1.本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及一种高活性酪氨酸酚裂解酶突变体。
背景技术：
2.l-左旋多巴(l-dopa)是目前治疗帕金森疾病的主要药物，此外l-左旋多巴还可用于治疗心力衰竭、肌张力障碍、弱视等疾病。目前l-dopa主要制备方法有植物提取法，化学合成法和微生物酶催化法。植物提取方法由于原材料来源受限，使用较少。化学合成法常以香草醛和内酰脲为原料，通过八步化学反应合成。但是该方法过程繁琐且在合成过程中需要使用大量金属催化物，存在成本高、污染严重等问题。微生物酶催化法作为一种更为高效，绿色的新型合成方法受到了越来越多研究者的关注。
3.酪氨酸酚裂解酶(e.c.4.1.99.2),也称β
–
酪氨酸酶，可催化l-酪氨酸的β消去反应，生成丙酮酸，苯酚和氨。这个反应为可逆反应。若以邻苯二酚代替苯酚，可以生成l-左旋多巴。
4.自然界中许多微生物都含有酪氨酸酚裂解酶，研究发现，相较于其他来源，弗式柠檬酸杆菌和草生欧文式菌来源的酪氨酸酚裂解酶酶应用于工业生产，但酶活仍较低，无法满足工业化生产的需求。
技术实现要素：
5.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高活性酪氨酸酚裂解酶突变体。
6.本发明的第二个目的是提供编码上述高活性酪氨酸酚裂解酶突变体的基因。
7.本发明的第三个目的是提供包含上述高活性酪氨酸酚裂解酶突变体的基因的重组质粒。
8.本发明的第四个目的是提供携带上述重组质粒的宿主细胞。
9.本发明的技术方案概述如下：
10.一种高活性酪氨酸酚裂解酶突变体，在seq id no.1所示的酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列的第206位丙氨酸突变为丝氨酸，第202位谷氨酸突变为苏氨酸和第201精氨酸突变为酪氨酸；所述一种高活性的酪氨酸酚裂解酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
11.编码上述高活性酪氨酸酚裂解酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
12.包含上述高活性酪氨酸酚裂解酶突变体的基因的重组质粒。
13.携带上述重组质粒的宿主细胞。
14.有益效果：
15.本发明的高活性的酪氨酸酚裂解酶突变体，其酶活相较于野生型酪氨酸酚裂解酶提高了153％，可以节约成本。
i双酶切后连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌bl21，得到转化产物；将转化产物涂布在lb固体培养基(含有50μg
·
ml-1
卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养10h，得到转化子；挑取转化子接种至lb液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养10h后提取质粒进行测序验证，验证正确即获得重组质粒pet-28a-tpl和重组大肠杆菌bl21/pet-28a-tpl。
33.利用反向pcr技术，以获得的重组质粒pet28a-tpl为模板进行定点突变，获得pcr扩增产物；之后利用dpn i在37℃消化14min,去除模版，将连接产物转化大肠杆菌bl21，得到转化产物；将转化产物涂布在lb固体培养基(含有50μg
·
ml-1
卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养10h，得到转化子；挑取转化子接种至lb液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养10h后提取质粒进行测序验证，验证正确即获得重组质粒pet-28a-tpl-s20和重组大肠杆菌bl21/pet-28a-tpl-s20。(其中，s20为高活性酪氨酸酚裂解酶突变体的简称，)
34.其中，引入突变所用的引物如下；
35.s20-f1:
36.ataaaacactttaatgccatggctcgcggtcagggtatacaccgcgcgcatgttcgcc(seq id no.5)
37.s20-f2:
38.ggcgaacatgcgcgcggtgtataccctgaccgcgagccatggcattaaagtgttttat(seq id no.6)
39.反向pcr的反应条件为：先加入s20-f1和s20-f2引物，95℃预变性5min；然后进入17个循环：95℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸6min；最后72℃延伸5min，4℃保温。
40.将重组大肠杆菌bl21/pet-28a-tpl和bl21/pet-28a-tpl-s20分别划线于lb固体培养基上，于37℃的条件下培养10h，得到单菌落；挑取单菌落接种于lb液体培养基中，于37℃的条件下培养13h，得到种子液；将种子液以1％(v/v)的接种量接种至lb液体培养基中，于37℃的条件下培养2.5h后，在lb液体培养基中添加终浓度为0.2mm的iptg，于16℃的条件下继续诱导培养12h，获得发酵液；将发酵液4℃、8000rpm离心15min离心，收集菌体；将菌体超声波细胞破碎，得到细胞破碎上清液；
41.高活性的酪氨酸酚裂解酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
42.实施例2：酪氨酸酚裂解酶及高活性酪氨酸酚裂解酶突变体纯化方法
43.配置镍柱纯化过程中使用的缓冲液，其中a液：50mm三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(ph 8.0),100mm氯化钠，20mm咪唑；b液：50mm三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(ph 8.0),100mm氯化钠，30mm咪唑；c液：50mm三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(ph 8.0),100mm氯化钠，150mm咪唑。
44.将实施例1获得的两种细胞破碎上清液各1l在4℃，18000rpm离心30，得到上清在4℃缓慢加入镍柱中，待蛋白样品充分结合后，加入20ml a液进行第一次洗杂，之后再加入10mlb液进行第二次洗杂，最后加入20mlc液进行洗脱并收集洗脱液。利用nanodrop仪器测定洗脱液中蛋白质浓度。
45.野生型酪氨酸酚裂解酶、高活力的酪氨酸酚裂解酶突变体的纯酶,蛋白胶图于图1
和图2。
46.并利用上述酶活测定方法，分别测定野生型酪氨酸酚裂解酶和高活力的酪氨酸酚裂解酶突变体比酶活，确定突变体比酶活提高了153％。
技术特征：
1.一种高活性酪氨酸酚裂解酶突变体，其特征在是在seq id no.1所示的酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列的第206位丙氨酸突变为丝氨酸，第202位谷氨酸突变为苏氨酸和第201精氨酸突变为酪氨酸；所述一种高活性的酪氨酸酚裂解酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。2.编码权利要求1的高活性酪氨酸酚裂解酶突变体的基因，其特征是所述基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。3.包含权利要求2所述高活性酪氨酸酚裂解酶突变体的基因的重组质粒。4.携带权利要求3所述重组质粒的宿主细胞。
技术总结
本发明公开了一种高活性酪氨酸酚裂解酶突变体，是在SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列的第206位丙氨酸突变为丝氨酸，第202位谷氨酸突变为苏氨酸和第201精氨酸突变为酪氨酸；所述一种高活性的酪氨酸酚裂解酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。本发明的高活性的酪氨酸酚裂解酶突变体，其酶活相较于野生型酪氨酸酚裂解酶提高了153％，可以节约成本。节约成本。
技术研发人员：叶升 许家钰 关凤慧
受保护的技术使用者：天津大学
技术研发日：2021.11.22
技术公布日：2022/1/28