专利名称：控制细胞活性的新试剂的制作方法
技术领域：
本发明描述了靶向控制哺乳动物细胞活性的新试剂，特别是用该试剂来控制特定种类的细胞与其外界环境的相互作用。该试剂作为一种药品用于治疗各种疾病。
活细胞的基本性质是它们对外界环境的应答能力。细胞与其外界环境之间的界面是质膜。质膜由双磷脂层组成，并有许多蛋白质分子嵌入其中。这些组成膜的蛋白质(IMPs)引起细胞与其外界环境的许多相互作用。
涉及IMPs的相互作用包括物质的转运，包括营养物质进出细胞；调节质膜对离子的通透性；对细胞外分子的识别和应答；以及一个细胞与另一个细胞的粘连。免疫系统的特殊功能(也通过IMPs传递)是通过一组免疫细胞与另一组的粘连来显示特殊的外来肽的片断。
细胞调节其应答和与外界环境相互作用能力的一种方法是改变质膜中IMPs的量和种类。获得这种改变的一种机理是IMPs的可逆性内在化作用，它通过细胞摄粒途径进入可再循环膜泡中(RMVs)。在这种情况下，贮存在RMVs中的IMPs相当于内部贮藏或IMPs池，可通过RMVs与质膜的细胞排粒融合快速将IMPs排出到细胞表面。调节细胞摄粒/细胞排粒循环的平衡调节可快速控制细胞表面IMPs的密度。在控制细胞活性方法的实施例中，通过骨骼肌和脂肪组织中的胰岛素应答细胞调节葡萄糖的摄取。胰岛素增加特定异型(iso-form)葡萄糖转运物(GLUT4)的量，该物质在这些细胞的质膜中发现。在细胞表面上的高浓度GLUT4分子增加了葡萄糖的摄取。因此，通过控制质膜中葡萄糖转运物的数量，可以调节对胰岛素的应答。
在应答外界信号中改变细胞表面IMP表达的另一实例是补体碎片C3b和C4b受体，即1型补体受体CR1。当激活人中性细胞时，质膜的CR1表达立即增加6—10倍。
在另一实施例中，大量炎性和免疫细胞修改细胞表面粘连分子在激活时的表达。因此，激活中性细胞和单核细胞引起细胞表面粘连分子Mac—1和P150，95的调节。这些粘连分子对炎性细胞靶向移动到炎性部位是重要的。
在又一实施例中，各种激素(胰岛素，象胰岛素的生长因子，白细胞介素1和血小板衍生物的生长因子)引起各种类型细胞中细胞表面转铁蛋白受体表达的快速增加。转铁蛋白受体与来自细胞外环境的difleric转铁蛋白结并因此将铁摄入细胞中。该转铁蛋白/转铁蛋白受体系统在铁穿过血脑屏障进入CNS的细胞转运中也发挥作用，转运过程是转移细胞学(transcytosis)已知的。转移细胞学也包括母亲免疫力向生长中胎儿的转移。
在又一实施例中，已知利尿素醛固酮增加膀胱上皮细胞顶膜中Na+通道的细胞表面表达。该机理包括盐滞留和例如在低盐饮食状态下发生。
在调节IMPs细胞膜表达的更进一步的实施例中，注意到免疫系统的功能基于外来或非自身抗原的识别。由能识别和应答外来肽序列的免疫系统细胞提供识别和免疫应答部分。这些肽断片由免疫系统的已知作为抗原引入细胞(antigen presenting cells)的其它细胞引入免疫细胞中，引入抗原细胞摄入外来抗原性蛋白，消化成肽并在细胞膜上形成的裂口中，通过IMPs的主要组织相容复合物显示外来肽。
因而IMPs是细胞与其外界环境相互作用能力的中枢并使这些相互作用具有各利不同的性质，发现存在大批不同的IMPs并不意外，IMPs在细胞功能方面的中枢作用意味着它们经常牵涉到生理病理状态，并且是很多治疗手段的靶子。
以前工艺中控制IMP活性的方法主要集中在调节曾在细胞表面表达的IMP的功能。因而以前的治疗方法对特殊IMPs和特殊种类细胞的特殊功能都是特异的，殊异转移IMPs的抑制剂已发展为治疗剂。例如，神经元5HT转移蛋白抑制剂用作抗抑郁药。特殊受体IMPs的拮抗剂通常用作药剂。其实例包括抗组胺药(对组胺受体的H1和H2亚型都是特异的)和β肾上腺素能受体阻滞剂。IMP功能的抑制剂也广泛用作药剂。其实例包括离子经膜转移抑制剂如利尿剂速尿和氨氯吡脒，后者为膀胱上皮细胞顶部Na+通道的抑制剂。已知钾通道抑制剂发展为抗心律失常剂。通常，细胞粘连IMPs也是开发选择性拮抗剂的靶子。
正在寻求的另一方法是在遗传水平，通过改变编码IMP的适宜基因的转录水平，选择性地修改特殊IMPs的表达并因此调节特异IMP蛋白的合成。
简而言之，已知IMPs在细胞对其外界环境的应答中起关键作用。以前控制IMPs的方法通常包括把在细胞表面的IMPs作为靶子并修改其功能。预期控制质膜中IMPs的密度可广泛用于治疗各利疾病。由于IMPs的具大多样性和目前治疗学上相互作用的特殊性，本发明意外地发现单一种类的试剂可以修改多种细胞型中IMPs的表达。该相同种类的试剂也可以修改转移IMPs，受体IMPs，粘连IMPs，通道IMPs和引入抗原的IMPs的表达。以前，影响IMPs的试剂按功能分类，例如Ca++拮抗剂，每组成员在化学和机械方面都是非常不同的。通过对比，本发明涉及的该种类试剂在结构上与在预计对试剂功能有影响的特定区域合理引入的取代物是同种的。本发明进一步的方面是该试剂选择性地以特殊型的细胞为靶子来只在该型细胞上选择性地调节IMP表达。
本发明涉及控制细胞与其外界环境相互作用的试剂，特别地，本发明提供控制组成膜的蛋白(IMP)分子从细胞内组成部分向细胞膜转移的试剂，以便修改细胞与其外界环境的相互作用。更特别地，本发明提供一种新试剂，它可以修改可再循环的膜泡的结构，这样抑制了它们将IMPs转移到细胞表面的能力。
下列术语含意如下组成膜的蛋白(IMP)意指嵌入或跨越生物膜脂双层的任何蛋白质。
可再循坏的膜泡(RMV)意指细胞胞液中存在的，与脂双层膜接壤的细胞内的小泡。RMVs由质膜形成并通过称作细胞摄粒作用的方法移入细胞内。RMVs由细胞质膜形成又与之融合的循环过程。移动到质膜并与之融合的过程称作细胞排粒作用。RMVs在细胞中的功能是可逆性地将IMPs转移到细胞表面和从细胞表面转移；这方面，它们不同于神经分泌细胞的分泌腺囊。
核内体指那些通过细胞摄粒作用产生电质膜形成的细胞内的小泡。
重链指形成梭状杆菌神经毒素的两个多肽链中的大者；它具有约100kDa的分子量并通常称作HC。轻链指形成梭状杆菌神经毒素的两个多肽链中的小者；它具有约50kDa大的分子量并通常称作LC。天然存在的重链和轻链至少通过一个二硫键共价配对。
H2片断指通过蛋白水解酶(例如胰蛋白酶或木瓜蛋白酶)劈开而从梭状杆菌神经毒素的重链的氨基末端产生的片段。
H2L指通过蛋白水解酶(例如用胰蛋白酶或木瓜蛋白酶)劈开而产生的梭状杆菌神经毒素的片段，其中轻链通过二硫键仍与H2片段配对。
本发明一方面提供一种试剂来控制引起代谢物跨越细胞膜转运的IMP的水平，因而控制细胞内代谢物的有效性。
本发明另一方面提供一种试剂来控制引起代谢物跨越细胞膜进入细胞或离开细胞的转运的IMP水平，因而控制代谢物通过细胞的转运。
本发明又一方面是提供一种试剂来控制引起离子选择性通过细胞质膜的IMP的水平，因而调节细胞内离子的浓度。
本发明的又一方面是提供一种试剂来控制引起对发出信号分子识别的IMP的水平，因而调节细胞对发出信号分子的应答性。
本发明的又一方面是提供一种试剂来控制通过将发出信号的分子结合于膜上而引起信号跨越细胞膜转导的IMP水平，因而调节细胞对发出信号分子的应答性。
本发明的又一方面是提供一种试剂来控制引起从摄入抗原产生的肽片段在细胞表现显现的IMP水平。在有机体中，其结果影响有机体的免疫应答。
本发明也提供一种试剂，它对于靶细胞具有靶向特异性，因此，该试剂的作用范围局限于所说种类的细胞。
如前面所述，以前控制IMP活性的方法集中在调节曾经在细胞表面表达的IMP功能。在直接对照中，本发明调节正在细胞表面表达的IMP水平。
可以看到，本发明的目的(提供一种试剂来控制细胞表面IMPs水平)有很多潜在应用来调节细胞对其环境的应答。本发明包括一种试剂，它发挥作用是为了影响将IMPs运载到细胞表面的机理，如实施例，例如实施1和2中所示的。这样一种试剂必须完成三个没有联系的功能，前两个功能在本领域是公知的。首先，该试剂必须结合在细胞表面结构上(结合部位)。然后必须进入细胞的胞液中。已知通过细胞摄粒作用，分子进入细胞内。然而，因为已知只有某些细胞表面结合部位包含细胞摄入作用，所以只有这些结合部位适于作为靶子。一旦试剂通过细胞摄入作用进入细胞，那么它必须离开产生的核内体，跨越核内体膜进入胞液。获得结合试剂的特异细胞和进入胞液的能力在文献中是公知的(例如Paxten I；Willingham，MC；&Fitzgerald，Dsp，1986，cell47，641—648，Olsnes，S；Sandvig，K；Petersen Ow；&Van Dews，B，1989，Immunol.Today 10，291—295，Stram，TB；Anderson，PL；Rubin—Kelley，VE；William，DP；Kiyokawa，T；&Murphy，JR；1991，Ann NY Acad.Sci 636，233—250)。试剂的第三个功能是本发明意外地发现的，称之影响RMV的能力。本试剂更意外的方面是通过影响RMV限制了RMV将IMPs转运到细胞表面的能力。
因此，本发明试剂包含下列官能区B区，结合区，将试剂结合到能进行细胞摄入作用的靶细胞结合部位，产生含试剂的核内体。
T区，易位区，将试剂或部分试剂从核内体内跨越核内体膜易位到细胞胞液内。
E区，效应器区，抑制IMPs通过RMVs转运到细胞表面。
可将B区制成对靶细胞具有特异性的区。将试剂靶向到特殊利类的细胞上的能力在本领域是公知的。因此，通过使用本领域公知的很多结合细胞分子中的一种可获得B区的功能，结合细胞分子包括(但不限定于)，抗体，单克隆抗体，抗体片断(Fab，F(ab)’2，Fv，单链抗体等)激素，Cytokines，生长因子和植物血凝素。
T区的功能可通过能在核内体膜内形成适宜孔的分子获得。有文件证明毒素分子的特定部位可形成这种孔，它包括amongst others，炭疽毒素，肉毒杆菌毒素、破伤风毒素，白喉毒素和假单胞菌内毒素的片断(Hoch，DH；Romero—Mira，M；Rhrlich，BE；Finkelstein，A；Das Gupta，BR；&Simpson，LL；1985 PNAS 82 1692—1696，Olsnes，S；Stenmark，H；Moskaug，JO；McGill，S；Madshus，IH；&Sandvig，k，1990，Microbial Pathogenesis8，163—168)。一种这样的分子为梭状杆菌神经毒素的重链，例如A型肉毒杆菌神经毒素。优选只用能在核内体膜内形成小孔的毒素分子的那些部位。
E区的功能，抑制将IMPs转运到细胞表面的能力在本领域是未知的。已发现某些功能局限于可形成孔的毒素分子(包括梭状杆菌神经毒素如肉毒杆菌或破伤风杆菌的片段)的不同部位，当进入靶细胞的胞质中时，可抑制RMVs中IMPs转运到细胞表面降低细胞表面IMPs的浓度。特别发现破伤风毒素和肉毒杆菌A，B，C1，D，E，F和G型的片段尤其适合。这种分子的一个实施例为已知称H2L片段的梭状杆菌神经毒素的那部分，其中，已除去毒素重链的羧基端的神经元靶向活性，剩下一半以二硫键连接到轻链上的氨基端。另一实施例为梭状杆菌神经毒素的轻链，如B型肉毒杆菌神经毒素的轻链，特别是分子中具有依赖Zn++型含金属蛋白酶活性的那些部分。
因此，本发明包含下列结构的试剂B区……T区……E区各区通过在区与区之间含有适宜隔离区的键共键相连。
在本发明一个实施例中，B区是可结合到进行细胞摄粒作用的靶细胞结合部位的结合分子，T区是肉毒杆菌神经毒素或其片断的重链而E区是肉毒杆菌神经毒素或其片断的轻链。T和E区可来自相同或不同的C.肉毒杆菌血清型。
在本发明的另一实施例中，B区是可结合到靶细胞进行细胞摄粒作用的结合部位的结合分子，T区是破伤风神经毒素或其片断的重链而E区是肉毒杆菌神经毒素或其片断的轻链。
在本发明的另一实施例中，B区是可结合到靶细胞进行细胞摄粒作用的结合部位的结合分子，T区是肉毒杆菌神经毒素或其片断的重链而E区是破伤风神经毒素或其片断的轻链。
在本发明的另一实施例中，B区是可结合到靶细胞进行细胞摄粒作用的结合部位的结合分子，T区是破伤风神经毒素或其片断的重链而E区是破伤风神经毒素或其片断的轻链。
可以理解，本发明包含来自具有上述功能的相同或不同有机体的毒素分子或毒素分子片断的任意结合。
当给予有机体试剂时，靶细胞表面IMPs的浓度减小。这可引起许多需要的作用包括减少代谢物的摄入或离子进出细胞，减少靶细胞对产生信号分子的应答，或改变有机体的免疫应答。实施例实施例1将3T3—LI成纤维细胞经胰蛋白酶作用成混悬液并在300v/cm，960mF和时间常数为11—11.5毫秒下，用带有电容扩充器的Bio—Rad Gene脉冲发生器，在含或不含1mM肉毒杆菌神经毒素—B(BoNT—B)下电处理(electroporatcd)，接着将电处理的细胞粘着并保留在37℃24—孔板中的单层培养基中72小时。洗涤细胞并在含或不含5nm1型象胰岛素型生长因子(IGF—1)下，在37℃恒温培养5分钟，然后在冰中放置5分钟。从细胞中吸取上清液并用冰冷1.5nM125I—转铁蛋白(sp.act47Tbq/mmol)来代替。估计，在含100倍克分子过量的非放射性转铁蛋白下，在类似的恒温培养中进行的非特异结合。2小时后，弃去上清液，用冰冷缓冲液洗3次，用1N NaOH消化细胞层，并用LKB 1275 minigamma gamma计数器测定结合的125I—转铁蛋白。将IGF—1存在下的特异结合的125I—转铁蛋白表示为IGF—1不存在下特异结合的百分数计算结合转铁蛋白的上调值(μp—regualation)。
表1显示，与对照相比，在用BoNT—B处理的细胞中，对IGF—1产生应答的结合125I—转铁蛋白减小。这表明，将BONT—B引入3T3—LI成纤维细胞的胞液中抑制了这些细胞中IGF—1刺激的转铁蛋白受体的上调作用。
按Western beotting法用在神经分泌细胞的分泌囊蛋白中识别的肽序列SEQ.ID.1(QQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQK LSELD-DRADALQAGASQFETSAAKLKRK YWW KNLK)中培养的多克隆抗体来分析从3T3—LI成纤维细胞消化液中提取的三硝基甲基—X—114—可溶的蛋白质。该抗囊抗体显示，与用BONT—B处理的未报道有神经分泌活性的成纤维细胞样品中有关双键的反应性减少。因此，BONT—B将修改3T3—LI成纤维细胞中囊状(可能为RMV)结构并同时抑制转铁蛋白受体的上调作用。
实施例2用实施例1给出的相同的条件，在含或不含0.5mM肉毒杆菌神经毒素—A(BONT—A)时电处理3T3—LI成纤维细胞。如实施例1所述，测定处理和未处理细胞中IGF—1刺激的结合125I—转铁蛋白。
表2结果显示，BONT—A处理的3T3—LI成纤维细胞取消了对IGF—1产生应全的结合125I—转铁蛋白的上调作用。这表明，将BON-T—A引入3T3—LI成纤维细胞的胞液中抑制了这些细胞中IGF—1刺激的转铁蛋白受体的上调作用。
实施例3用实施例1给出的相同的条件，在含或不含0.5μM BONT—A的H2L片段(H2L—A)时，电处理3T3—LI成纤维细胞。该片断通过使用甲苯磺酰基苯丙氨酸氯甲烷处理胰蛋白酶限制性蛋白水解C肉毒杆菌A血清型神经毒素而产生。通过层析法，在SephadexG—200上(Shone，CC；Hanbleton，P；&Melling，J；1985，Eur J Biochem 151，17—82)纯化该H2L复合物。如实施例1所述进行电处理并测定处理和未处理细胞中IGF—1刺激的结合125I—转铁蛋白。
表3结果显示，H2L—A处理的3T3—LI成纤维细胞抑制对IGF—1产生应答的结合125I—转铁蛋白的上调作用。这表明将肉毒杆菌神经毒素—A的H2L—A片断引入3T3—LI成纤维细胞的胞液中抑制这些细胞中IGF—1刺激的转铁蛋白受体的上调作用。
实施例4按述方法(Frost，SC&Lane MD，1985，J Biol chem260，2646—2652)用地塞米松，3—异丁基—1—甲基黄嘌呤和胰岛素处理3T3—LI成纤维细胞，从中分化去3T3—LI脂细胞。用稀释到含血清的Dulbecco’s改性的Eagles溶媒中的A血清型肉毒杆菌神经毒素处理分化后7天的3T3—LI脂细胞并无菌过滤(BONT—A的最终浓度为200nM)。在含8％CO2下将毒素处理的和对照细胞在37℃恒温培养45小时。然后将细胞洗涤两次并在含8％CO2下，在不含血清的Dulbecco’s modified Eagle’s溶媒中恒温培养2小时，之后，将细胞洗入Krebs Ringer磷酸盐中并在Krehs Ringer磷酸盐(基本摄入)或含100nM胰岛素的Krebs Ringer磷酸盐(刺激摄入)中，在37℃下恒温培养15分钟。通过加入[3H]2—脱氧葡萄糖开始葡萄糖摄入(14.2KBq，10μM葡萄糖)。在37℃进行10分钟后，通过吸出葡萄糖溶液来停止反应并用冰冷的磷酸盐缓冲的盐迅速洗涤。通过加入0.2N NaOH溶解细胞，并通过加入0.2M HCl中和溶液。用Wallac1410液体闪烁计数器，在最佳闪烁状态(in optiphase Sciytillant)通过液体闪烁计数来测定[3H]2—脱氧葡萄糖的摄入。
已知如果将高浓度的神经毒素与细胞一起恒温培养较长时间，那么梭状芽胞杆菌神经毒素能通过低亲和力的受体而进入神经分泌细胞中(例如PC12细胞)。该过程显示了使用不同于肌神经接点处存在的高专一性和高亲和性受体的受体途径。此外，已有报道某些梭状胞细杆菌毒素对吞噬细胞如巨噬细胞有影响，假定进入细胞是通过这些细胞的特异吞噬活性。通常，这是公认的，然而，梭状芽胞杆菌神经毒素的神经元选择性是选择性结合和细胞进入机理的结果。因此，本研究意外的发现是，如上所述，3T3—LI脂细胞和肉毒杆菌神经毒素—A的恒温培养明显抑制胰岛素刺激的[3H]2—脱氧葡萄糖转运的上调作用(表4)。已知脂细胞中胰岛素上调的葡萄糖转运是葡萄糖转运蛋白从细胞内池(RMVs)向细胞表面移运的结果。因此，该结果证明，肉毒杆菌神经毒素—A抑制胰岛素刺激的RMVs中葡萄糖转运装置向脂细胞表面的移动。
实施例5将3T3—LI脂细胞经胰白酶作用并在含或不含肉毒杆菌B(0.32mM)下电处理细胞混悬液。在电处理中，使用960mF的电容器，产生300v/cm的脉冲强度时间常数为11—12ms。电处理后，洗涤细胞并取出与溶媒和血清一起放到6孔板中。在37℃下，在湿润环境中(空气/二氧化碳；92.5％/7.5％)恒温培养该细胞72小时。该过程结束后，洗涤细胞并提取到0.1N NaOH中。然后用0.1N HCl中和提取物。将膜蛋白分配到三硝基甲苯X—114中并随后按Westernblotting法，用实施例1中所述的抗囊抗体来分析。本研究的意外发现通过减小抗体与肉毒杆菌神经毒素—B处理的细胞样品上共轭双键的反应性证明，将肉毒杆菌神经毒素电处理到脂细胞胞液中引起囊(假设为RMV)结构的修改。
实施例6在本实施例中，合成一种试剂来调节脂细胞的胰岛素依赖型葡萄糖转运装置的细胞表面表达。
在本实施例中，试剂的结合区(B)是胰岛素型生长因子II，它是从所述的BRL—3A细胞的有条件的溶媒中提纯的(Marquette，H；Todaro，GJ；Henderson，LE&Qroszlan，s，1981，J Biol.Chem 2562122—2125)。
通过用甲苯磺酰基苯丙氨酸氯甲烷处理的胰蛋白酶限制性蛋白水解神经毒素来从C肉毒杆菌A血清型神经毒素中制备易位区(T)。然后，通过层析法，在交联葡聚糖(Sephaelex)G—200上(Shone，cc；Hambleton，P；&Melling，J；1985，Eur.J.Biochem.151，75—82)提纯含T区的馏分。然后将该馏分的磷酸盐/硼酸盐缓冲液，pH 8.4加到季铵乙基—交联葡聚糖柱上，并于4℃下与2M尿素和0.1M二硫苏糖醇一起在柱上恒温培养过夜。用含2M尿素和10mM二硫苏糖醇的缓冲剂冲洗柱子。用含2M尿素和10mM二硫苏糖醇的磷酸盐/硼酸盐缓冲剂和NaCl从0.1—0.2M的渐进梯度洗脱T区(Poulain，B；wadsworth，JDF；Maisey，EA；Shone，CC；Melling，T；Tauc，L；&Dolly，JO，1989，Eur.J.Biochem.185，197—203)。梭状芽胞杆菌神经毒素以二硫键连接到由重链和轻链组成的双链蛋白上(Simpson，LL；1986，Ann.Rev.Pharmicol.Toxicol.26，427—453)。应该注意，用所给的方法制得的T区相当于称为H2的神经毒素重链的馏分。
通过在还原的条件下，在2M尿素中，用两性电解质形成的蔗糖梯度进行等电点聚焦，从C破伤风神经毒素中制备效应器区(E)(Weller，U；Dauzenroth，M—E；Meyer Zu Heringdo片，D&Habermann，E，1989，Eur.J.Biochem.，182649—656)。应该注意，按所给方法制得的E区相当于通常称为LC的神经毒素的轻链。
在还原条件下，将等摩尔比的E区和T区混合到一起并在4℃搅拌下，通过重复性透析，到不含还原剂的生理盐水溶液中来共价结合。任何剩余的游离巯基，通过加入150mM碘乙酰胺在4℃下，在黑暗处放置30分钟来衍化。通过大小排阻层析法，在交联葡聚糖G—150上，用pH 7.0的磷酸钾缓冲剂来纯化E—T复合物。最后，用N—琥珀酰亚胺基3—(2—Pyridylothio)proprionate(SPDP)，将B区结合到E—T复合物上。将E—T复合物(5mg)溶解到1ml磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中，并向其中加入溶解在0.5ml无水乙醇中的200mg SPDP。混合物在室温反应30分钟后，通过交联葡聚糖G25进行凝胶过滤，从过量的SPDP中分离出2—吡啶基二硫化物聚代的肽。类似地处理B区，但用较少的SPDP(0.2ml乙醇中含20mg)。取代的B区再次从交联葡聚糖G25柱上获得，并通过加入最终浓度为0.05M的二硫苏糖醇来还原。过量的还原剂通过在交聚葡聚糖G 25上凝胶过滤而除去。将等份(W/W)的取代E—T复合物和取代的及还原的B区混合剂一起并在4℃下放置18小时。通过层析法，在交联葡聚糖G—150上用pH7.0的磷酸钾缓冲液来纯化该试剂。
上述制备的试剂用来试验其抑制3T3—LI脂细胞中，胰岛素刺激的葡萄糖转运表达增加的能力。通过所述方法用地塞米松，3—异丁基—1—甲黄嘌呤，和胰岛素来处理而从3T3—LI成纤维细胞中分化出3T3—LI脂细胞(Frost，SC&Lane MD，1985，J Biol Chem 260，2646—2652)，并在分化后8—12天内使用。在含或不含试剂下，将细胞在37℃恒温培养90分钟。然后，在每个试验开始时，在不含血清的Dulbeao’smodified Eagle’s溶媒中，将细胞恒温培养2小时，将胰岛素处理的细胞暴露在由1.6×10-4M贮液液稀释成的10-7M胰岛素中10分钟。如上所述处理后，在37℃迅速用Krebs—Ringer磷酸盐洗涤细胞，并测定10分钟内，从含或不含10-7M胰岛素的37℃Krebs Ringer磷酸盐中，摄入的[3H]2—脱氧葡萄糖。通过吸出葡萄糖溶液来中止反应并迅速用冰冷的磷酸盐缓冲液盐水洗。通过加入0.2M氢氧化钠溶解细胞，并且在用Wallac1410液体闪烁计数器，在Optiphase闪烁体中闪烁计数前，通过加入0.2M盐酸来中和溶液。
实施例7在本发明的另一实施例中，从相同血清型的肉毒杆菌神经毒素中制备E和T区并且制备已经结合在一起的E和T区。用甲苯磺酰基苯丙氨酸氯甲烷处理的胰蛋白酶限制性蛋白水解C肉毒杆菌的A血清型神经毒素，通过层析法，在交联葡聚糖G—200上来纯化E—T复合物(Shone，cc；Hambleton，P；&Melling，J 1985，Eur，J.Biochem.15175—82)。
应该注意，该片断相当于所说的H2L片断。任何剩余的游离巯基，如实施例6所述，通过加入150mM碘乙酰胺来衍化。如实施例6所述制备的结合区(B)为类胰岛素生长因子II，并用所述的SPDP结合到E—T复合物中。如实施例6所述，试验试剂对脂细胞中胰岛素依赖型葡萄糖转运表达的活性。
实施例8在本发明另一实施例中，用下列方法来合成用于调节中性粒细胞(CD35)中补体片断C3b的CR1受体的细胞表面表达的试剂。从SHCL3单克隆抗体到白细胞粘连分子P150，95来制备B区。从A血清型肉毒杆菌神经毒素制备E和T区，如实施例7所述迅速结合并如该实施例所述结合到B区。
试验试剂对中性粒细胞中CR1(CD35)的细胞表面表达活性的优选方法是使用全血溶解技术。用试剂处理EDTA抗凝的正常供体的全血4小时并在37℃下，用PBS稀释由DMSO制备的10-2M贮备液得到的10-6M的fMet—Leu—Phe来激活30分钟。对照组细胞在PBS中恒温培养。在室温下，将全血和10ml藻红蛋白轭合的单克隆抗体抗CD35一起恒温培养30分钟(SerotecMCA 554PE)，用BectonDickinson溶解液来溶解红细胞，用PBS洗涤白细胞并用含2％甲醛的PBS再混悬。用装有LysysII软件的FACScan(Becton Dickinson)，通过流动血细胞计数来分析表面结合的PE。
实施例9在本发明的另一实施例中，用下列方法合成用来调节白细胞粘连分子Mca—1(CDIIb)在细胞表面表达的试剂。按标准方法学，用胃蛋白酶从SHCL3单克隆抗体到白细胞粘连分子P150，95来制备B区，并通过凝胶过滤来纯化(Martin，FJ；Hubbell，WL；和Papahad-jopoulos，D，1981，Biochemistry20，4229—4238)。从A血清型肉毒杆菌神经毒素来制备E和T区，如实施例7所述，迅速结合，并如该实施例所述，结合到B区。
试验试剂对Mac—1(CD IIb)在中性粒细胞表面表达活性的优选方法是使用全血溶解技术。在37℃下，用试剂处理EDTA抗凝的正常供体的全血4小时并在37℃下，用PBS稀释由DMSO制备的10-2M贮存液得到的10-6M fMet—Leu—phe来激活30分钟。对照组细胞与PBS恒温培养。在室温下，将全血与10ml轭合单克隆抗体抗CD IIb的fluoroscein异硫氰酸盐一起恒温培养30分钟(SerotecMCA551F)。用Becton Dickinson溶解液来溶解红细胞，用PBS来洗涤白细胞并用含2％甲醛的PBS再混悬。用装有Lysys II软件的FACScan(Becton Dickinson)，通过流动血细胞计数来分析表面结合的FITC。
实施例10在本发明另一实施例中，按下列方法合成用来调节膀胱上皮顶膜Na+通道在细胞表面含量的试剂。按标准方法学，用胃蛋白酶，从细胞表面标志膀胱上皮细胞的高亲和力单克隆抗体来制备B区，并通过凝胶过滤来纯化(MarTin，FJ；Hubbell，WL；和PapahadjopoHlos，D，1981，Biochemistry 204229—4238)。如实施例7所述，从A血清型肉毒杆菌神经毒素制备E和T区，迅速结合，并如该实施例所述结合到B区。
用泌尿上皮细胞来检验试剂对醛固酮刺激的阿米洛利(amiloride)敏感的Na+通道增加的作用。按原来培养方法，从鼠的膀胱来制备的膀胱上皮细胞(Johnson，MD；Bryan，GT；Reznikoff，CA；1985，J Urol 133，1076—1081)，在含或不含试剂下，在37℃恒温培养90分钟。将醛固酮处理的细胞在醛固酮中暴露1小时。如上所述处理后，迅速洗涤细胞并测定在37℃恒温培养5分钟后摄入的阿米洛利敏感的22Na+。
实施例11在本发明另一实施例中，按下列方法合成用来调节B细胞引导抗原的试剂。按标准方法学，用胃蛋白酶从黑猩猩B细胞单克隆抗体LL12来制备B区，并通过凝胶过滤来纯化(Martin，FJ；Hubbell，WL&Papahadjopoulos，D，1981，Biochemistry，20，4229—4238)。如实施例3所述，用A血清型肉毒杆菌神经毒素来制备E和T区。迅速结合并如该实施例所述结合到B区上。
用鼠的B淋巴瘤细胞系TA3来检验试剂对引导抗原的作用。首先将这些细胞和试剂在37℃下恒温培养90分钟、然后加入鸡卵溶菌酶(HEL)并在37℃继续恒温培养2小时。将TA3细胞固定并在用I—AK—限制的HEL 46—61的特异T细胞杂交瘤3A9培养前洗涤(Lorenz，RG&Allen，PM，1989，Nature 337，560)。用3A9细胞的上清液来检验其支持IL—2依赖细胞系，CTLL生长的能力。用上清液培养2天后，通过混入3H—胸苷3小时后来测定增殖的应答。
上述实施例完全为说明本发明。对本专业技术人员而言，很清楚，三个区的任何结合都在本发明范围内。在合成试剂时，通过化学结合，用本专业技术人员公知的试剂和技术，将本发明的T—E成分结合到靶向成分。因此，尽管所给的实施例只使用SPDP结合试剂，但任何其它能共价结合到试剂靶向部分的结合试剂和本专业技术人员公知的结合试剂都包含在本申请范围内。同样，对本专业技术人员而言，很明显，对整个试剂或试剂片断的任一编码都可以很容易地建立，并且当在适宜的有机体上表达时，可用来产生试剂或试剂片断。通过本专业技术人员公知的技术得到的本发明试剂的遗传结构也包含在本发明范围内。
本发明所述试剂可体内直接或以其可药用的盐或酯，在治疗各种病理生理性疾病的方法中使用。
例如，在治疗葡萄糖代谢障碍的方法中，使用一种试剂来限制某些细胞的糖摄入。一个具体例子是在通过限制脂细胞摄入葡萄糖并因此而减少在这些细胞中积累脂来治疗临床上的肥胖症的方法中使用一种形式的试剂。
在另一实施例中，在治疗高血压的方法中使用一种试剂来调节肾细胞对离子的摄入因而控制这些器官的液体摄入。
在又一实施例中，在治疗炎症的方法中，使用一种试剂来控制靶细胞对触发炎性应答的外境信号的应答。
在又一实施例中，在治疗免疫障碍的方法中，使用一种试剂来控制抗原引入细胞将肽序列引导入免疫系统的效应器细胞中。
表1在3T3—LI成纤维细胞中IGF—1对125I—转铁蛋白结合的上调作用处理方式IGF—1％基本结合±SD*对照－100±28(n＝3)＋258±46(n＝3)BoNT—B －100±8(n＝3)＋149±27(n＝3)*以不含IGF—1的特异结合的百分数来表示125I—转铁蛋白与3T3—LI成纤维细胞的特异性结合。
表2在3T3—LI成纤维细胞中IGF—1对结合125—转铁蛋白的上调作用处理方式IGF—1 ％基本结合±SD*对照－ 100±28(n＝3)＋ 258±46(n＝3)BoNT—A － 100±44(n＝3)＋ 149±10(n＝3)*以不含IGF—1的特异性结合的百分数来表示125I—转铁蛋白与3T3—LI成纤维细胞的特异性结合。
表3在3T3—LI成纤维细胞中IGF—1对结合125I—转铁蛋白的上调作用处理方式IGF—1 ％基本结合±SD*对照－ 100±28(n＝3)＋ 258±46(n＝3)H2L—A － 100±15(n＝3)＋ 134±60(n＝3)*以不含IGF—1的特异结合的百分数来表示125I—转铁蛋白与3T3—LI成纤维细胞的特异性结合。
表4 3T3—LI脂细胞摄入的[3H]—2—脱氧葡萄糖基本 胰岛素刺激的对照 1655±67(n＝3) 14328±264(n＝3)BoNT—A处理2306±49(n＝3) 5587±322(n＝3)该结果是三次测定的平均值±SEM并给出在10分培养期内细胞单层所消耗的总dpm。
权利要求
1.一种通过控制由可再循环的膜泡将组成膜蛋白转运到细胞膜来控制细胞与其外环境相互作用的试剂。
2.根据权利要求1的试剂，用以控制引起对代谢物跨细胞膜转运的IMP的水平并因此控制细胞内代谢物的可用性。
3.根据权利要求1的试剂，用以控制引起对代谢物跨细胞膜进入细胞或离开细胞的转运的IMP的水平并因此控制代谢物通过细胞的转运。
4.根据权利要求1的试剂，用以控制引起对离子选择性通过细胞质膜的IMP的水平并因此调节细胞内的离子浓度。
5.根据权利要求1的试剂，用以控制引起对信号分子的识别的IMP的水平并因此调节细胞对信号分子的应答性。
6.根据权利要求1的试剂，用以＋控制通过将信号分子结合于膜上而引起信号跨细胞膜转导的IMP水平并因此调节细胞对发生信号的应答性。
7.根据权利要求1的试剂，用以控制引起从摄入的抗原衍生的肽片断在细胞表面的显现的IMP水平。
8.根据前述任一项权利要求的试剂，它对靶细胞种类具有靶向特异性，因此，该试剂的作用范围局限于所说种类的细胞。
9.根据前述任一项权利要求的试剂，其中包含如下联接在一起的三区B、T和EB区…T区…E区其中B区为结合区，它将试剂结合到细胞的结合点上，而该细胞可进行细胞摄粒作用形成该内体。T区为易位区，它将试剂(有或无结合点)从核内体内跨越核内体膜易位到细胞的胞液中。E区为效应器区，它抑制RMVs将IMPs转运到细胞表面的能力。
10.根据权利要求9的试剂，其中包含如下联接在一起的三区B、T和EB区…X…T区…X…E区其中X为间隔分子或共价键，但至少一个X为间隔分子。
11.根据权利要求9或10的试剂，其中结合区B区结合到结合点上，该结合点是特殊种类细胞的特征。
12.根据前述任一项权利要求的试剂，其中B区包括能进行细胞摄粒作用以便形成核内体的靶细胞的表面抗原的单克隆抗体。T区包括毒素分子区或区域片断，它将试剂从产生的核内体内易位到细胞的胞液中。E区包括不同的毒素分子区或区域片断，它与T区功能的区别在于具有Zn2+依懒型蛋白酶活性。
13.根据前述任一项权利要求的试剂，其中B区包括能进行细胞摄粒作用以便形成核内体的靶细胞的细胞表面受体的配体。T区为易位区，它将试剂(有或无结合点)从核内体内跨越核内体膜易位到细胞的胞液中。E区为效应器区，它抑制RMVs将IMPs转运到细胞表面的能力。
14.根据权利要求13的试剂，它通过应答胰岛素的脂细胞来影响葡萄糖的摄入速率，其中B区为胰岛素依懒型生长因子II受体的配体T区为将毒素跨细胞膜易位的肉毒杆菌神经毒素的重链区或区域片断。E区为具有Zn2+依懒性嗜金属蛋白酶活性的肉毒杆菌神经毒素的轻链区或区域片断。
15.根据权利要求9—14中任一项的试剂，其中T和E区是从梭状芽胞杆菌神经毒素得到的。
16.制备根据前述任一项权利要求的试剂的方法，包括以下列方式共价联接三区B、T和EB区…T区…E区其中B区包括能进行细胞摄粒作用以便形成核内体的靶细胞的细胞表面受体的配体。T区为易位区，它将试剂(有或无结合点)从核内体内跨越核内体膜易位到细胞的胞液中。E区为效应器区，它抑制RMVs将IMPs转运到细胞表面的能力。
17.根据权利要求16的制备试剂的方法，包括以下列方式共价连接三区B、T和EB区…X…T区…X…E区其中X为间隔分子或共价键，但至少一个X为间间隔分子。
18.根据权利要求16或17的方法，其中结合区B区结合到结合点上，该结合点是特殊种类细胞的特征。
19.制备根据前述任一项权利要求中的试剂的方法，包括构建编码该试剂的基团结构，将该结构与宿主生物体结合并表达该结构从而产生该试剂。
20.根据前述任一项权利要求的试剂或其药用盐在治疗葡萄糖代谢疾病中的应用。
21.根据前述任一项权利要求的试剂或其药用盐在治疗临床肥胖疾病中的应用。
24.根据前述任一项权利要求的试剂或其药用盐在治疗高血压疾病中的应用。
23.根据前述任一项权利要求的试剂或其药用盐在治疗炎性疾病中的应用。
24.根据前述任一项权利要求的试剂或其药用盐在治疗免疾系统疾病中的应用。
全文摘要
本发明描述一种靶向控制哺乳动物细胞活性的新试剂，尤其是该试剂用于控制特定细胞与其外界环境的相互作用。该试剂可用作治疗各种疾病的药物。本发明试剂含有按下列方式连在一起的B、T和E三个区区B—区T—区E，其中区B为结合区，它与进行摄粒作用产生核内体的细胞的结合部位相结合，T区为易位区，它将试剂(有或无结合点)从核内体跨越核内体膜易位到细胞的胞液中，E区为效应器区，它抑制RMVs转运IMPs到细胞表面的能力。
文档编号C07K14/33GK1124929SQ9419212
公开日1996年6月19日 申请日期1994年3月18日 优先权日1993年3月19日
发明者J·R·诺斯, K·A·福斯特, C·P·昆, C·C·肖恩 申请人:斯佩伍德实验室有限公司, 微生物研究中心