用包括图4-14中的任一幅图中提供的氨基酸的raav颗粒：肝脏、肠、心脏、肺、生殖器官、肌肉、动物脂肪、胰腺、大脑或脾脏，该raav颗粒包括raav衣壳蛋白，该raav衣壳蛋白包括在seq id no:25469-26205中的任一个中提供的氨基酸序列的至少或约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸的取代。在一些实施例中，方法包括递送在亲本aav衣壳蛋白的氨基酸位置452-458处包括氨基酸序列kdntpgr(seq id no:32538)或nnlprnl(seq id no:32867)的raav颗粒，从而靶向肺。在一些实施例中，方法包括递送在亲本aav衣壳蛋白的氨基酸位置452-458处包括氨基酸序列resspsl(seq id no:26474)的raav颗粒，从而靶向肠。在一些实施例中，方法包括递送在亲本aav衣壳蛋白的氨基酸位置452-458处包括氨基酸序列rvplsti(seq id no:26933)或resspsl(seq id no:29065)的raav颗粒，从而靶向肾脏。在一些实施例中，方法包括递送在亲本aav衣壳蛋白的氨基酸位置452-458处包括氨基酸序列resspsl(seq id no:31904)的raav颗粒，从而靶向胃。在一些实施例中，raav衣壳蛋白包括在seq id no:46400-46403中的任一个中提供的氨基酸序列。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白是aav9衣壳蛋白(例如，在seq id no:1中提供)。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白是aav5衣壳蛋白(例如，在seq id no:2中提供)。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白是aav9变体衣壳蛋白aav-php.b(seq id no:3)。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白是aav9变体衣壳蛋白aav-php.eb(seq id no:5)。在一些实施例中，亲本aav衣壳蛋白进一步包括在亲本aav(aav9 vp1编号)的氨基酸序列的氨基酸位置588-589中的氨基酸的至少或约三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个氨基酸的插入。在一些实施例中，递送比通过参考aav(例如，aav9)进行的异源核酸的递送更具特异性。在一些实施例中，方法进一步包括减少或消除异源核酸递送在脱靶体内环境(如肝脏)中。在一些实施例中，递送的特征在于与参考aav在靶体内环境中的转导效率相比，在靶体内环境中的(例如，异源核酸的)转导效率增加。在一些实施例中，递送是全身性的(例如，静脉内或鼻内)。在一些实施例中，受试者是人或非人灵长类动物。
[0225]
还提供了调节靶基因表达产物的方法，这些方法包括向有需要的受试者施用本文公开的组合物(例如，raav颗粒、aav载体、药物组合物)。例如，本文提供的方法包括向受试
者施用具有raav衣壳蛋白的raav，该raav衣壳蛋白使病毒载体衣壳化，该病毒载体包括调节靶基因表达产物的表达或活性的异源核酸。在一些实施例中，与正常个体相比，疾病或病状的特征在于基因或其基因表达产物的表达或活性增加或增强。在一些情况下，施用治疗有效量的组合物使基因或其基因表达产物的表达或活性恢复到正常个体中典型的水平。术语“正常个体”是指未受影响的个体，即不患有以该基因或其基因表达产物的表达或活性的变化为特征的疾病或病状的个体。
[0226]
与中枢神经系统(cns)疾病或病症有关的基因的非限制性实例包含肌聚糖α(sgca)、谷氨酸脱羧酶65(gad65)、谷氨酸脱羧酶67(gad67)、cln2基因、神经生长因子(ngf)、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)、神经营养素(neurturin)、运动神经元存活基因1、端粒(smn1)、[3-葡萄糖脑苷脂酶(gcase)、共济蛋白(fxn)、亨廷顿蛋白(htn)、甲基-cpg结合蛋白2(mecp2)、过氧化物酶体生物发生因子(pex)、颗粒蛋白前体(grn)、抗微管蛋白剂、铜锌超氧化物歧化酶(sod1)、葡萄糖基神经酰胺酶β(gba)、npc细胞内胆固醇转运体1(npc1)和nps3。在一些实施例中，过氧化物酶体生物发生因子(pex)选自由以下组成的组：pex1、pex2、pex3、pex4、pex5、pex6、pex7、pex10、pex11β、pex12、pex13、pex14、pex16、pex19和pex26。与特定器官(例如，肺、心脏、肝脏、肌肉、眼睛)的疾病或病症有关的基因的非限制性实例包含囊性纤维化跨膜传导调节剂(cftr)、因子x(fix)、rpe65、类视黄醇异构水解酶(rpe65)、肌聚糖α(sgca)和肌浆网/内质网ca2+-atp酶(serca2a)。在一些情况下，通过将该组合物施用于受试者来抑制基因的表达或基因表达产物的表达或活性。在一些情况下，通过将该组合物施用于受试者来增强基因的表达或基因表达产物的表达或活性。
[0227]
在一些情况下，该组合物以在足以每天、一天一次或多次递送约0.0001mg/kg到约100mg/kg、约0.001mg/kg到约0.05mg/kg、约0.005mg/kg到约0.05mg/kg、约0.001mg/kg到约0.005mg/kg、约0.05mg/kg到约0.5mg/kg、约0.01mg/kg到约50mg/kg、约0.1mg/kg到约40mg/kg、约0.5mg/kg到约30mg/kg、约0.01mg/kg到约10mg/kg、约0.1mg/kg到约10mg/kg或约1mg/kg到约25mg/kg受试者体重的剂量水平下施用以获得期望的治疗效果。
[0228]
在一些情况下，所施用的组合物的病毒基因组(vg)浓度介于1.0
×
10
11
vg/千克(kg)与1.0
×
10
16
vg/kg之间。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为至少或约107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
、10
15
、10
16
或10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为2
×
107、2
×
108、2
×
109、2
×
10
10
、2
×
10
11
、2
×
10
12
、2
×
10
13
、2
×
10
14
、2
×
10
15
、2
×
10
16
或2
×
10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度3
×
107、3
×
108、3
×
109、3
×
10
10
、3
×
10
11
、3
×
10
12
、3
×
10
13
、3
×
10
14
、3
×
10
15
、3
×
10
16
或3
×
10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度4
×
107、4
×
108、4
×
109、4
×
10
10
、4
×
10
11
、4
×
10
12
、4
×
10
13
、4
×
10
14
、4
×
10
15
、4
×
10
16
或4
×
10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度5
×
107、5
×
108、5
×
109、5
×
10
10
、5
×
10
11
、5
×
10
12
、5
×
10
13
、5
×
10
14
、5
×
10
15
、5
×
10
16
或5
×
10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度6
×
107、6
×
108、6
×
109、6
×
10
10
、6
×
10
11
、6
×
10
12
、6
×
10
13
、6
×
10
14
、6
×
10
15
、6
×
10
16
或6
×
10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度7
×
107、7
×
108、7
×
109、7
×
10
10
、7
×
10
11
、7
×
10
12
、7
×
10
13
、7
×
10
14
、7
×
10
15
、7
×
10
16
或7
×
10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度8
×
107、8
×
108、8
×
109、8
×
10
10
、8
×
10
11
、8
×
10
12
、8
×
10
13
、8
×
10
14
、8
×
10
15
、8
×
10
16
或8
×
10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度9
×
107、9
×
108、9
×
109、9
×
10
10
、9
×
10
11
、9
×
10
12
、9
×
10
13
、9
×
10
14
、9
×
10
15
、9
×
10
16
或9
×
10
17
。
[0229]
在一些实施例中，将施用步骤执行一次。可替代地，将施用步骤重复至少两次。施
syndrome)、宾斯旺格氏病(binswanger's disease)、眼睑痉挛、布洛克-苏兹贝格综合征(bloch-sulzberger syndrome)、臂丛神经产伤、臂神经丛损伤、布拉德伯里-埃格莱斯顿综合征(bradbury-eggleston syndrome)、脑和脊柱肿瘤、脑动脉瘤、脑损伤、脊髓侧方压迫-脊髓半断综合征(brown-sequard syndrome)、脊髓延髓性肌肉萎缩症、伴有皮质下梗死和白质脑病的脑常染色体显性动脉病(cadasil)、卡纳万病(canavan disease)、腕管综合征、灼痛、海绵状瘤、海绵状血管瘤、海绵状静脉畸形、中央颈脊髓综合征、脊髓中央综合征、中枢疼痛综合征、脑桥中部髓鞘溶解、脑病症、神经酰胺酶缺乏症、小脑变性、小脑发育不全、脑动脉瘤、脑动脉硬化、脑萎缩、脑型脚气病、脑海绵状静脉畸形、脑性巨人症、脑缺氧、脑性瘫痪、脑-眼-面-骨骼综合征(cerebro-oculo-facio-skeletal syndrome，cofs)、夏-马-图病(charcot-marie-tooth disease)、夏-马-图综合征(charcot-marie-tooth syndrome)、经典肢近端型点状软骨发育不良(rcdp)、小脑扁桃体下疝畸形(chiari malformation)、胆固醇酯贮积病、舞蹈病、舞蹈棘状红血球症(choreoacanthocytosis)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)、慢性立位耐力不良、慢性疼痛、ii型库卡因综合征、科芬-劳里综合征(coffin lowry syndrome)、空洞脑(colpocephaly)、昏迷、复杂区域性疼痛综合征、先天性双侧面瘫、先天性肌无力、先天性肌病、先天性血管海绵状畸形、皮质基底节变性、颅动脉炎、颅缝早闭、克里脑炎(cree encephalitis)、克鲁兹佛得-雅克病(creutzfeldt-jakob disease)、累积性创伤病症、库欣综合征(cushing's syndrome)、巨细胞包涵体疾病、巨细胞病毒感染、舞蹈眼-舞蹈脚综合征(dancing eyes-dancing feet syndrome)、丹迪-沃克综合征(dandy-walker syndrome)、道森氏病(dawson disease)、耳聋、德默西耶氏症(de morsier's syndrome)、德热里纳-克隆普克麻痹(dejerine-klumpke palsy)、痴呆、痴呆-多发梗塞(dementia-multi-infarct)、痴呆-语义(dementia-semantic)、痴呆-皮质下(dementia-subcortical)、路易体痴呆、齿状小脑共济失调、齿状红核萎缩、皮肌炎、发展性运动障碍、德维奇综合征(devic's syndrome)、糖尿病性神经病、弥漫性硬化症、德拉韦综合征(dravet syndrome)、杜氏肌营养不良、家族性自主神经异常、书写障碍、诵读困难、吞咽困难、运用障碍、肌阵挛性小脑协调障碍、进行性小脑协同失调、肌张力障碍、早期小儿癫痫性脑病、空蝶鞍综合征、脑炎、嗜睡性脑炎、脑膨出、脑病、脑病(家族性婴儿)、脑三叉神经血管瘤病(encephalotrigeminal angiomatosis)、癫痫、癫痫半身不遂、欧勃氏麻痹(erb's palsy)、埃布-杜尚和德热里纳-克隆普克麻痹(erb-duchenne and dejerine-klumpke palsies)、原发性震颤、脑桥外髓鞘溶解、法布里病(fabry disease)、法尔氏综合征(fahr's syndrome)、昏厥、家族性自主神经功能异常、家族性血管瘤、家族性特发性基底神经节钙化、家族性周期性麻痹、家族性痉挛性麻痹、费伯氏肌病(farber's disease)、高热惊厥(febrile seizures)、肌纤维发育不良、费希尔氏综合征(fisher syndrome)、婴儿低肌张力综合征、足下垂、弗里德里希共济失调(friedreich's ataxia)、额颞叶痴呆、戈谢病(gaucher disease)、广义神经节苷脂沉积症、格斯曼氏综合征(gerstmann's syndrome)、格斯特曼-施特劳斯勒-申克病(gerstmann-straussler-scheinker disease)、巨轴索神经病、巨细胞动脉炎、巨细胞包涵体疾病、成胶质细胞瘤、类球状细胞白质营养不良症、舌咽神经痛、糖原贮积病、格林-巴利综合征(guillain-barre syndrome)、哈勒沃登-斯帕茨病(hallervorden-spatz disease)、头部受伤、头痛、连续性半侧颅痛、半面痉挛、交替偏瘫(hemiplegia alterans)、遗传性神经病、遗传性痉挛性截瘫、多神经炎型遗传性共济失调、
带状疱疹、耳带状疱疹、平山综合征(hirayama syndrome)、福尔摩斯-阿迪综合征(holmes-adie syndrome)、前脑无裂畸形、htlv-1相关性脊髓病、休斯综合征(hughes syndrome)、亨廷顿氏病、积水性无脑、脑积水、脑积水-常压、脊髓积水、皮质醇过多症、睡眠过度、张力过强、张力减退、低氧、免疫介导性脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴儿肌张力过低症、婴儿神经轴索营养不良、婴儿植烷酸贮积病、婴儿雷弗素姆病、婴儿痉挛、枕骨裂露脑畸形、肠脂代谢障碍症、颅内囊肿、颅内高压、艾萨克氏综合征(isaacs'syndrome)、朱伯特综合征(joubert syndrome)、基恩斯-赛尔综合征(keams-sayre syndrome)、肯尼迪氏病(kennedy's disease)、金斯布姆综合征(kinsboume syndrome)、克莱因-莱文综合征(kleine-levin syndrome)、克莱普尔-菲尔综合征(klippel-feil syndrome)、克莱普尔-特雷纳奈综合征(klippel-trenaunay syndrome，kts)、克利弗-布西综合征(kliiver-bucy syndrome)、科萨科夫氏遗忘症(korsakoffs amnesic syndrome)、克拉贝病(krabbe disease)、库格伯格-韦兰德病(kugelberg-welander disease)、苦鲁病(kuru)、莱伯特-伊顿肌无力综合征(lambert-eaton myasthenic syndrome)、兰道-克莱夫纳综合征(landau-kleffner syndrome)、股外侧皮神经卡压、延髓外侧综合征、学习障碍、利氏病(leigh's disease)、伦诺克斯-盖斯托综合征(lennox-gastaut syndrome)、莱施-奈恩综合征(lesch-nyhan syndrome)、脑白质营养不良、莱文-克里奇利综合征(levine-critchley syndrome)、路易体痴呆、类脂贮存病、类脂蛋白沉积症、无脑回畸形、闭锁综合征、鲁盖瑞氏症(lou gehrig's disease)、狼疮-神经性后遗症、莱姆病-神经系统并发症、马查多-约瑟夫病(machado-joseph disease)、巨脑、巨脑畸形、梅－罗综合征(melkersson-rosenthal syndrome)、脑膜炎、脑膜炎和脑炎、门克斯病(menkes disease)、感觉异常性股痛、异染性白质营养不良、头小畸型、偏头痛、米勒-费雪综合征(miller fisher syndrome)、小中风、线粒体肌病、莫比斯综合征(moebius syndrome)、单肢肌萎缩、运动神经元疾病、烟雾病(moyamoya disease)、粘脂贮积病(mucolipidoses)、黏多糖贮积症、多发性梗塞性痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化症、多系统萎缩、体位性低血压的多系统萎缩、肌营养不良、肌无力-先天性、重症肌无力、髓鞘破坏性弥漫性硬化、婴儿肌阵挛性脑病、肌阵挛、肌病、肌病-先天性、肌病-甲状腺毒性、肌强直、先天性肌强直、发作性睡病、神经棘细胞症、伴有脑铁蓄积的神经变性、神经纤维瘤病、抗精神病药物恶性综合征、aids的神经系统并发症、莱姆病的神经系统并发症、巨细胞病毒感染的神经系统后果、蓬佩病的神经系统表现、狼疮的神经系统后遗症、视神经脊髓炎、神经性肌强直、神经元蜡样质脂褐质沉积症、神经元迁移病症、神经病-遗传性、神经结节病、神经梅毒、神经毒性、海绵状血管瘤、尼曼-皮克病(niemann-pick disease)、奥沙利文-麦克劳德综合征(o'sullivan-mcleod syndrome)、枕神经痛、大田原综合征(ohtahara syndrome)、橄榄体脑桥小脑萎缩、斜视眼阵挛肌阵挛、直立性低血压、过度使用综合征、疼痛-慢性、泛酸激酶相关神经变性、副肿瘤综合征、感觉异常、帕金森氏病、阵发性舞蹈手足徐动症、阵发性偏头痛、帕里-罗姆伯格病(parry-romberg)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(pelizaeus-merzbacher disease)、佩娜舒凯尔ii综合征(pena shokeir ii syndrome)、神经周围囊肿、周期性瘫痪、周围神经病变、脑室周围白质软化、持续性植物状态、广泛性发育障碍、植烷酸贮积病、皮克氏病、神经受压、多发性神经病、梨状肌综合征、垂体肿瘤、多肌炎、蓬佩病、孔洞脑、后小儿麻痹综合征、带状疱疹后遗神经痛、感染后脑脊髓炎、体位性低血压、体位性直立性心动过速综合征、体位性心动过速
综合征、原发性牙本质萎缩、原发性侧索硬化、原发性进行性失语症、朊病毒病、进行性面部偏侧萎缩、进行性运动性共济失调、进行性多灶性白质脑病、进行性硬化性脊柱营养不良、进行性核上性麻痹、人面失认症、假火炬综合征(pseudo-torch syndrome)、假弓形体病综合征、假瘤脑、心因性运动、拉姆齐
·
亨特综合征i(ramsay hunt syndrome i)、拉姆齐
·
亨特综合征ii、拉斯穆森氏脑炎(rasmussen's encephalitis)、反射性交感神经营养不良综合征、雷弗素姆病、雷弗素姆病-婴儿、重复性运动病症、重复性应激损伤、不安定腿综合征、逆转录病毒相关脊髓病、雷特综合征、雷尔氏综合征(reye's syndrome)、风湿性脑炎、赖利-戴综合征(riley-day syndrome)、骶神经根囊肿、圣维特斯舞蹈病(saint vitus dance)、唾液腺疾病、桑德霍夫疾病(sandhoff disease)、谢耳德氏病(schilder's disease)、脑裂畸形、赛特贝格病(seitelberger disease)、癫痫发作病症、语义性痴呆、视中隔发育不全、婴儿严重的肌阵挛性癫痫(smei)、摇晃婴儿综合征、带状疱疹、香-德综合征(shy-drager syndrome)、修格兰氏综合征(sjogren's syndrome)、睡眠呼吸暂停、睡眠病、索托氏综合征(sotos syndrome)、痉挛、脊柱裂、脊髓梗死、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌萎缩症、脊髓小脑萎缩症、脊髓小脑变性、斯蒂尔-理查森-奥尔谢夫斯基综合征(steele-richardson-olszewski syndrome)、僵人综合征、纹状体黑质变性、中风、斯特格-韦伯综合征(sturge-weber syndrome)、亚急性硬化性全脑炎、皮层下动脉硬化性脑病、持续时间短、单侧、神经形(sunct)头痛、吞咽障碍、西登哈姆舞蹈病、晕厥、梅毒性脊髓硬化症、脊髓空洞积水症、脊髓空洞症、系统性红斑狼疮、脊髓痨、迟发性运动障碍、塔洛夫囊肿(tarlov cyst)、泰-萨二氏病、颞动脉炎、脊髓栓系综合征、汤姆森氏肌强直(thomsen's myotonia)、胸廓出口综合征、甲状腺毒性肌病、三叉神经痛、托德氏麻痹(todd's paralysis)、妥瑞综合征(tourette syndrome)、短暂性脑缺血发作、可传播性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、震颤、三叉神经痛、热带痉挛性轻截瘫、泰勒综合征(troyer syndrome)、结节性硬化症、血管勃起肿瘤、中枢神经系统和外周神经系统血管炎综合征、冯
·
埃科诺莫病(von economo's disease)、冯-希珀尔-林道病(von hippel-lindau disease，vhl)、冯
·
雷克林豪森氏病(von recklinghausen's disease)、沃伦贝格氏综合征(wallenberg's syndrome)、韦德尼格-霍夫曼病(werdnig-hoffman disease)、韦尼克-科萨科夫综合征(wemicke-korsakoff syndrome)、颈部扭伤、惠普耳氏病(whipple's disease)威廉姆斯氏综合征(williams syndrome)、威尔逊病(wilson disease)、沃尔曼氏病(wolman's disease)以及与x连锁脊髓延髓肌肉萎缩症。
[0237]
在一些情况下，该疾病或病状包括肝脏疾病或病状或者与肝脏疾病或病状相关。非限制性实例包含胆汁酸合成病症(例如，威尔逊病、进行性家族性肝内胆汁淤积症3型)、碳水化合物代谢病症(例如，遗传性果糖不耐症、糖原贮积病iv型)、氨基酸代谢病症(例如，i型酪氨酸血症)、尿素循环病症(例如，精氨琥珀酸裂解酶缺乏症、柠檬素缺乏症(ctln2、niccd))、脂质代谢病症(例如，胆固醇酯沉积病)和其它病症，包含但不限于α-1抗胰蛋白酶缺乏症、囊性纤维化、遗传性血色素沉着症、阿尔斯特雷姆综合征(alstrom syndrome)和先天性肝纤维化。
[0238]
在一些情况下，该疾病或病症是(肺的)肺部疾病或病症。在一些情况下，肺部疾病或病症选自由以下组成的组：慢性阻塞性肺疾病(copd)、肺纤维化(pf)和缩醛磷脂缺乏症。
[0239]
此处提供了治疗与靶基因或其基因表达产物的异常表达或活性相关的疾病或病
状的方法，该方法包括通过施用使本公开的异源核酸衣壳化的raav来调节靶基因或基因表达产物在受试者体内的表达或活性。在一些情况下，施用是全身性施用。在一些情况下，相对于正常(未患病)个体中的表达或活性，靶基因或基因表达产物的表达或活性降低；并且向受试者施用raav足以使靶基因或基因表达产物的活性表达增加到正常个体的活性表达。在一些情况下，相对于正常个体中的表达或活性，基因或基因表达产物的表达或活性增加；并且向受试者施用raav足以使靶基因或基因表达产物的表达或活性降低。在非限制性实例中，向被诊断出患有阿尔茨海默氏病(在某些情况下由早老素1和/或早老素2(分别由基因psen1和psen2编码)的功能获得引起)的受试者施用本文公开的raav，该raav使治疗性核酸衣壳化，该治疗性核酸是对psen1 mrna具有功能丧失作用的沉默rna(sirna)或其它rnai。
[0240]
调配物、剂量和施用途径
[0241]
一般而言，本文公开的方法包括通过全身施用来施用治疗性raav组合物。在一些情况下，方法包括通过口服施用来施用治疗性raav组合物。在一些情况下，方法包括通过腹膜内注射施用治疗性raav组合物。在一些情况下，方法包括以肛门栓剂的形式施用治疗性raav组合物。在一些情况下，方法包括通过静脉内(“i.v.”)施用来施用治疗性raav组合物。可想象的是，也可以通过其它途径来施用本文公开的治疗性raav组合物，这些其它途径如皮下注射、肌内注射、皮内注射、经皮注射、经皮施用、鼻内施用、淋巴内注射、直肠内施用、胃内施用、眼内施用、脑室内施用、鞘内施用或任何其它合适的肠胃外施用。在一些情况下，方法包括通过局部施用，例如通过将raav组合物刷涂到受试者的区域(例如，鼓膜、膀胱)或以其它方式使raav组合物与该区域接触来施用治疗性raav组合物。在一些实施例中，与全身性途径相比，更接近损伤或炎症部位的局部递送途径是优选的。可以调整施用治疗剂的途径、剂量、时间点和持续时间。在一些实施例中，在疾病或病状的急性和慢性症状中的任一者或两者的发作之前或之后施用治疗剂。
[0242]
用于预防或治疗本文所公开的疾病或病状的药物组合物的有效剂量和剂量由与该疾病或病状或该疾病或病状的症状相关的观察到的有益应答来限定。有益应答包括预防、减轻、阻止或治愈该疾病或病状或该疾病或病状的症状。在一些实施例中，可以通过检测受试者中生物标志物、转录组风险谱或肠道微生物组的存在、水平或活性的可测量改善来测量有益应答。如本文所使用的“改善”是指存在、水平或活性向在正常个体(例如，未患有该疾病或病状的个体)中观察到的存在、水平或活性的转变。在其中治疗性raav组合物在治疗上无效或未充分减轻疾病或病状或疾病或病状的症状的情况下，则可以改变施用的剂量和/或途径，或者可以将另外的药剂与治疗性raav组合物一起施用于受试者。在一些实施例中，当患者开始进行治疗性raav组合物的方案时，该患者也逐渐停止进行(例如，剂量逐步降低)第二治疗方案。
[0243]
在一些实施例中，根据本公开的药物组合物可以以在足以每天、一天一次或多次递送约0.0001mg/kg到约100mg/kg、约0.001mg/kg到约0.05mg/kg、约0.005mg/kg到约0.05mg/kg、约0.001mg/kg到约0.005mg/kg、约0.05mg/kg到约0.5mg/kg、约0.01mg/kg到约50mg/kg、约0.1mg/kg到约40mg/kg、约0.5mg/kg到约30mg/kg、约0.01mg/kg到约10mg/kg、约0.1mg/kg到约10mg/kg或约1mg/kg到约25mg/kg受试者体重的剂量水平下施用以获得期望的治疗、诊断或预防效果。应当理解，本领域技术人员可以将上述剂量浓度转化为每千克vg或病毒基因组或转化为总病毒基因组。
[0244]
在一些情况下，药物组合物的剂量可以包括的感染性颗粒的浓度为至少或约107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
、10
15
、10
16
或10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为2
×
107、2
×
108、2
×
109、2
×
10
10
、2
×
10
11
、2
×
10
12
、2
×
10
13
、2
×
10
14
、2
×
10
15
、2
×
10
16
或2
×
10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为3
×
107、3
×
108、3
×
109、3
×
10
10
、3
×
1011、3
×
10
12
、3
×
10
13
、3
×
10
14
、3
×
10
15
、3
×
10
16
或3
×
10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为4
×
107、4
×
108、4
×
109、4
×
10
10
、4
×
10
11
、4
×
10
12
、4
×
10
13
、4
×
10
14
、4
×
10
15
、4
×
10
16
或4
×
10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为5
×
107、5
×
108、5
×
109、5
×
10
10
、5
×
10
11
、5
×
10
12
、5
×
10
13
、5
×
10
14
、5
×
10
15
、5
×
10
16
或5
×
10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为6
×
107、6
×
108、6
×
109、6
×
10
10
、6
×
1011、6
×
10
12
、6
×
10
13
、6
×
10
14
、6
×
10
15
、6
×
10
16
或6
×
10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为7
×
107、7
×
108、7
×
109、7
×
10
10
、7
×
10
11
、7
×
10
12
、7
×
10
13
、7
×
10
14
、7
×
10
15
、7
×
10
16
或7
×
10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为8
×
107、8
×
108、8
×
109、8
×
10
10
、8
×
10
11
、8
×
10
12
、8
×
10
13
、8
×
10
14
、8
×
10
15
、8
×
10
16
或8
×
10
17
。在一些情况下，感染性颗粒的浓度为9
×
107、9
×
108、9
×
109、9
×
10
10
、9
×
10
11
、9
×
10
12
、9
×
10
13
、9
×
10
14
、9
×
10
15
、9
×
10
16
或9
×
10
17
。
[0245]
在一些实施例中，本文公开了适合于递送本文描述的raav组合物的药学上可接受的赋形剂和载体溶液的调配物，以及用于在多种治疗方案中使用本文描述的特定组合物的合适的剂量和治疗方案。在一些实施例中，每种在治疗上有用的组合物中的治疗性基因表达产物的量可以是以这样的方式来制备，该方式使得在化合物的任何给定的单位剂量中将获得适合的剂量。制备此类药物调配物的本领域的技术人员将考虑如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其它药理学因素等因素，并且如此，多种剂量和治疗方案可能是期望的。在一些情况下，raav组合物是本文公开的合适调配的药物组合物，这些药物组合物眼内、玻璃体内、肠胃外、皮下、静脉内、脑室内、肌肉内、鞘内、口服、腹膜内、经口或经鼻吸入或通过直接注射而递送到一个或多个细胞、组织或器官。
[0246]
在一些实施例中，适用于注射用途的基于aav的病毒组合物的药物形式包含无菌水溶液或分散体以及无菌粉剂，这些无菌粉剂在临用时再配制成无菌可注射溶液或分散体。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。恰当的流动性可以例如通过使用如卵磷脂等包衣、通过在分散体的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持。对微生物作用的防止可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等)来实现。在许多情况下，将优选的是包含等渗剂，例如，糖或氯化钠。对可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶来提供。
[0247]
在一些情况下，对于可注射水溶液的施用，例如，如果需要，该溶液可以被适合地缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。取决于被治疗的受试者的病状，必然发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人将确定用于个体受试者的适当剂量。此外，对于人类施用，调配物应满足fda生物制品标准办公室所要求的无菌性、产热原性以及一般的安全性和纯度标准。
[0248]
本文公开了包括本文公开的raav组合物的无菌可注射溶液，这些无菌可注射溶液
通过将本文公开的raav组合物以所需的量根据需要与以上枚举的若干其它成分一起并入适当的溶剂中、然后进行过滤灭菌来制备。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入无菌媒剂中来制备分散体，该无菌媒剂含有基础分散介质和来自上文枚举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。可注射溶液对于全身性施用，例如通过静脉内施用可能是有利的。
[0249]
本文还提供了中性或盐形式的调配物。药学上可接受的盐包含酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且其与例如盐酸或磷酸等无机酸或如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成。与游离羧基形成的盐还可以源自如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁等无机碱和如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等有机碱。在调配后，溶液将以与剂量调配物相容的方式并以治疗上有效的量施用。调配物容易地以多种剂型施用，如可注射溶液、药物释放胶囊等。
[0250]
通过经颊施用可以有利地实现肺部施用。在一些实施例中，调配物可以包括包含活性成分的干燥颗粒。在此类实施例中，干燥颗粒的直径可以在约0.5nm到约7nm或约1nm到约6nm的范围内。在一些实施例中，调配物可以呈干燥粉末的形式，以用于使用包括干燥粉末贮存器的装置施用，将推进剂流可以被引导到该装置以将此类粉末分散。在一些实施例中，可以使用自推进溶剂/粉末分配容器。在此类实施例中，活性成分可以溶解和/或悬浮在密封容器中的低沸点推进剂中。此类粉末可以包括颗粒，其中按重量计至少98％的颗粒具有大于0.5nm的直径并且按数量计至少95％的颗粒具有小于7nm的直径。可替代地，按重量计至少95％的颗粒具有大于1nm的直径并且按数量计至少90％的颗粒具有小于6nm的直径。干燥粉末组合物可以包含固体精细粉末稀释剂如糖并且合宜地以单位剂型提供。低沸点推进剂通常包含在大气压力下具有低于65
°
f的沸点的液体推进剂。通常，推进剂可以构成50％到99.9％(w/w)的该组合物，并且活性成分可以构成0.1％到20％(w/w)的该组合物。推进剂可以进一步包括另外的成分，如液体非离子型和/或固体阴离子型表面活性剂和/或固体稀释剂(该固体稀释剂可以具有与包括活性成分的颗粒相同的数量级的颗粒尺寸)。
[0251]
调配用于肺递送的药物组合物可以提供呈溶液和/或悬浮液的液滴形式的活性成分。此类调配物可以以任选地无菌的、包含活性成分的水性和/或稀释醇溶液和/或悬浮液形式进行制备、包装和/或出售，并且可以合宜地使用任何喷雾化和/或雾化装置来施用。此类调配物可以进一步包括一种或多种另外的成分，该一种或多种另外的成分包含但不限于调味剂如糖精钠、挥发性油、缓冲剂、表面活性剂和/或防腐剂如羟基苯甲酸甲酯。通过这种施用途径提供的液滴的平均直径可以在约0.1nm到约200nm的范围内。本文描述的可用于肺递送的调配物也可以用于鼻内递送。在一些实施例中，用于鼻内施用的调配物包括粗糙粉末，该粗糙粉末包括活性成分并且具有约0.2μm到500μm的平均粒度。此类调配物以吸用鼻烟的方式施用，例如通过从保持在鼻部附近的粉末容器迅速吸入鼻腔中。
[0252]
适用于经鼻施用的调配物可以例如包括约少至0.1％(w/w)并且多至100％(w/w)的活性成分，并且可以包括本文描述的一种或多种另外的成分。药物组合物可以以适合于经颊施用的调配物制备、封装和/或销售。此类调配物可以例如是呈使用常规方法制备的片剂和/或锭剂的形式，并且可以包括例如0.1％到20％(w/w)活性成分，其余量包括口服可溶解和/或可降解的组合物以及可任选的本文描述的一种或多种另外的成分。可替代地，适用
于经颊施用的调配物可以包括粉剂和/或气雾化的和/或雾化的溶液和/或悬浮液，这些粉剂和/或这些气雾化的和/或雾化的溶液和/或悬浮液包括活性成分。此类粉状气雾化的和/或气雾化的调配物当分散时可以包括约0.1nm到约200nm范围内的平均颗粒和/或液滴尺寸，并且可以进一步包括本文描述的一种或多种另外的成分。
[0253]
施用到受试者的合适剂量和剂量由包含但不限于以下的因素来确定：特定治疗性raav组合物、疾病状况及其严重性、需要治疗的受试者的身份(例如，体重、性别、年龄)，并且可以根据病例周围的具体情况(包含例如所施用的特定药剂、施用途径、所治疗的病状以及所治疗的受试者或宿主)来确定。
[0254]
aav组合物的量和此类组合物的施用时间将在受益于本教导的技术人员的能力范围内。然而，很可能可以通过单次施用来实现治疗有效量的所公开的组合物的施用，例如，单次注射足够数量的感染性颗粒以向接受这种治疗的患者提供治疗益处。至少部分地由于某些靶细胞(例如，神经元)不分裂这一事实使得这成为可能，从而消除了对多次或长期给药的需要。
[0255]
可替代地，在一些情况下，可能期望的是，在相对较短或相对较长的时间段(这可以由监督此类组合物的施用的医生确定)内提供aav载体组合物的多次或连续施用。例如，施用到哺乳动物的感染性颗粒的数量可以在约107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
或甚至更高的感染性颗粒/ml的数量级，如实现对所治疗的特定疾病或病症的治疗可能需要以单次剂量给予或分为两次或更多次施用。实际上，在某些实施例中，可能期望的是，单独或与一种或多种其它治疗药物组合施用两种或更多种不同的aav载体组合物以获得特定治疗方案的期望效果。在各个实施例中，日剂量和单位剂量根据许多变量而变化，这些变量包含不限于所使用的治疗性raav组合物的活性、待治疗的疾病或病状、施用方式、个体受试者的需求、所治疗的疾病或病状的严重性以及从业者的判断。
[0256]
在一些实施例中，治疗性raav组合物的施用是每小时一次、每2小时一次、每3小时一次、每4小时一次、每5小时一次、每6小时一次、每7小时一次、每8小时一次、每9小时一次、每10小时一次、每11小时一次、
[0257]
每12小时一次、每13小时一次、每14小时一次、每15小时一次、每16小时一次、每17小时一次、每18小时一次、每19小时一次、每20小时一次、每21小时一次、每22小时一次、每23小时一次、每1天一次、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每7天一次、每8天一次、每9天一次、每10天一次、每11天一次、每12天一次、每13天一次、每14天一次、每15天一次、每1个月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次、每10个月一次、每11个月一次、每1年一次、每2年一次、每3年一次、每4年一次、每5年一次或每10年一次。可以根据受试者对治疗的应答来调整有效剂量范围。与其它途径相比，某些施用途径将需要更高浓度的有效量的治疗剂。
[0258]
尽管鉴于本公开的优点并未预料到，但是在其中根据医生的判定，患者状况没有改善的某些实施例中，可以长期施用治疗性raav组合物的施用，即，在很长一段时间内，包含在患者的整个生命的持续时间内，以减轻或以其它方式控制或限制患者的疾病或病状的症状。在患者状况确实得到改善的某些实施例中，可以暂时减少或暂时中止所施用的治疗性raav组合物的剂量一定时间长度(即，“药物假期”)。在特定实施例中，药物假期的长度介
于2天与1年之间，仅通过实例的方式包含2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天或超过28天。仅通过实例的方式，药物假期期间的剂量减少可以为10％-100％，仅通过实例的方式包含10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％。在一些实施例中，可以暂时减少或暂时中止所施用的药物剂量一定时间长度(即，“药物转移”)。在特定实施例中，药物转移的长度介于2天与1年之间，仅通过实例的方式包含2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天或超过28天。仅通过实例的方式，药物转移期间的剂量减少可以为10％-100％，仅通过实例的方式包含10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％。在一段适当的时间后，任选地恢复正常的给药时间表。
[0259]
在一些实施例中，一旦患者的状况发生了改善，就在必要时施用维持剂量。随后，在具体实施例中，根据症状将施用的剂量或频率或两者降低至保留改善的疾病、病症或病状的水平。然而，在某些实施例中，在症状出现任何复发时，患者需要长期的间歇性治疗。
[0260]
通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定此类治疗方案的毒性和治疗效果，包含但不限于确定ld50和ed50。毒性与治疗效果之间的剂量比为治疗指数并且该治疗指数表示为ld50和ed50之比。在某些实施例中，将从细胞培养测定和动物研究中获得的数据用于调配用于哺乳动物(包含人)的治疗有效日剂量范围和/或治疗有效单位剂量。在一些实施例中，本文描述的治疗性raav组合物的剂量在循环浓度的范围内，该循环浓度包含具有最小毒性的ed50。在某些实施例中，日剂量范围和/或单位剂量在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和所利用的施用途径。
[0261]
试剂盒
[0262]
本文公开了包括本文公开的组合物的试剂盒。本文还公开了用于治疗或预防中枢神经系统(cns)、外周神经系统(pns)或靶器官或环境(例如，肺、心脏、肝脏)的疾病或病状的试剂盒。在一些情况下，该疾病或病状是癌症、病原体感染、肺部疾病或病状、神经系统疾病、肌肉疾病或免疫病症，如本文描述的那些。在一个实施例中，试剂盒可以包含治疗性或预防性组合物，该治疗性或预防性组合物含有有效量的raav颗粒和本公开的重组aav(raav)衣壳蛋白的组合物，该raav颗粒使包括治疗性核酸(例如，治疗性核酸)的异源核酸衣壳化。在另一个实施例中，试剂盒可以包含治疗性或预防性组合物，该治疗性或预防性组合物含有有效量的表达治疗性核酸的呈单位剂型的由本文描述的raav修饰的细胞(“经修饰的细胞”)。在一些实施例中，试剂盒包括无菌容器，该无菌容器可以含有治疗性组合物；此类容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。此类容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适合于容纳药物的其它材料制成。
[0263]
在一些情况下，将raav与用于向患有疾病或病状(例如，cns、pns、肝脏等的疾病)或有罹患该疾病或病状的风险的受试者施用raav的说明书一起提供。说明书通常可以包含有关组合物用于治疗或预防疾病或病状的使用的信息。
[0264]
在一些情况下，试剂盒可以包含同种异体细胞。在一些情况下，试剂盒可以包含可以包括基因组修饰的细胞。在一些情况下，试剂盒可以包括“现成的(off-the-shelf)”细胞。在一些情况下，试剂盒可以包含可以扩展用于临床使用的细胞。在一些情况下，试剂盒可以含有用于研究目的的内容物。
[0265]
在一些情况下，这些说明书包含以下中的至少一个：治疗性raav组合物的描述；用于治疗或预防本文公开的疾病或病状的剂量方案和施用；注意事项；警告；适应症；禁忌症；过剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考。这些说明书可以直接打印在容器上(如果存在的话)，或者作为施加到容器上的标签或者作为与容器一起提供或提供在容器中的单独的纸页、小册子、卡片或文件夹打印。在一些情况下，说明书提供了用于向受试者单独施用raav的程序。在一些情况下，说明书提供了用于在施用本文公开的另外的治疗剂之后或之前至少约1小时(hr)、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时或至多2天、3天、4天、5天、6天或7天向受试者施用raav的程序。在一些情况下，这些说明书提供了raav被调配用于静脉内注射。在一些情况下，这些说明书提供了raav被调配用于鼻内施用。
[0266]
定义
[0267]
本文所使用的术语仅出于描述特定情况的目的，而不旨在进行限制。如本文所使用的，除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一个/一种(a、an)”和“该(the)”旨在也包含复数形式。此外，在详细描述和/或权利要求书中使用了术语“包含(including/include)”、“具有(having/has/with)”或其变体的情况下，此类术语旨在以类似于术语“包括(comprising)”的方式是包含性的。
[0268]
术语“约”或“大约”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定值，例如，测量系统的局限性。例如，
[0269]
根据给定值的实践，“约”可以意指在1个或大于1个标准偏差内。在本技术和权利要求中描述特定值的情况下，除非另外说明，否则术语“约”应被假定为意指该特定值在可接受的误差范围之内。
[0270]
当用来定义组合物和方法时，如本文使用的“基本上由...组成”应该表示排除对于所陈述的目的的组合具有任何重要意义的其它要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物将不排除对所要求保护的公开的一个或多个基本和新颖特性不具有实质影响的其它材料或步骤，如用于治疗如痤疮、湿疹、牛皮癣和酒渣鼻等皮肤病症的组合物。
[0271]
本文使用的术语“同源的”、“同源性”或“同源性百分比”通常是指与参考序列具有相同或相似序列的氨基酸序列或核酸序列。截至本技术提交之日，可以使用最新版本的blast确定序列的同源性百分比。
[0272]
术语“增加(increased或increase)”在本文中用于通常意指增加统计上显著的量。在一些实施例中，术语“增加”意指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平、标准或对照相比增加至少约10％、至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多到并且包含100％增加，或在10％-100％之间的任何增加。“增加”的其它实例包含与参考水平相比增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍。
[0273]
术语“减少(decreased或decrease)”在本文中通常用来表示减少统计学上显著的量。在一些实施例中，“减少”意指与参考水平相比减少了至少10％，例如，与参考水平相比减少了至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或多达且包含100％的减少(例如，与参考样品相比不存
在的水平或无法检测到的水平)或介于10-100％之间的任何减少。在标记物或症状的上下文中，这些术语是指此水平的统计上显著的减少。减少可以是例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并且优选地降至作为不患有给定疾病的个体的正常范围内所接受的水平。
[0274]
术语“受试者”是任何生物。在一些情况下，该生物是哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包含哺乳动物类别的任何成员：人、非人灵长类动物(如黑猩猩)以及其它猿类和猴类；农场动物，如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，如兔子、狗和猫；实验动物，包含啮齿动物，如大鼠、小鼠和豚鼠等。在一个方面，哺乳动物是人。如本文中所使用的，术语“动物”包括人类和非人动物。在一个实施例中，“非人类动物”是哺乳动物，例如啮齿动物，如大鼠或小鼠。在一些情况下，受试者是患者，如本文所使用的，其可以指被诊断出患有特定疾病或病症的受试者。
[0275]
如本文所使用的，术语“基因”是指任选地与相关调节区(如启动子、操纵子、终止子等)一起编码单个蛋白质或rna的核酸片段(也称为“编码序列”或“编码区”)，该相关调节区可以位于编码序列的上游或下游。
[0276]
如本文所使用的，术语“腺相关病毒”或“aav”是指腺相关病毒或其衍生物。aav的非限制性实例包含aav类型1(aav1)、aav类型2(aav2)、aav类型3(aav3)、aav类型4(aav4)、aav类型5(aav5)、aav类型6(aav6)、aav类型7(aav7)、aav类型8(aav8)、aav类型9(aav9)、aav类型10(aav 10)、aav类型11(aav11)、aav类型12(aav12)、禽aav、牛aav、犬aav、马aav、灵长类动物aav、非灵长类动物aav和绵羊aav。在一些情况下，aav被描述为“灵长类动物aav”，其是指感染灵长类动物的aav。同样，aav可以感染牛属动物(例如“牛aav”等)。在一些情况下，aav是野生型或天然存在的。在一些情况下，aav是重组的。
[0277]
如本文所使用的术语“aav衣壳”是指腺相关病毒的衣壳蛋白或肽。在一些情况下，aav衣壳蛋白被配置成使遗传信息(例如，转基因、治疗性核酸、病毒基因组)衣壳化。在一些情况下，本公开的aav衣壳是变体aav衣壳，这意味着在某些情况下它是已经在亲本aav衣壳蛋白的氨基酸序列中被修饰的亲本aav衣壳。
[0278]
如本文所使用的术语“向性”是指aav衣壳的一种质量或特性，该质量或特性可以包含相对于第二体内环境对将经衣壳化的遗传信息表达到体内环境中的一者中的特异性，和/或相对于第二体内环境对将经衣壳化的遗传信息表达到体内环境中的一者中的效率增加或降低。在一些情况下，体内环境是细胞类型。在一些情况下，体内环境是组织、器官或器官系统。
[0279]
如本文所使用的术语“aav基因组”是指编码与病毒有关的遗传信息的核酸多核苷酸。在一些情况下，基因组包括侧接有aav反向末端重复(itr)序列的核酸序列。aav基因组可以是使用重组遗传学方法产生的重组aav基因组，并且该重组aav基因组可以包含侧接有itr序列的异源核酸(例如，转基因)。
[0280]
如本文可互换使用的术语“aav颗粒”或“aav载体”是指包括aav衣壳的aav病毒或病毒体，在该aav衣壳内包装有异源dna多核苷酸或“基因组”，该异源dna多核苷酸或“基因组”包括侧接有aav反向末端重复(itr)序列的核酸序列。在一些情况下，相对于亲本aav颗粒，aav颗粒被修饰。
[0281]
术语“基因表达产物”的“基因产物”是指多核苷酸序列的表达产物，例如多肽、肽、
蛋白质或rna，包含但不限于干扰rna(例如sirna、mirna、shrna)和信使rna(mrna)。
[0282]
术语“操作性地连接”或“可操作地连接”是指两个或更多个元件彼此顺式定位，并且在一些情况下彼此相邻(例如，遗传元件，如启动子、增强子、终止信号序列、聚腺苷酸化序列等)定位，以实现两个或更多个元件之间的功能关系。在一个非限制性实例中，操作性地连接到编码区的启动子能够启动编码序列的转录。
[0283]
如本文所使用的术语“异源的”是指从在基因型上不同于与其比较的实体的其余部分的实体衍生的遗传元件(例如，编码区)或基因表达产物(例如，rna、蛋白质)。
[0284]
如本文所使用的术语“内源的”是指天然存在于生物体或生物体内的特定细胞中或与之相关的遗传元件(例如，编码区)或基因表达产物(例如，rna、蛋白质)。
[0285]
如本文所使用的“可检测部分”是指可以共价或非共价连接到化合物或生物分子的部分，该化合物或生物分子可以例如使用本领域已知的技术进行检测。在实施例中，可检测部分是共价连接的。可检测部分可以提供对连接的化合物或生物分子的成像。可检测部分可以指示两种化合物之间的接触。示例性可检测部分是荧光团、抗体、反应性染料、放射性标记的部分、磁性造影剂和量子点。示例性荧光团包含荧光素、若丹明、gfp、香豆素、fitc、alexa荧光体(alexa fluor)、cy3、cy5、bodipy和花青染料。示例性放射性核素包含氟-18、镓-68和铜-64。示例性磁性造影剂包含钆、氧化铁和铁铂矿以及锰。
[0286]
如本文所使用的术语“治疗(treat、treating和treatment)”是指减轻或消除病症、疾病或病状；或与病症、疾病或病状相关的症状中的一种或多种症状；或减轻或消除病症、疾病或病状本身的原因。令人期望的治疗效果可以包含但不限于预防疾病发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理性后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态以及缓解或改进预后。
[0287]
术语“治疗有效量”是指化合物或疗法在施用时足以预防病症、疾病的症状中的一种或多种症状或疾病的病状的发展或在一定程度上对其进行减轻的量；或者
[0288]
化合物的足以引起研究人员、兽医、医生或临床医生寻求的细胞、组织、系统、动物或人的生物学或医学应答的量。
[0289]
术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理学上可接受的载体”或“生理学上可接受的赋形剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。组分在与药物调配物的其它成分相容的意义上可以是药学上可接受的。它还可以适用于以合理的受益/风险比率与人类和动物的组织或器官相接触，而不产生过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其它问题或并发症。参见《雷明顿：药学科学与实践(remington:the science and practice of pharmacy)》,第21版；利平科特威廉姆斯和威尔金斯出版社(lippincott williams&wilkins):费城(philadelphia),宾夕法尼亚州(pa),2005；《药物赋形剂手册(handbook of pharmaceutical excipients)》,第5版；rowe等人编辑,药物出版社和美国药物协会(the pharmaceutical press and the american pharmaceutical association):2005；以及《药物添加剂手册(handbook of pharmaceutical additives)》,第3版；ash和ash编辑,高尔出版公司(gower publishing company):2007；《药物预调配物和调配物(pharmaceutical preformulation and formulation)》,gibson编辑,crc出版社有限公司(crc press llc):波卡拉顿(boca raton),佛罗里达州(fl),2004)。
[0290]
术语“药物组合物”是指本文公开的化合物与其它化学组分(如稀释剂或载体)的混合物。药物组合物可以促进将化合物施用于生物体。本领域存在多种施用化合物的技术，包含但不限于口服、注射、气雾剂、肠胃外和局部施用。
[0291]“样品”的非限制性实例包含可以从其获得核酸和/或蛋白质的任何材料。作为非限制性实例，这包含全血、外周血、血浆、血清、唾液、粘液、尿液、精液、淋巴液、粪便提取物、颊拭子、细胞或其它体液或组织，包含但不限于通过手术活检或手术切除获得的组织。在一些实施例中，样品直接获自患者。可替代地，样品可以通过原代患者来源的细胞系获得，或者可以是呈保存样品或新鲜冷冻样品的形式的归档患者样品。
[0292]
实例
[0293]
实例1.产生raav的方法
[0294]
产生了重组aav(raav)。使用标准转染方案(例如，利用pei)将三个质粒载体三重转染到永生的hek293细胞中。第一载体含有侧接有来自亲本aav病毒的反向末端重复(itr)序列的转基因盒。该转基因盒具有启动子序列，并且驱动靶细胞的细胞核中异源核酸的转录。第二载体含有编码aav rep基因以及经修饰的cap基因的核酸(例如，aav2/9rep-aap-δcap)。经修饰的cap基因包括seq id no:12740-25468、35472-45474和46364-46383中的任一个，其是编码本公开的经修饰的aav衣壳蛋白的dna序列。在一些情况下，经修饰的cap基因包括seq id no:46404-46423中的任一个，其是编码在氨基酸位置452-458处具有7聚体取代的全长vp1蛋白的dna序列。第三载体含有编码病毒组装和将异源核酸包装到经修饰的衣壳结构中所需的辅助病毒蛋白的核酸。
[0295]
在转染后72小时从培养基中收获病毒颗粒，并且在转染后120小时从细胞和培养基中收获病毒颗粒。培养基中存在的病毒通过用8％聚乙二醇和500mm氯化钠沉淀进行浓缩，并且将沉淀的病毒添加到由收集的细胞制备的裂解物中。通过碘克沙醇(optiprep，西格马(sigma))逐步梯度(15％、25％、40％和60％)纯化病毒。将病毒浓缩并在pbs中调配。通过使用qpcr和作为对照的线性化的基因组质粒测量dnasel抗性载体基因组拷贝(vg)的数量来确定病毒滴度。
[0296]
实例2.鉴定经修饰的衣壳蛋白的方法
[0297]
质粒。
[0298]
通过使用nnk简并引物(整合dna技术公司(integrated dna technologies,inc.，idt))扩增aav9-php.eb衣壳基因组在氨基酸450-599之间的片段来产生第一轮次病毒dna文库，以用所有可能的变化取代氨基酸452-458。然后如先前描述的通过吉布森组装(gibson assembly)将所得文库插入物引入到raav-δcap-in-cis-lox质粒中。所得衣壳dna文库raav-cap-in-cis-lox在氨基酸水平上含有～12.8亿个变体的多样性。与第一轮次相似地产生了第二轮次病毒dna文库，但是代替在452-458位置处的nnk简并引物，使用合成的寡聚库(twist生物科学(twist bioscience))以仅产生所选变体。此第二轮次dna文库在氨基酸水平上含有～82,000种变体的多样性。
[0299]
从先前使用的aav2/9rep-aap质粒中通过缺失450-592之间的氨基酸来修饰转染到用于文库病毒产生的hek293t细胞中的aav2/9rep-aap-δcap质粒。此修饰防止了在用含有文库插入物的raav-δcap-in-cis-lox共转染的此质粒之间的合理重组事件之后，在病毒文库产生期间产生aav9衣壳。
[0300]
在这项研究中使用了两个raav基因组。第一基因组paav-cag-mneongreen在普遍存在的cmv-β-肌动蛋白-内含子-β-球蛋白杂交启动子(cag)的控制下利用含有荧光蛋白mneongreen的单链(ss)raav基因组。第二基因组paav-cag-nls-gfp(addgene#104061)在cag启动子的控制下利用ssaav基因组，该ssaav基因组含有侧接有两个核定位位点pkkkrkv(seq id no:45486)的荧光蛋白egfp。
[0301]
病毒产生
[0302]
重组aav在以下中进行了描述：challis,r.c.等人“用于在啮齿动物中广泛和靶向基因递送的全身性aav载体(systemic aav vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents)”.《自然实验手册(nat.protoc.)》14,379(2019)。简而言之，使用聚乙烯亚胺(pei)执行hek293t细胞(atcc)的三重转染，在120小时后从细胞裂解液和培养基中收集病毒并通过碘克沙醇(optiprep，西格玛)纯化。
[0303]
改良的方案用于病毒文库的转染和纯化。首先，为了防止镶嵌衣壳形成，仅转染了10ng的raav-cap-in-cis-lox文库dna(每150mm板)，以降低多个文库dna进入同一细胞的可能性。其次，在60小时而不是120小时后收集病毒，以限制生产细胞的二次转导。最后，代替如在标准方案中执行的病毒颗粒从培养基中的peg沉淀，将培养基浓缩》60倍以装载到碘克沙醇上。执行此步骤是为了防止在peg沉淀期间所注意到的聚集和病毒多样性损失。
[0304]
动物
[0305]
所有的啮齿动物程序均得到了加州理工学院的机构动物使用和护理委员会(iacuc)(institutional animal use and care committee(iacuc)of the california institute of technology)的批准。从杰克逊实验室(jackson laboratory)(jax)购买了在各种细胞类型特异性启动子的控制下表达cre的转基因动物，以及c57b1/6j wt小鼠(000664)。转基因小鼠包含synl-cre(3966)、gfap-cre(012886)和tek-cre(8863)。对于病毒文库的第1轮次和第2轮次选择，使用了每个转基因系的8-12周龄的一个雄性和一个雌性小鼠，以及单个雄性c57b1/6j。为了验证各个病毒变体，使用了6-8周龄的雄性c57b1/6j小鼠。通过注射到眶后窦中来执行raav载体的静脉内施用。
[0306]
病毒文库回收和测序
[0307]
将第1轮次和第2轮次病毒文库以8
×
10
10
vg/动物的剂量注射到c57b1/6j和cre转基因动物中，并且在注射后两周回收raav基因组。对小鼠实施安乐死，并且回收大多数主要器官，将其在干冰上速冻并置于-80℃下长期储存。组织包含：大脑、脊髓、drg、肝脏、肺、心脏、胃、肠、肾脏、脾脏、胰腺、骨骼肌和动物脂肪组织。使用beadbug(基准科学公司(benchmark scientific)，d1036)在trizol(生命技术公司(life technologies)，15596)中将100mg的每种组织(脑半球～250mg，drg《100mg)匀浆，并且根据制造商推荐的方案分离病毒dna。回收的病毒dna用rnase处理，用smal(在itr内发现)进行限制性酶切消化，以提高稍后通过pcr进行的raav基因组回收，并用zymo dna清洁和浓缩剂(zymo dna clean and concentrator)试剂盒(d4033)纯化。使用以下引物：5'-cttccagttcagctacgagtttgagaac-3'(seq id no:45487)和5'-caagtaaaacctctacaaatgtggtaaaatcg-3'(seq id no:45488)，在98℃持续10秒、60℃持续15秒和72℃持续40秒的25次循环后，在与50％的总提取的病毒dna的五个25μl反应中使用q5 dna聚合酶作为模板来选择性地回收在所选转基因系中由cre重组酶翻转(或在wt动物中预翻转)的病毒基因组。
[0308]
zymo dna纯化后，将来自wt c57b1/6j动物的样品在1:10-1:10,000之间连续稀释，并且每种稀释液在文库可变区附近进一步扩增。使用以下引物：5'-acgctcttccgatctaatacttgtactatctctctagaactatt-3'(seq id no:45489)和5'-tgtgctcttccgatctcacactgaattttagcgtttg-3'(seq id no:45490)，以及98℃持续10秒、61℃持续15秒和72℃持续20秒的10次循环进行此扩增，以在21bp可变区周围(包含该可变区)回收73bp的病毒基因组，并为illumina下一代测序添加衔接子。pcr纯化后，在98℃持续10秒、60℃持续15秒和72℃持续20秒的10次循环后，使用用于illumina测序的nebnext双索引引物(新英格兰生物实验室(new england biolabs)，e7600)进一步扩增这些产物。扩增产物在2％低熔点琼脂糖凝胶(赛默飞世尔科技(thermofisher scientific)，162050)上运行，以更好地分离和回收210bp条带。针对每个wt组织分析稀释系列，并且选择不产生产物的最高浓度的稀释液，用于从转基因动物组织中进一步扩增病毒dna。执行此过程以区分在包装之前或由于动物中的cre而翻转的病毒基因组。应避免预翻转的病毒基因组，以最小化ngs测序结果中的假阳性。
[0309]
使用产生不含有预翻转的病毒基因组的产物的稀释液，将来自转基因动物组织的所有cre翻转的病毒基因组进行类似扩增，以添加illumina测序衔接子，并且随后用于索引标记。现在含有对来自每种动物的每种组织而言独特的索引的经扩增产物在低熔点琼脂糖凝胶上运行，并用zymoclean凝胶dna回收试剂盒提取并纯化正确的条带。
[0310]
通过消化病毒衣壳和纯化所含的ssdna，从注射的病毒文库中分离出包装的病毒文库dna。这些病毒基因组通过两个pcr扩增步骤进行扩增(如从组织中提取病毒dna)，以添加illumina衔接子，并且然后添加索引，并在凝胶电泳后进行提取和纯化。使用illumina hiseq 2500系统(米勒德和穆里尔
·
雅各布斯遗传学和基因组学实验室(millard and muriel jacobs genetics and genomics laboratory)，加州理工学院(caltech))，将此病毒文库dna以及从组织中提取的病毒dna一起进行深度测序。
[0311]
ngs数据比对和处理
[0312]
来自ngs运行的原始fastq文件通过定制构建体进行处理，该定制构建体将数据与含有aa 452-458之间的21bp多样化区域的aav9模板dna片段进行比对。处理这些数据集的流程涉及过滤以去除低质量的读数，利用每个序列的质量评分并消除pcr诱导的突变或高gc含量造成的偏倚。然后，通过完美的字符串匹配算法对经过滤的数据集进行比对，并进行调整以提高比对质量。然后提取每个序列的读数计数，并与它们的富集评分一起显示，该富集评分定义为与注射的病毒文库中该序列的相对丰度相比，在特定组织内发现的序列的相对丰度。
[0313]
富集定量。参考该组织内整个文库计算靶组织中特定变体的富集，并将其定义为靶组织内的变体的流行率，该流行率相对于注射的病毒文库中变体的流行率进行了归一化。
[0314][0315]
如果在组织中比在注射的病毒文库中更普遍发现aav变体，则获得正向富集评分，并且如果发现aav变体的流行率较低，则获得负向富集评分。富集评分为0意味着在组织和注射的病毒文库中发现的变体的流行率完全相同，或者在靶组织中没有特定变体的读数计
数，即在组织中无法检测到变体。由于前者不太可能，因此将富集评分为0解释为意味着该变体不存在于组织中。因此，如果aav变体在组织中的富集评分小于或等于0，则确定该aav变体使该组织去靶。从相对于其亲本aav载体aav9的富集评分为0的许多aav变体进行肝脏转导的体内表征证实了这种解释是准确的(参见例如图17d、e)。
[0316]
组织制备和免疫组织化学
[0317]
用euthasol对小鼠实施安乐死，并经心脏灌注有冰冷的1
×
pbs，并且然后灌注有含新鲜制备的冰冷的4％多聚甲醛(pfa)的1
×
pbs。切下所有器官，并在4％pfa中于4
°
下后固定48小时，并且然后通过振动切片机切片。用在含有10％驴血清和0.1％triton x-100的pbs中的一级抗和二级抗体对漂浮切片执行ihc。使用的一级抗体是兔抗neun(1:200，艾博抗(abcam)，177487)、兔抗s100(1:200，艾博抗，868)、兔抗olig2(1:200，艾博抗，109186)和兔抗钙结合蛋白(1:200，艾博抗，25085)。在室温(rt)下执行一级抗体温育16-20小时。然后洗涤切片，并与二级alexa-647缀合的抗兔fab片段抗体(1:200，杰克逊免疫研究实验室公司(jackson immunoresearch laboratories,inc.)，711-607-003)在rt下温育6-8小时。对于核染色，将漂浮切片在含有0.2％triton x-100和dapi(1:1000，西格玛奥德里奇(sigma aldrich)，10236276001)的pbs中温育6-8小时，并且然后洗涤。然后将染色的切片用profong diamond防褪色封固剂(赛默飞世尔科技，p36970)固定。
[0318]
成像和定量
[0319]
使用fluar 5
×
0.25m27物镜在蔡司(zeiss)fsm 880共聚焦显微镜上对所有cag-mneongreen表达性组织进行成像，其中在相同组织的所有样品中使用相匹配的激光功率、增益和伽马。所获取的图像在zen black 2.3sp1(蔡司)中进行处理。
[0320]
所有cag-nfs-gfp表达性组织均在具有以下物镜的keyence bz-x多合一荧光显微镜上以48位分辨率成像：planapo-λ20
×
/0/75(1mm工作距离)或planapo-λ10
×
/0.45(4mm工作距离)。为了将gfp表达与抗体染色共定位，在一些情况下，调整了绿色(gfp)通道的曝光时间，以促进高表达和低表达细胞的成像，同时避免过饱和。在所有在样品之间比较荧光强度的情况下，图像之间的曝光设置以及伽玛或对比度的变化均得以维持。为了最小化偏差，对于每个样品，都需要获取每个大脑区域和外周器官的多个视野。对于大脑区域，视野在样本之间匹配，并基于抗体染色而不是gfp信号进行选择。对于外周组织，基于dapi或抗体染色选择视野，以防止观察者偏见。
[0321]
所有图像处理均用keyence bz-x分析仪执行。用microsoft excel 2018和graphpad prism 7执行数据分析。使用具有混合细胞计数自动插件的keyence bz-x分析仪执行gfp信号和抗体或dapi染色之间的共定位。通过与手动计数比较，对自动计数进行验证和常规监控，并且发现其低于手动计数的误差界限。
[0322]
为了比较样品之间整个大脑的总细胞计数和荧光强度，使用匹配的曝光条件和keyence bz-x自动xy缝合模块，对位于距中线1200μm处的整个矢状切片成像。然后，在keyence bz-x分析仪套件中对缝合图像进行解构，并通过混合细胞计数自动插件运行以对整个矢状切片中的细胞总数进行计数。通过创建整个矢状切片中所有gfp阳性细胞的掩模并测量该掩模的积分像素强度来计算平均荧光强度。将总积分像素强度除以总细胞计数以获得每个细胞量度的荧光强度。在直接比较荧光强度的所有情况下，样品之间的曝光设置和后处理对比度调整均匹配。
[0323]
统计数据
[0324]
microsoft excel 2018和graphpad prism 7用于统计分析和数据表示。除非另有说明，否则所有实验组均为n＝6，并使用初步数据和实验功效分析确定。对于统计分析及其图表，将单个数据点定义为每只动物两个组织切片，这些组织切片在可能的情况下每个切片具有多个技术复制品。技术复制品定义为每个切片的多个视野，其中所关注的每个区域或组织具有以下编号：小脑＝3，皮质＝4，海马体＝3，中脑＝1，纹状体＝3，丘脑＝4，肝脏＝4，脾脏＝2，睾丸＝2，肾脏＝2，肺＝2，脊柱＝1，drg＝1，全矢状缝＝1。
[0325]
实例2.病毒文库的cre相关正向和负向选择的概述
[0326]
出于以在全身施用后对特定器官和远离其它器官的高效率工程化aav的明确目的，使用了create筛选方法(m-create)的更新版本，该更新版本允许体内选择病毒变体的大型文库。图1示出了所使用的m-create的示意图。利用create，使用简并引物通过pcr产生在特定位置处具有突变的aav衣壳文库，在hek293细胞中产生了包装其自身基因组的无复制能力版本的病毒，该基因组具有侧接有cre/lox位点的聚腺苷酸化位点，并且将病毒文库注射到在特定细胞群体中表达cre的转基因动物中。如果该文库的变体成功转导表达cre的细胞，则将其基因组翻转，并且可以以cre相关方式回收那些变体的序列。
[0327]
在表达cre的多个转基因小鼠系中的不同细胞群体中执行变体选择：针对整个体内的内皮细胞的tek-cre，针对cns和pns的神经元的hsynl-cre，针对星形胶质细胞的gfap-cre。通过在多个转基因系中平行进行选择，可以应用正向选择和负向选择，从而从所关注的特定组织中回收靶序列，而从其它组织则无法回收。接下来，对从所关注的组织中回收的病毒dna进行测序和索引。然后基于所关注的靶环境或细胞类型的流行率对序列进行排名。合成了仅含有来自第1轮次的表现最佳的序列的第二轮次文库。
[0328]
aav9的aa455环从衣壳表面突出得最远并且先前与中和抗体结合有关。aav中最常被操纵的环是aa588环，因为它是aav2与硫酸乙酰肝素结合的位点并且易于进行肽展示。aav9的唯一已知受体是n连接的末端半乳糖，但许多迹象表明还存在其它受体。
[0329]
在不希望受到任何特定理论的束缚的情况下，aa455环也可以独自或通过与aa588环相互作用而在细胞表面受体结合中起作用。为了确定aa455环处的变体氨基酸序列是否有助于期望的aav向性，将raav工程化，并使用aav-php.eb(一种aav9变体，该变体先前在aa588环处被工程化以增加穿过bbb的效率)中的aa452-458(图1a-1b)之间的455环的7氨基酸取代文库的m-create方法执行轮次选择。
[0330]
实例3.具有偏向啮齿类动物的肺并抵抗啮齿类动物的肝脏的向性的aav衣壳变体
[0331]
aav.cap-a4表现出强肺特异性转导
[0332]
在两个轮次的体内选择后发现了针对许多靶标的高度富集的变体。针对肺富集的第二轮次选择的结果产生了若干种候选变体，其之一表现出在使若干个外周器官去靶的情况下在肺中显著富集。
[0333]
提供了随机选择的变体(图15a)以及从此筛选出现的第二新衣壳作为比较，该第二新衣壳被发现在肠道神经元中特异性富集。为了直接评估转导效率，将候选变体的衣壳序列克隆到aav9主链中，并为包装荧光报告物mneongreen(由普遍存在的合成启动子cag驱动)的每种变体生产病毒。此构建体将在由载体转导的所有细胞类型中驱动荧光启动子的强表达，从而给出跨细胞和组织类型的每种变体的转导的可见读数。在纯化后，将每种变体
(包含aav9作为对照)的5
×
10
11
载体基因组(vg)注射到2只雄性c57bl/6小鼠中。在表达两周后，将动物处死，固定灌注，并且将一组器官切片并进行荧光成像(图15b)。表达图案证实了下一代测序(ngs)结果，其中aav.cap-a4(由aacaacctccccagaaacctc(seq id no:46429)编码的kdntpgr(seq id no:32538))表现出在整个肺中的转导增加。作为比较，aav.cap-a14表现出在肠和胃内的神经元中的表达增加，这与ngs结果一致。
[0334]
在证实aav.cap-a4表现出肺转导增加后，在低剂量全身注射后，随时间对临床相关细胞类型中aav.cap-a4以及作为对照的aav9和aav5的转导效率进行定量。对于这些实验，将aav.cap-a4、aav5和aav9注射到与年龄匹配的雄性小鼠中，并且使其表达3周(n＝3)或6个月(n＝3)。另外，将核定位序列(nls)克隆到cag-gfp表达盒中，以限制荧光报告物在细胞核中的表达，从而有助于与特异性抗体染色的共定位。在组织制备后，用纤毛气管上皮细胞、克拉拉细胞和肺泡上皮ii型(atii)细胞的抗体对每种变体的肺序列化切片进行染色(图16a)。定量表明，全身注射的aav.cap-a4转导粘膜下细胞的效率比aav9大～15倍，并且比aav5大～30倍(图16b)。类似地，atii细胞的转导比aav9大～30倍，并且比aav5大～60倍(图16c)。在aav.cap-a4转导的细胞总数中，其中大约60％是atii细胞，其余40％是未知的粘膜下细胞类型(图3d)。这些结果表明，在全身性施用后，aav.cap-a4为肺部粘膜下细胞提供了前所未有的非侵入性遗传途径，其单独或与直接递送到气道结合可以提供足够的cftr功能化以减少cf疾病的进展。
[0335]
图4示出了具有对心脏具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。图5示出了具有对肠具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。图6示出了具有对肾脏具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。图7示出了具有对肝脏具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。图8示出了具有对肌肉具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。图9示出了具有对胰腺具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。图10示出了具有对脾脏具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。图11示出了具有对胃具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。图12示出了具有对睾丸具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。图13示出了具有对肺具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。图14示出了具有对动物脂肪组织具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。
[0336]
实例4.具有偏向啮齿类动物的中枢神经系统和外周神经系统并抵抗啮齿类动物的肝脏的向性的aav衣壳变体
[0337]
将aav-php.eb工程化成远离外周表达
[0338]
在第一轮次的选择后，分析回收的序列。合成了第二轮次，与外周器官相比，该第二轮次含有在大脑中富集的大约82,000种独特的变体。在将表现最佳的变体范围缩小了几个数量级的第二轮次的选择之后，选择了要测试的序列的小子集(图4b)，该小子集对大脑
表现出高水平的富集，并且对肝脏和其它外周器官表现出负向富集(图17c)。通过注射5
×
10
11
的包装了cag-mneongreen的病毒基因组并允许表达两周，在野生型小鼠中单独测试此子集。在大脑和肝脏中产生的表达(图17d)与下一代测序(ngs)富集非常紧密相关，其中变体aav.cap-b10在大脑中表现出比php.eb更高的荧光并且肝脏转导可忽略不计。
[0339]
以上结果与大脑和外周器官的ngs富集结果相符。在这种情况下，aa588环处的插入/取代使php.eb看起来具有大脑表型，而aa455处的取代使该表型从肝脏和其它外周器官去靶。在构成第二轮次的选择的82,000种变体中，大约39,000种在大脑中表现出正向富集并且在肝脏中表现出负向富集。这些结果证实了ngs结果可以用作体内性能的准确代表。
[0340]
对于表现出大脑富集和肝脏去靶的～39,000个序列，分析了产生此表型的氨基酸组成。分析在整个7聚体取代中选择氨基酸的频率，并将其与平均值的偏差绘图，作为特定位置处富集氨基酸的热图。这些正向富集的氨基酸使衣壳从肝脏去靶，同时保持了cns富集。
[0341]
aav.cap-b10表现出cns特异性转导
[0342]
为了充分表征aav.cap-b10的与aav9和php.eb比较的性能，核定位的cag-egfp被包装并且将1
×
10
11
病毒基因组注射到动物中。在三周后测量表达。选择此剂量作为先前利用全身性递送到大脑的实验的平均剂量。结果示出，在aav.cap-b10与php.eb之间，在大脑中转导的平均细胞数以及每个细胞的平均表达水平增加，同时两者均显著高于aav9(图18a-5c)。在脊髓中，aav.cap-b10的效率大约为php.eb的60％，但仍比aav9的效率高出近20倍。相反，与php.eb(～50倍)和aav9(》100倍)相比，aav.cap-b10在肝脏中显著降低，并且与php.eb相比，亮度/细胞略微暗淡但不明显，同时两者均比aav9(～10倍)明显更暗(图18b-18d)。在外周器官的其余部分中，结果遵循相同的趋势，其中php.eb低于aav9，并且aav.cap-b10是php.eb的一部分(图18d)。
[0343]
aav.cap-b10表现出强神经元偏向
[0344]
为了进一步表征aav.cap-b10与php.eb相比在大脑中的表达情况，对神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞进行染色和定量，以确定病毒靶向大脑的各个区域中那些细胞类型的效率。尽管
[0345]
aav.cap-b10和php.eb在整个大脑区域以相似的效率转导神经元(图19a-19b)，但是与php.eb相比，在整个大脑中aav.cap-b10靶向星形胶质细胞和少突胶质细胞的水平低大约4-5倍(图19c、19d、19e、19f)。此结果指示了与aav.cap-b10突变所赋予的其它细胞类型相比对神经元具有偏向，这是与主要靶向大脑中的星形胶质细胞的aav9的一个有趣的偏离。从aav.cap-b10的ngs数据中得出的有趣指示(图15c)是该变体在小脑中负向富集。当表征在小脑中aav.cap-b10的与php.eb相比的表达时，浦肯野细胞的转导确实显著降低了大约4倍(图22)
[0346]
图3示出了具有对中枢神经系统(cns)具有特异性并且使肝脏去靶的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。图2示出了具有对cns具有特异性的向性的7聚体变体aav衣壳氨基酸序列和编码这些7聚体变体aav衣壳氨基酸序列的dna序列。
[0347]
实例5.具有偏向非人灵长类动物的中枢神经系统和外周神经系统并抵抗非人灵长类动物的肝脏的向性的aav衣壳变体
[0348]
对于在啮齿类动物中工程化的变体的治疗适用性，主要关注的是它们的转导谱转化为非人灵长类动物(nhp)的程度。如此，表征了已经在啮齿类动物中验证的变体的子集以及作为对照的aav9和aav-php.eb的nhp转导谱。在普遍存在的cag启动子的控制下产生了aav9、aav-php.eb、aav.cap-b1、aav.cap-b2、aav.cap-b8、aav.cap-b10、aav.cap-b18和aav.cap-b22八种病毒的库，其各自包装了ha标记的共济蛋白。选择使用共济蛋白是因为它是一种在整个体内表达的内源性蛋白质，并且先前表征天然存在的和经工程化的血清型的nhp转导的努力已经发现了有害的结果，这可能是由于包装了如gfp等外源转基因引起的。每个包装的fxn含有单独的12碱基rna条形码，以区分测序后一种病毒与其它病毒的贡献。将八种病毒以相等的比率汇集，并以总共1.2
×
10
14
vg/kg的剂量注射到两个成年狨猴中。在表达六周后，回收大脑和肝脏，并且获取冠状切片用于rna测序和免疫组织化学。
[0349]
与aav9相比，aav.cap-b10表现出在大脑中的rna水平增加大于6倍并且肝脏rna水平下降大于5倍。另一所选变体aav.cap-b22表现出大脑rna水平增加大于12倍，其中肝脏rna水平没有显著差异。在不受任何特定理论的束缚的情况下，这些结果表明，aav.cap-622和aav.cap-b10是用于治疗人脑疾病的有希望的变体衣壳。尽管在本实例中测试了所选数量的变体，但这些发现还表明，本文描述的在任何靶体内环境中的富集评分等于或大于aav.cap-b22和aav.cap-b10的富集评分的其它经修饰的aav衣壳蛋白也将为人类疾病提供有希望的治疗解决方案。
[0350]
实例6.1a期临床试验(亨廷顿氏病)
[0351]
执行1a期临床试验以评估在患有亨廷顿氏病(hd)晚期的受试者中一次性静脉内注射测试组合物的安全性、耐受性、药代动力学和药效学，该测试组合物包括病毒载体，该病毒载体包含经修饰的aav衣壳蛋白，该经修饰的aav衣壳蛋白具有seq id no:2933、88、2466、3943、2672、2743、3064、11958、780、2764和2741中的任一个中提供的氨基酸序列或表3-4或图2-3中提供的氨基酸序列中的任何氨基酸序列。符合条件的受试者是21岁与65岁之间的男性和女性。
[0352]
纳入标准：符合条件的受试者是21岁与65岁之间的男性和女性。(1)在国际功能、残疾与健康分类(international classification of functioning,disability and health)(icf)上签名并注明日期的受试者；(2)年龄》21岁且《65岁的男性或女性参与者；(3)提交证明亨廷顿氏病的医学报告(pcr)的参与者，其中在4号染色体上具有多个cag重复序列，大于或等于40且小于或等于50(如果参与者未进行检查和/或如果参与者没有可用的报告，则应进行新的检查)；(4)登记时在运动评估uhdrs量表(统一的亨廷顿氏病量表(unified huntington's disease rating scale))中获得5分或以上的评分；(5)登记时在uhdrs量表的功能能力评分介于8分与11分之间。
[0353]
排除标准：(1)医学研究认为如果登记进行研究，则会对受试者造成风险的任何医学观察数据(临床和物理)；(2)医学研究认为如果登记进行研究，则会对受试者造成风险的任何实验室检查数据；(3)癫痫病史；(4)诊断出重大认知障碍；(5)主动失代偿性精神病；(6)当前或先前的瘤形成病史；(7)胃肠、肝、肾、内分泌、肺、血液、免疫、代谢病理或严重且不受控制的心血管疾病的当前病史；(8)诊断出任何活动性感染，无论是病毒性、细菌性、真菌性还是由另一种病原体引起的；(9)具有参加本研究执行的测试中的任何测试的禁忌症的参与者，例如，具有起搏器或手术夹；(10)酗酒或非法吸毒者的病史；(11)在访问v-4之前
的两年中有1次或多次自杀事件的历史；(12)积极吸烟者或在登记前不到六个月停止吸烟；(13)在以下血清学测试中的至少一个呈阳性的测试：hiv 1和2(抗hiv-1,2)、htlvi和ii、hbv(hbsag、抗hbc)、hcv(抗hcv-ab)和vdrl(梅毒螺旋体)；(14)药物过敏史，包含成像造影剂或牛制品；(15)在首次施用研究产品后的头三个月内，正在使用或预期使用免疫抑制性药物或违禁药物；(16)医学研究人员认为对参与者登记存在风险的任何临床变化。
[0354]
实验：
[0355]
安慰剂。在第0周一次性注射安慰剂。
[0356]
测试高剂量。在第0周一次性注射2
×
10^10vg的测试组合物。
[0357]
测试中间剂量。在第0周一次性注射6
×
10^9vg的测试组合物。
[0358]
测试低剂量。在第0周一次性注射2
×
10^9vg的测试组合物。
[0359]
测试最低剂量。在第0周一次性注射2
×
10^8vg的测试组合物。
[0360]
主要结果量度：通过定期监测不良事件、生命体征、实验室测试、ecg以及良性和恶性肿瘤发生率的变化来进行的测试组合物的安全性[时间范围：五年]。将通过定期评估来详细评估研究产品的安全性，这些定期评估考虑了监测以下方面的变化：(1)不良事件，包含类型、频率、强度、严重度、严重性和与研究产品研究有关的所采取的行动；(2)生命体征(bp、hr、腋窝温度)、身体和医学检查(bmi、体重、身高、医疗状况-心血管、肺、消化系统、肌肉骨骼和外周(其中重点是神经学评估)及其它方面)；(3)实验室测试包含血液学、生化、泌尿学和血清学分析；(4)12导联心电图(ecg)；以及(5)通过实验室测试、磁共振成像、计算机断层扫描和超声检查获得的以下器官/系统中良性和恶性肿瘤的发生率和分类：cns、肺、肝脏、脾脏、胰腺、前列腺、睾丸、泌尿、血液和骨骼系统。
[0361]
次要结果量度：通过全局临床应答(cibis)和uhdrs改善度量的cellavita hd的初步功效[时间范围：五年]将通过对每个uhdrs量表组成：运动、认知和行为的结果进行统计比较来评估。全局临床应答将通过在cellavita hd治疗之前和之后由研究者观察到的基线评分之间的统计比较来评估。通过比较炎性标志物度量的cellavita hd的初步功效[时间范围：一年]将通过对包含il-4、il-6、il-10(白介素il)和tnf-α(肿瘤坏死因子α)在内的炎性标志物进行统计比较来评估。cellavita hd的免疫应答[时间范围：一年]。由cellavita hd诱导的免疫应答将通过cd4+和cd8+增殖和其它评估时间的基线结果之间的统计比较来评估。通过比较cns评估的cellavita hd的初步功效[时间范围：一年]。将借助于在皮质厚度测量时的磁共振图像、不同大脑结构(尤其是基底神经节)的体积，通过cns评估的统计比较来进行评估，其中特别注意质子波谱中鉴定的尾状和代谢变化。通过汉密尔顿抑郁量表(hamilton depression rating scale，hdrs)度量的自杀意念的风险[时间范围：五年]将通过自杀域进行评估。分类标点符号可以对应于轻度抑郁(评分：8到13)、中度抑郁(评分：19-22)和重度抑郁(评分：》23)。
[0362]
尽管本文中已经示出并描述了本实例的优选实施例，但对于本领域的技术人员而言显而易见的是此类实施例仅通过举例的方式提供。在不背离本公开的情况下，本领域的普通技术人员现在将会想到众多变体、变化以及取代。应当理解，本文所述的本公开的实施例的多种替代方案可以用于实践本公开。预期的是以下权利要求限定了本公开的范围以及由此覆盖在这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。