抗葡萄灰霉病和霜霉病相关蛋白chs1及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种抗葡萄灰霉病和霜霉病相关蛋白chs1及其编码基因和应用。


背景技术：

2.葡萄是我国广泛种植的果树，其果实可以用来鲜食、酿酒、制干和制汁等，具有重大的经济价值。据统计，2019年我国葡萄种植面积达到72.62万公顷，产量为1419.54万吨。灰霉病和霜霉病是危害葡萄生长比价比较严重的两种病害，生产上会造成果实品质下降，严重减产，甚至绝收。葡萄灰霉病的病原为灰葡萄孢霉(botrytis cinereapers)，属半知菌亚门真菌；葡萄霜霉病的病原为葡萄生单轴霉(plasmopara viticola(berk.&curt.)berl.&.de toni)，属鞭毛菌亚门。生产上主要采用化学药剂防治灰霉病和霜霉病，普遍存在病菌易产生抗药性，增加生产成本和污染环境等问题。因此，培育广谱抗病优质葡萄品种是葡萄育种的重点。
3.查尔酮合成酶(chs)是类黄酮合成途径中的关键酶，也是限速酶。研究表明，在番茄、亚麻、小麦、烟草和苹果中过表达chs能够增加对虫害和病原菌等环境胁迫的抗性，而在彩色棉中ghchs1基因参与植株体内和纤维中花青素的合成和累积，在纤维色泽形成中起着关键作用。目前，尚未有葡萄抗灰霉病和霜霉病与葡萄chs1之间是否存在联系的相关报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种抗葡萄灰霉病和霜霉病相关蛋白chs1及其编码基因和应用。
5.本发明提供的抗葡萄灰霉病和霜霉病相关蛋白chs1如下(a)或(b)：
6.(a)由序列表中seq id no.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
7.(b)由序列表中seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，该氨基酸序列是由seq id no.1所示的氨基酸序列经过一个氨基酸残基的取代所得到的衍生的蛋白质。
8.序列表中的seq id no.1和seq id no.2都由392个氨基酸残基组成。
9.编码所述蛋白chs1的基因(chs1基因)也属于本发明的保护范围。
10.所述基因可为如下1)至3)中任一所述的核苷酸序列；
11.4)序列表中seq id no.3所示的核苷酸序列；
12.5)序列表中seq id no.4所示的核苷酸序列；
13.6)序列表中seq id no.5所示的核苷酸序列。
14.含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
15.可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区，即包含多聚腺苷酸信号和任何其他参与mrna加工或基因表达的核苷酸片
段。在使用所述基因构建植物重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其他的植物启动子结合使用。使用所述基因构建植物表达载体时，还可以使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个核苷酸序列的正确翻译。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶活发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。
16.扩增所述基因全长的引物对也属于本发明的保护范围，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.6所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.7所示。
17.所述蛋白或所述基因可用于培育抗灰霉病和霜霉病的葡萄。
18.本发明还保护一种培育转基因葡萄的方法，是将所述基因导入目的葡萄中进行过表达，得到对灰霉病和霜霉病的抗病性高于所述目的葡萄的转基因葡萄。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的葡萄中。携带所述基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化葡萄细胞或组织，并将转化的葡萄组织培育成植株。
19.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
20.本发明在葡萄中克隆和鉴定到了抗灰霉病和霜霉病的关键基因及蛋白，使用本发明提供的chs1基因瞬时转化到感病品种的葡萄叶片上，可显著提高其抗灰霉病和霜霉病的能力，可以合理推断在葡萄中过表达chs1基因可以提高葡萄对灰霉病和霜霉病的抗性。本发明对于培育抗灰霉病和霜霉病的葡萄具有重大应用前景。
附图说明
21.图1为vachs1、vvchs1、vqchs1的基因序列对比；
22.图2为vachs1、vvchs1、vqchs1的氨基酸序列对比；
23.图3为灰霉病病原菌侵染
‘
野酿二号’和
‘
无核白’过程chs1的荧光定量分析结果；
24.图4为霜霉病病原菌侵染
‘
双红’和
‘
无核白’过程chs1的荧光定量分析结果；
25.图5为chs1蛋白在烟草叶片中的亚细胞定位；
26.图6为chs1的抗病功能验证图。
具体实施方式
27.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商或代理商购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
28.毛葡萄(vitis quinquangularis)
‘
野酿2号’、欧亚种(vitis vinifera)
‘
无核白’和山葡萄(vitis amurensis)
‘
双红’均来自广西农科院试验基地，也可通过常规市售渠道获取。葡萄灰霉病的病原菌灰葡萄孢霉(botrytis cinerea pers)和葡萄霜霉病的病原菌葡萄生单轴霉(plasmopara viticola(berk.&curt.)berl.&.de toni)由广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室葡萄分子设计育种团队保存。
29.植物总rna提取试剂盒spectrum plant total rna kit购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司的试剂盒，反转录试剂盒primescript
ꢀⅱꢀ
1st strand cdna synthesis kit购于takara(大连)公司，高保真dna聚合酶2
×
phanta max master mix、感受态细胞fast-t1和克隆试剂盒5min ta/blunt-zero cloning kit购于南京诺唯赞生物科技有限公司，胶回收试剂盒qiaquick gel extraction kit和质粒小提试剂盒tianprep mini plasmid kit购于天根生化科技有限公司，荧光定量试剂盒lightcycle 480 sybr green
ꢀⅰꢀ
master购于广州聚研生物科技有限公司。
30.表1引物序列
31.引物名称序列(5
’‑3’
)用途序列表中的编号chs1-fatggtgtcagtgggggaaat基因扩增seqidno.6chs1-rtgctacacaatcgactcac基因扩增seqidno.7chs1-qfcgttctgagcgagtatggga实时荧光定量pcrseqidno.8chs1-qrtgtggtgccctttccttctt实时荧光定量pcrseqidno.9ef-1α-faattttgaccaagatcgacagg葡萄内参基因seqidno.10ef-1α-rcagcaacagtttgacgcatg葡萄内参基因seqidno.11chs1-2fgctctagaatggtgtcagtgggggaaatc亚细胞定位seqidno.12chs1-2rgccccgggatgtgagtcgattgtgtagca亚细胞定位seqidno.13
32.实施例1 chs1基因的克隆和序列分析
33.1.不同品种的chs1基因克隆
34.1.1基因克隆
35.‘
野酿二号’、
‘
无核白’和
‘
双红’叶片总rna提取参照spectrum plant total rna kit试剂盒说明书。参照takara公司的primescript
ꢀⅱꢀ
1st strand cdna synthesis kit的试剂盒说明书进行cdna的合成。根据ncbi上的chs1序列(登陆号：xm_019224647.1)设计特异引物chs1-f和chs1-r，引物序列见表1，chs1-f的序列如seq id no.6所示，chs1-r的序列如seq id no.7所示。以cdna为模板，利用2
×
phanta max master mix试剂盒进行扩增，反应条件为：95℃预变性3min；95℃15s，54℃15s，72℃45s，30个循环；72℃延伸5min。1％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，参照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行pcr产物回收。回收片段参照5min ta/blunt-zero cloning kit试剂盒与t载体进行连接，37℃，连接5min。将连接产物转化到fast-t1化学感受态细胞。具体步骤参照fast-t1的说明书。挑取白斑，pcr检测，检测的引物为chs1-f和通用引物m13-f。质粒的提取步骤详见tianprep mini plasmid kit试剂盒说明书。将质粒送往上海生工公司测序。碱基序列和氨基酸序列的比对使用dnaman软件。
36.2.2序列分析
37.以
‘
野酿二号’、
‘
无核白’和
‘
双红’cdna为模板，利用rt-pcr分别从三个品种中扩增出vqchs1、vvchs1和vachs1三个基因的编码区序列，全长均为1182bp，编码392个氨基酸。其中，vqchs1基因的序列如seq id no.3所示，vvchs1基因的序列如seq id no.4所示，vachs1基因的序列如seq id no.5所示。这三个基因序列的对比如图1所示，在图1中，shuanghong表示vachs1，tangwu表示vvchs1，maoputao表示vqchs1；从图1可以看出三个基因的序列高度相似。
38.这三个基因的预测编码的chs1蛋白的分子量为42.92kd，理论等电点为6.10，包含20种氨基酸，正电荷的氨基酸(arg+lys)43个，负电荷的氨基酸(asp+glu)48个；不稳定性系数为34.59，属于稳定蛋白，且亲水性平均系数(gravy)为-0.064，为亲水蛋白。tmhmm在线网站分析表明该蛋白没有跨膜结构域，不属于跨膜蛋白。氨基酸序列对比图请参见图2，在图2中，shuanghong表示vachs1，tangwu表示vvchs1，maoputao表示vqchs1，经比对分析发现，vvchs1和vachs1的氨基酸序列完全一致，如seq id no.1所示；vqchs1与vvchs1、vachs1只在第61位存在1个氨基酸的差异，如seq id no.2所示；这说明chs1在这三个葡萄品种中高度保守，推测它们具有同样的功能。
39.实施例2 chs1的表达模式分析
40.1.实验方法
41.取不同葡萄品种一年生枝条上第2-4位健康的幼嫩叶片，用超纯水清洗2次，滤纸吸干叶片表面水分，用打孔器打取直径为1cm的叶盘，放入铺有两层湿润滤纸的培养皿中进行保湿。叶盘均分到5个培养皿中，每个皿的标记为0h、6h、12h、24h和48h。每个品种选取长势一致的三棵植株作为三个生物学重复。截取直径为0.5cm的葡萄灰霉病病原菌的菌块放在叶盘表面，菌丝朝下放于
‘
野酿二号’和
‘
无核白’叶盘。将浓度为1.1
×
106/ml葡萄霜霉病病原菌孢子囊的菌液滴到
‘
无核白’和
‘
双红’的叶盘，每个叶盘上接种35μl。将处理过后的样品放在光照培养箱培养，培养条件为光照16h、黑暗8h，温度为20℃。在0h、6h、12h、24h和48h取样，迅速用液氮冷冻，保存于-80℃冰箱备用。
42.参考实施例1的方法提取叶盘的rna和合成cdna。利用primer5.0软件设计荧光定量引物chs1-qf和chs1-qr(引物序列见表1)，chs1-qf的序列如seq id no.8所示，chs1-qr的序列如seq id no.9所示，以ef-1α(引物序列见表1)为内参基因，ef-1α-f的序列如seq id no.10所示，ef-1α-r的序列如seq id no.11所示。使用roche公司的lightcycle480进行荧光定量pcr。每个生物学重复设置三个技术重复。荧光定量反应体系参照lightcycle 480sybr greenⅰmaster说明书。采用2-δδct
算法计算基因相对表达量。
43.2.结果与分析
44.2.1灰霉病病原菌侵染
‘
野酿二号’和
‘
无核白’过程chs1的表达模式
45.用打孔器在
‘
野酿二号’和
‘
无核白’的嫩叶上打取叶盘，直径0.5cm葡萄灰霉病病原菌的菌块进行侵染，并在侵染后0h、6h、12h、24h和48h分别收集叶盘用于chs1的荧光定量分析。结果如图3所示，受病原菌侵染后6h，
‘
野酿二号’vqchs1诱导上调表达，侵染后12h～24h,表达量有所下降，而48h又急剧上升；感病
‘
无核白’vvchs1的表达模式变化与之类似，但整体表达量均低于抗病
‘
野酿二号’vqchs1。
46.2.2霜霉病病原菌侵染
‘
双红’和
‘
无核白’过程chs1的表达模式
47.用相同浓度的霜霉病病原菌侵染
‘
双红’和
‘
无核白’的嫩叶叶盘，侵染后0h、6h、12h、24h和48h分别取样用于vachs1和vvchs1表达量分析。结果如图4所示，病原菌侵染后，
‘
双红’中的vachs1的持续上调表达，在24h时表达量达到最高，48h时表达量略有下降；而
‘
无核白’vvchs1的表达量持续下降，在48h时略有所回升。因此，vachs1和vvchs1对于霜霉菌侵染的响应模式不同，而且抗性品种
‘
双红’中vachs1的表达水平显著高于感病品种
‘
无核白’48.2.3分析
49.‘
野酿二号’是具有灰霉病抗性的葡萄品种，
‘
双红’是具有霜霉病抗性的葡萄品种，
‘
无核白’是对灰霉病和霜霉病均感病的葡萄品种，本实施例分别用灰霉病病原菌侵染
‘
野酿二号’和
‘
无核白’、霜霉病病原菌侵染
‘
双红’和
‘
无核白’，发现抗病品种
‘
野酿二号’、
‘
双红’中的vqchs1和vachs1在受到病原菌侵染后都可以诱导上调表达，而感病品种
‘
无核白’中的vvchs1的表达量明显低于vqchs1和vachs1。这说明chs1在抗病葡萄抵抗灰霉菌和霜霉菌侵染过程中发挥重要作用。
50.结合实施例1的序列分析，发现抗霜霉病品种
‘
双红’中的vachs1与感病的
‘
无核白’中的vvchs1之间无氨基酸差异，推测抗病性差异可能与其基因上游的启动子序列差异有关。
51.实施例3chs1的亚细胞定位
52.1.实验方法
53.以
‘
双红’叶片cdna为模板，使用含有xba
ꢀⅰ
和xma
ꢀⅰ
酶切位点的上下游引物chs1-2f/r，利用2
×
phanta max master mix进行pcr扩增；同时使用xba
ꢀⅰ
和xma
ꢀⅰ
酶切pbi121-gfp载体，将目的基因和载体大片段回收纯化后进行连接转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞。通过pcr、酶切鉴定阳性克隆并进行测序；将构建成功、测序正确的重组载体质粒电转化法转入农杆菌gv3101，28℃培养2d；通过瞬时转化方法进行注射；48h后取标记的农杆菌注射的烟草叶片，于激光共聚焦显微镜c2-er(nikon，japan)下观察gfp融合蛋白的绿色荧光位置，拍照记录。
54.2.实验结果与分析
55.以vachs1作为代表验证chs1的亚细胞定位，构建表达载体pbi121-vachs1-gfp，将其瞬间转化至烟草叶片表皮细胞中，pbi121-gfp设置为阴性对照，观察融合蛋白的荧光位置。结果如图5所示，在图5中，a、e为荧光蛋白通道，b、f为叶绿体荧光蛋白通道，c、g为明场，d、h为荧光蛋白通道、叶绿体荧光蛋白通道和明场的叠加图。从图5可以看出，瞬时表达pbi121-gfp空载的细胞中，绿色荧光均匀分布在细胞膜、细胞核和细胞质，而瞬时表达pbi121-vachs1-gfp的细胞中，绿色荧光主要集中在细胞核内，膜上少量分布。
56.实施例4 chs1的抗病功能验证
57.1.实验方法
58.将pbwa(v)hs-vachs1-gfp过表达载体、pbwa(v)hs-gfp表达载体分别转化到农杆菌gv3101。挑取单菌落接种到5mlyep培养基上，并加上2.5μl的100ng
·
ml-1
的卡那霉素，在28℃、200r/min的摇床上培养2d。2d后，将旧培养基上的菌液吸取200μl到20ml新鲜yep中生长。24h后，将细菌培养物转移到50ml离心管，室温下1500g离心4min，用渗透缓冲液[50mm mes ph 5.6，2mm na3po4，0.5％蔗糖(w/v)和100μmol
·
ml-1
乙酰丁香酮]洗涤沉淀两次，并将细菌悬浮液稀释至od600为0.2。在25℃、黑暗环境中生长1～2h，注射前轻轻摇动离心管，使用不带针头的1ml注射器注射菌液到
‘
无核白’叶片远轴端。渗透后，将叶片转移到标准生长条件的生长室生长。
[0059]
2.实验结果
[0060]
在分别将pbwa(v)hs-vachs1-gfp过表达载体、pbwa(v)hs-gfp瞬时转化到
‘
无核白’叶片上之后2d，首先在紫外灯下观察蛋白的表达情况，结果如图6中的a、b所示，a和b分别为为gfp和chs1-gfp荧光蛋白表达，从彩色状态的图片中可观察到明显的绿色荧光，说明
pbwa(v)hs-gfp和pbwa(v)hs-vachs1-gfp在
‘
无核白’上正常表达。
[0061]
再将直径为0.5cm的灰霉病病原菌菌块和浓度为2
×
105孢子囊/ml的霜霉病病原菌菌液分别侵染瞬时转化的叶片，5d后观察发病情况，结果如图6中的c、d、e、f所示，c和e分别为灰霉病病原菌、霜霉病病原菌侵染表达gfp的
‘
无核白’叶片，d和f分别为灰霉病病原菌、霜霉病病原菌侵染表达vachs1的
‘
无核白’叶片。从图中可以看出，表达vachs1的
‘
无核白’叶片接种灰霉病病原菌后，发病面积和严重程度明显小于对照组，抗性显著增强；对照组
‘
无核白’叶片接种点周围上可以观察到明显的白色霜霉菌，而过表达vachs1的
‘
无核白’叶片表现出较强的霜霉病抗性，叶片表面几乎观察不到病菌生长。这说明了过表达vachs1可以显著提高无核白叶片对灰霉病和霜霉病的抗性，鉴于vqchs1与vvchs1、vachs1只在第61位存在1个氨基酸的差异，chs1在这三个葡萄品种中高度保守，因此它们应具有同样的功能，这表明chs1可能具有潜在的广谱抗病作用。
[0062]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。