专利名称：一种制备干扰素方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种制备干扰素方法，具体涉及一种制备α1b型干扰素的方法。
Goeddel等于1980年第一个用基因工程技术表达了干扰素，从此各型别的IFN均有其基因工程产品。八十年代初，医科院病毒学研究所候云德等首次克隆到α1b干扰素基因，并在1984年组建了表达质粒和工程菌pBV867/BMH71-18，从α1b干扰素的工程菌来看，最早构建的pBV867/BMHt71-18表达水平很低，α1b干扰素的表达量不对菌体总蛋白的1％，很难适用于大规模生产。
重组蛋白的纯化历来是一个比较棘手的问题，为了使最终产品符合相关的标准，必须使用多种方法、多个步骤达到目的，这势必影响产品的最终得率。目前由于重组α1b型干扰素工程菌株表达量低、发酵密度低、纯化工艺复杂而引起的干扰素产量低、生产成本高。
本发明在不改变表达的α1b干扰素氨基酸序列的前提下，对α1b干扰素的基因序列进行优化并选择合适的表达系统，重新构建能高效表达α1b干扰素的工程菌株，并建立该菌株的发酵、纯化工艺。本发明采用T7启动子的表达质粒，构建新的α1b干扰素高表达工程菌。所涉及的干扰素为大肠杆菌表达的。本发明所述的α1b型干扰素基因也可用于在酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞系统中表达α1b干扰素。
本发明方法通过下述步骤进行，1.改造α1b干扰素基因，2.构建α1bM2表达载体，3.表达菌株发酵试验，4.工程菌发酵罐发酵试验。5.纯化α1b干扰素。
本发明根据α1b型干扰素的理化性质，采用操作简便、重复性好、吸附量大的离子交换层析技术，简化方法、提高干扰素的最终得率。
本发明通过对α1b型干扰素部分氨基酸编码序列的密码子的更改、并结合相应的软件在计算机上辅助预测TIR(翻译其始位点)二级结构，通过定点突变技术改变α1b干扰素基因5’端编码序列，优化mRNA的TIR二级结构。采用DNDSIS(V7.00)软件(Hitachi softwareengineering Co.LTD)对原有的表达质粒pBVXa1b进行分析，选用含有T7启动子的PET-9a质粒(Promega公司提供)作为载体构建表达质粒。选择包括质粒核糖体结合(SD)序列前20个碱基至编码基因AUG在内的编码干扰素氨基末端12个氨基酸的核苷酸序列作为TIR二级结构的分析范围，在不改变N端氨基酸序列的前提下，根据以下原则(1)使AUG处于二级结构的单链环区，(2)提高TIR的ΔG，(3)兼顾在大肠杆菌中偏爱使用的密码子。根据TIR二级结构分析结果，确定改变N端第3、6、7位氨基酸密码子。
本发明用定点突变技术及PCR法更改了N端前15位氨基酸的部分碱基，同时也改变了C端两个在大肠杆菌中属于稀有密码子的氨基酸编码序列，更有利于蛋白的翻译。将改造的α1b型干扰素基因插入带有T7启动子的PET系列质粒，转入大肠杆菌BL21(DE3)、JM109(DE3)，得到表达菌株，经小量发酵试验证明干扰素表达水平明显提高，且是可溶性蛋白。较目前使用的用Ptrp启动子构建的、没有改变过序列的天然α1b型干扰素表达菌株高出10倍以上。本发明应用半乳糖、乳糖替代常规使用的昂贵的IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)作为诱导物，得到了同样的表达效果，明显降低了生产成本，所述乳糖的价格仅是IPTG的1％左右。突变后的α1b干扰素基因经全序列分析正确无误，命名为α1bM2。其具有Sequencel的序列。
本发明提供了针对上述菌株的高密度、高表达发酵工艺及纯化工艺方法。发酵密度每升发酵液可以达到60克，干扰素表达量可达占菌体总蛋白的30％左右，表达形式为可溶性蛋白。本发明采用简单的离子交换层析结合分子筛层析新方法，避免了使用价格昂贵的单克隆抗体亲和层析柱纯化，及由此造成的外源蛋白污染的可能性，大大简化了原来的生产工艺，干扰素得率可以达到20％以上，得到的高纯度干扰素符合国家标准。本发明方法可以大大降低干扰素的市场价格，具有可观的经济效益和社会效益。本发明方法构建的能高效表达α1b干扰素、适合于生产规模的工程菌，可替代低表达的工程菌。经表达质粒的α1b干扰素基因序列分析、发酵菌体蛋白的免疫印迹检测和干扰素活性测定、与α干扰素抗体的中和试验到中试纯化样品原液N端15个氨基酸序列分析、肽图分析、等电点测定到中试成品的理化鉴定、生物学鉴定，结果证明所述工程菌所表达、纯化的产物与现生产的α1b干扰素完全一致。
其中1、2、3为原工程菌，4、5、6为本发明工程菌突变后的α1b干扰素基因经全序列分析正确无误，命名为α1bM合成引物5’CCAGGAGCATCAGAGTACGACGGTTATCCAGGC3’，按本领域常规方法采用T4polynucleotide kinase进行引物磷酸化，对N端第12，13，14，15位氨基酸核苷酸定点变，上述突变基因片段插入载体质粒PSP72(Promega公司)，构成质粒pSAM1。
2)改变α1b干扰素基因两端氨基酸的核苷酸编码序列，第3，4，6位氨基酸的密码子CTC，GAG，ACC，分别改为CTG，GAA，ACT，编码第163，164氨基酸的密码子AGG，AGG分别改为CGC，CGT。
设计一对PCR引物，其上游引物38个碱基序列为带NdeI酶切位点5’TATAACATATGTGTGATCTGCCTGAAACTCACAGCCTG3’下游引物35个碱基序列为带BamHI酶切位点5’GCGGATCCTTATTCCTTACGGGGTAATCTTTCTTG3’利用上述两条引物，以pSAM1质粒为模板，PCR反应条件上游引物(20μmol/μl)0.5μl，下游引物(20μmol/μl)0.5μl，10×Taq酶缓冲液5μl，10mMdNTP1μl，质粒DNA0.2μl，Taq酶(4U/μl)0.8μl，加无菌双蒸水至50μl；94℃恒温4分钟后，94℃50秒、60℃50秒、72℃90秒，共25个循环，最后一个循环72℃延时10分钟，回收PCR产物，DNA序列分析证明正确，改变后的α1b型干扰素基因命名为α1bM2。改造后的α1b干扰素基因序列从5’到3’。
实施例2构建α1bM2基因干扰素表达质粒及其表达1)T7启动子表达α1b干扰素的原核表达质粒用NdeI、BamHI酶切α1bM2基因PCR产物，插入经NdeI、BamHI酶切的带T7启动子的PET质粒，转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定证明α1bM2基因已插入PET质粒，质粒命名为pEAM2。
2)表达质粒在大肠杆菌中表达质粒pEAM2转化大肠杆菌JM109(DE3)、BL21(DE3)，得到阳性克隆；阳性克隆在培养液中37℃200rpm16小时活化后，按1∶60比例接种3ml、50ml、200ml、800ml含卡那霉素的LB培养液，37℃250rpm振荡培养至OD600在1.0左右，加IPTG(终浓度为0.2mM)诱导4小时，离心收集菌体，菌体悬于pH7.2的PBS中，取菌液加等量2×电泳上样缓冲液，100℃加热5分钟后，15％SDS-PAGE电泳，经扫描分析及生物学活性测定，比原菌种提高10倍以上。表1是本发明工程菌与表达量比较。表1

**单位为x105IU/ml菌液3)半乳糖、乳糖作为诱导剂替代IPTG，干扰素表达没有差异。半乳糖、乳糖的诱导浓度为2mM。表2不同诱导剂下本发明工程菌的干扰素表达水平。表2

实施例3 工程菌的发酵罐高密度发酵及纯化大规模发酵单菌落挑入含卡那霉素50μg/ml的LB培养基，37℃振荡培养过夜后，转接6000ml含50μg/ml的LB培养基，37℃振荡培养4小时至OD600到0.6左右，转接到有150L发酵培养基的300L发酵罐中，设定一定的条件，并添加营养物，培养至OD600到10左右时，加乳糖诱导培养6小时，离心收集菌体。SDS-PAGE电泳扫描证明干扰素表达占菌体可溶性的30％，较原菌种同样体积发酵表达量高10倍以上。
所述发酵培养基含(克/升)KH2PO40.5-2.5，K2HPO4·3H2O0.5-2.5，MgSO4·7H2O2.0-5.0，(NH4)2SO40.5-3.0，Yeast extract2.0-6.04，PPE0.15(ml/L)。调pH至7.0，所用化学试剂均为AR级。在发酵过程中可根据需要补充金属离子、维生素包括CoCl2·6H2OH3BO3，FeSO4，CuSO4·5H2O，MnSO4·H2O，ZnSO4·7H2O，CaCl2和VitB1。
发酵条件为菌种接种量2-10％，发酵温度控制在36.5-37.0℃之间，pH用氨水调节控制在6.8±0.2之间，溶氧浓度(DO)值控制在5-20％。
发酵过程中补充营养成分，工程菌采用两阶段培养，在发酵初期至对数生长前期分次补足葡萄糖作为碳源5-30g/L发酵液促进细菌生长。在诱导开始后对发酵液补充酵母粉、蛋白胨或酪蛋白水解物，加量各为5-20g/L发酵液，及补加2-10g/L(发酵液)葡萄糖。表3是300升发酵结果。表3发酵批号 发酵终体积OD600菌体湿重 表达量(％) 活性(L)(kg) (x109IU/L)试1 220 58.2 16.4 27.3 5.92试2 220 55.0 14.8 29.1 12.7试3 220 54.0 15.5 29.6 8.86纯化α1b干扰素菌体悬浮，破菌，离心取上清液，过G-50预柱澄清蛋白溶液，用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析做粗分离，吸附蛋白用pH4.020mM NaAC-HAC缓冲液洗脱后，上CM-SepharoseFast Flow层析柱。用0.5N NaCl、pH4.0 20mM NaAC-HAC缓冲液洗涤杂蛋白，用pH5.5 20mM NaAC-HAC缓冲液洗脱干扰素。将洗脱组分超滤浓缩后用Sephacryl S-100分子筛分离纯化，收集峰顶即得到高纯的干扰素原液。
产物鉴定纯化的干扰素蛋白原液，经N端15个氨基酸测定、Westernblot(免疫印迹)鉴定、肽图分析及生物学活性测定确认上述菌种表达的产物为α1b型干扰素，用国际通用的WISH/VSV系统测定比活为1×107IU/mg。
一种制备干扰素方法序列表<110>上海生物制品研究所<120>一种制备干扰素方法<130>1<160>1<170>PatentIn version3.1<210>1<211>498<212>DNA<213>人类<400>1tgtgatctgc ctgaaactca cagcctggat aaccgtcgta ctctgatgct cctggcacaa 60atgagcagaa tctctccttc ctcctgtctg atggacagac atgactttgg atttccccag120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctccagcca tctctgtcct ccatgagctg180atccagcaga tcttcaacct ctttaccaca aaagattcat ctgctgcttg ggatgaggac240ctcctagaca aattctgcac cgaactctac cagcagctga atgacttgga agcctgtgcg300atgcaggagg agagggtggg agaaactccc ctgatgaatg tggactccat cttggctgtg360aagaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tccctctctt tatcaacaaa cttgcaagaa480agattacgcc gtaaggaa 498
权利要求
1.一种制备干扰素方法，其特征是通过下述步骤进行，1)改造α1b干扰素基因，2)构建α1bM2表达载体，3)菌株发酵试验，4)发酵罐发酵试验，5)纯化α1b干扰素。
2.按权利要求1所述的制备干扰素方法，其特征是所述的α1b干扰素基因具有Sequencel的序列。
3.按权利要求1和2所述的制备干扰素方法，其特征是所述的α1b干扰素基因其编码α1b干扰素第3，4，6，12，13，14，15，163，164位氨基酸的核苷酸序列同义突变，核苷酸序列分别由CTC，GAG，ACC，AGG，AGG，ACC，TTG，AGG，AGG变为CTG，GAA，ACT，CGT，CGT，ACT，CTG，CGC，CGT。
4.按权利要求1和2所述的制备干扰素方法，其特征是所述的α1b干扰素基因突变位点至少改变1个位点。
5.按权利要求2所述的制备干扰素方法，其特征是所述的干扰素为大肠杆菌表达的，所述的α1b干扰素基因还可用于在酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞系统中表达α1b干扰素。
6.按权利要求1所述的制备干扰素方法，其特征是所述的发酵试验其中发酵培养基含(克/升)KH2PO40.5-2.5，K2HPO4·3H2O0.5-2.5，MgSO4·7H2O2.0-5.0，(NH4)2SO40.5-3.0，Yeast extract2.0-6.0，PPE0.15(ml/L)，所述菌种接种量为2-10％，所述发酵温度为36.5-37.0℃，pH为6.8±0.2，溶氧浓度值为5-20％。
7.按权利要求1所述的制备干扰素方法，其特征是所述的发酵试验过程中补充营养成分，其中发酵初期至对数生长前期补足葡萄糖，在诱导后补充酵母粉、蛋白胨或酪蛋白水解物及葡萄糖。
8.按权利要求6述的制备干扰素方法，其特征是所述的补充营养成分补加量各为5-20g/L发酵液，葡萄糖补加量为2-10g/L发酵液。
9.按权利要求1所述的制备干扰素方法，其特征是所述的发酵试验中用乳糖、半乳糖替代IPTG作为诱导剂。
10.按权利要求1所述的制备干扰素方法，其特征是所述的纯化工艺中采用离子交换结合分子筛法。一种制备干扰素方法序列表<110>上海生物制品研究所<120>一种制备干扰素方法<130>1<160>1<170>PatentIn version3.1<210>1<211>498<212>DNA<213>人类<400>1tgtgatctgc ctgaaactca cagcctggat aaccgtcgta ctctgatgct cctggcacaa 60atgagcagaa tctctccttc ctcctgtctg atggacagac atgactttgg atttccccag 120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctccagcca tctctgtcct ccatgagctg 180atccagcaga tcttcaacct ctttaccaca aaagattcat ctgctgcttg ggatgaggac 240ctcctagaca aattctgcac cgaactctac cagcagctga atgacttgga agcctgtgcg 300atgcaggagg agagggtggg agaaactccc ctgatgaatg tggactccat cttggctgtg 360aagaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tccctctctt tatcaacaaa cttgcaagaa 480agattacgcc gtaaggaa498
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种制备α1b型干扰素的方法。本发明在不改变表达的α1b干扰素氨基酸序列的前提下，对α1b干扰素的基因序列进行优化并选择合适的表达系统，重新构建能高效表达α1b干扰素的工程菌株，并建立该菌株的发酵、纯化工艺，应用半乳糖、乳糖替代常规使用的昂贵的IPTG。经试验证明干扰素表达水平明显提高，得率可达20％以上，表达量可达占菌体总蛋白的30％左右，且是可溶性蛋白。本发明明显降低了生产成本。减少了外源蛋白污染的可能性，简化了生产工艺，具有可观的经济效益和社会效益。
文档编号C07K1/14GK1451748SQ03115249
公开日2003年10月29日 申请日期2003年1月29日 优先权日2003年1月29日
发明者徐帆洪, 吴腾捷 申请人:上海生物制品研究所