一种黄瓜耐寒基因ltt紧密连锁的snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种黄瓜耐寒基因ltt紧密连锁的snp分子标记及其应用。


背景技术：

2.黄瓜(cucumis sativus l.)是重要的经济作物，我国是世界上黄瓜栽培面积最大的国家。黄瓜起源于喜马拉雅山南麓的热带雨林地区，喜温暖但不耐寒冷，属典型的冷敏感型植物(安志信等，2006)。黄瓜发芽的适宜温度为15℃～35℃(wehner，1982；1984)；黄瓜生长的适宜温度为25～30℃/18～20℃(白天/夜间)(李会敏，2016)。但我国北方地区冬春季黄瓜栽培中普遍存在长期偏低温(＜20℃/8～12℃，白天/夜间)和短期临界低温(15℃/4～8℃，白天/夜间)的问题(王永健等，2005)。黄瓜各器官组织均对低温敏感(cabrera et al.，1992)，低温胁迫对黄瓜不同发育阶段都会产生不同程度的危害，如种子发芽迟缓、发芽率降低，苗期叶片边缘黄化、枯死和内卷，开花期受精率下降，结果期坐果率下降，化瓜、畸形瓜严重，贮藏和运输期果实易发生腐烂，品质下降等(郝敬虹等，2009；王红飞等，2016)，低温胁迫已成为制约黄瓜生产的重要逆境因素，研究黄瓜耐寒性状有助于推动抗逆育种。因此，挖掘黄瓜耐寒基因，培育耐寒品种成为当前育种家的主要任务。
3.关于控制黄瓜幼苗耐寒基因定位的相关研究，前人有少量报道。李恒松等(2015)以0839(黄瓜耐冷型品系)和b52(低温敏感型品系)为亲本，构建六世代群体，通过对f2群体集群分离分析(bsa)，将黄瓜幼苗耐冷主效位点定位于遗传图谱第6连锁群上，与分子标记ssr07248的遗传距离为32.6cm。王红飞(2014)以qt193(幼苗期低温敏感型)和jd32(幼苗耐寒型)为亲本，构建f2遗传群体，以75对分子标记构建连锁遗传图谱，共检测到4个与幼苗耐寒相关的位点，其中3个与冷害指数相关的位点(qct-3-1、qct-3-2、qct-3-3)位于3号染色体，1个与恢复指数相关的位点(qct-7-1)位于7号染色体。dong等(2019)以cg104(耐寒)和cg37(低温敏感)为亲本，构建f
2:3
家系，利用in silico bsa方法检测到csa6g445210(生长素响应因子)和csa6g445230(乙烯响应蛋白)为可能的候选基因。到目前为止，黄瓜幼苗耐寒基因(ltt)连锁的snp标记尚未见报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种黄瓜幼苗耐寒基因ltt紧密连锁的snp分子标记，能够用于黄瓜幼苗耐寒种质资源的鉴定与选育中。
5.本发明提供了一种黄瓜耐寒基因ltt紧密连锁的snp分子标记，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述seq id no：1的第45位碱基存在c/g多态性。
6.本发明提供了一种用于扩增所述snp分子标记的引物对，所述引物对包括核苷酸序列如seq id no：2所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：3所示的反向引物。
7.本发明提供了一种用于鉴定黄瓜幼苗耐寒性状的检测试剂盒，包括所述引物对。
8.优选的，还包括pcr扩增用试剂。
9.优选的，还包括hinfi酶切用试剂；
10.所述hinfi酶切用试剂为hinfi内切酶和cutsmart。
11.本发明提供了所述snp分子标记或所述检测试剂盒在耐寒黄瓜品种选育中的应用。
12.本发明提供了所述snp分子标记或所述检测试剂盒在鉴定或筛选耐寒黄瓜中的应用。
13.优选的，所述耐寒黄瓜的生长温度为不低于15℃。
14.本发明提供了一种筛选耐寒黄瓜品种的方法，包括以下步骤：
15.1)提取待测样品基因组dna；
16.2)以所述待测样品基因组dna为模板，以所述的引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
17.3)检测所述pcr扩增产物的第45位碱基，当碱基为c时，说明待测样品属于耐寒黄瓜品种，当碱基为g时，说明待测样品属于温度敏感黄瓜品种。
18.优选的，步骤3)中所述检测所述pcr扩增产物的第45位碱基的方法包括测序或hinfi酶切；
19.优选的，所述hinfi酶切的体系为pcr产物2μl，内切酶0.3μl，cutsmart 1μl，ddh2o 6.7μl；
20.优选的，所述hinfi酶切的温度为37℃，酶切时间为3h；
21.优选的，所述hinfi酶切后，当获得一条195bp的酶切片段时，45位碱基为c，说明待测样品为耐寒黄瓜品种；当获得一条236bp的片段时，45位碱基为g，说明待测样品属于温度敏感黄瓜品种。
22.本发明提供的黄瓜耐寒基因ltt紧密连锁的snp分子标记，结合黄瓜基因组序列数据和两亲本重测序数据，利用生物信息学结合遗传群体的表型鉴定，分析该定位区域内的snp，找到ltt-snp1，该snp在黄瓜亲本材料cg104(p1)基因组中，该位点碱基为c；在材料cg37(p2)基因组中，该碱基为g。本发明以黄瓜幼苗耐寒自交系cg104和低温敏感自交系cg37为材料开发snp标记，并以构建的f2代群体为试验材料进行验证，结果表明标记ltt-snp1在123份f2群体材料中有102份材料的带型与田间调查结果一致，正确率为83.0％；同时，利用68份自然群体材料的基因型数据与表型数据进行验证，其中34份低温敏感材料中有28份材料的带型与田间调查结果一致，结果表明标记ltt-snp1用于分子标记辅助选择在低温敏感材料的正确率为82.4％。本发明不仅为黄瓜幼苗耐寒基因ltt的分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育幼苗耐寒的黄瓜新品种提供了高效的途径。本发明基于开发的snp标记提供用于辅助筛选具有幼苗耐寒的黄瓜新品种的方法。通过本发明提供的snp分子标记，可以在黄瓜候选材料对其进行耐寒的筛选，具有高效、限制少、准确的优点。
附图说明
23.图1为snp标记ltt-snp1对黄瓜亲本材料cg104(p1)，cg37(p2)，f1世代单株的检测结果；p1：cg104(耐寒)；p2:cg37(低温敏感)；
24.图2为snp标记ltt-snp1对黄瓜f2群体的检测结果；
25.图3为snp标记ltt-snp1对黄瓜自然群体的检测结果。
具体实施方式
26.本发明提供了一种黄瓜耐寒基因ltt紧密连锁的snp分子标记，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no：1(agctgaggcaagggagatgggtcgggtggtccgcatgaaagaatntccttcattttctcctgataggagaccaggttctggaatgaagaatgatacaaatttctccaatgtttctatttcctctgtacctcattgtggagaaggctgtatttggagatcagatttgattgtaagttttggtgtatggtgcattcaccgtattctagatctctcacttatggaaagtcggcctgaac)所示，所述seq id no：1的第45位碱基存在c/g多态性。
27.本发明提供了一种用于扩增所述snp分子标记的引物对，所述引物对包括核苷酸序列如seq id no：2(agctgaggcaagggagatg)所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：3(gttcaggccgactttcca)所示的反向引物。
28.本发明提供了一种用于鉴定黄瓜幼苗耐寒性状的检测试剂盒，包括所述引物对。所述检测试剂盒还优选包括pcr扩增用试剂。本发明对所述pcr扩增用试剂的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的pcr扩增用试剂即可，例如扩增用mix液。
29.在本发明中，所述检测试剂盒优选还包括hinfi酶切用试剂。所述hinf i酶切用试剂为hinfi内切酶和cutsmart。所述hinfi酶切用试剂的作用是便于后需检测扩增pcr产物的snp位点。
30.基于snp分子标记与黄瓜耐寒基因ltt紧密连锁同时验证snp分子标记与黄瓜耐寒性状相关，因此本发明提供了所述snp分子标记或所述检测试剂盒在耐寒黄瓜品种选育中的应用。
31.本发明提供了所述snp分子标记或所述检测试剂盒在鉴定或筛选耐寒黄瓜中的应用。
32.在本发明中，所述耐寒黄瓜的生长温度优选为不低于15℃。我国北方地区冬春季黄瓜栽培中普遍存在长期偏低温15℃。因此，本发明实施例中，选择的耐寒黄瓜品种均为耐受15℃低温的品种。
33.本发明提供了一种筛选耐寒黄瓜品种的方法，包括以下步骤：
34.1)提取待测样品基因组dna；
35.2)以所述待测样品基因组dna为模板，以所述的引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
36.3)检测所述pcr扩增产物的第45位碱基，当碱基为c时，说明待测样品属于耐寒黄瓜品种，当碱基为g时，说明待测样品属于温度敏感黄瓜品种。
37.本发明对提取待测样品中基因组dna的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的植物基因组dna提取方法即可，例如ctab法或试剂盒法均可。
38.在本发明中，所述pcr扩增的反应体系为：7.5ng dna模板，正向引物和反向引物各50ng，5μl 2
×
3g taqmastermix forpage(red dye)，加双蒸水至10μl。所述pcr扩增的反应程序优选为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存。
39.在本发明中，所述检测所述pcr扩增产物的第45位碱基的方法优选包括测序或
hinfi酶切。本发明对所述测序的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的测序方法即可。在本发明实施例中，所述测序委托上海生工完成。hinfi酶切鉴定耐寒黄瓜品种的机理是在seq id no：1所述的序列上45位的碱基存在多态性位点，导致形成hinfi酶切位点(gaatct)，经hinfi酶切，得到一条195bp长的序列(seq id no：4，aatctccttcattttctcctgataggagaccaggttctggaatgaagaatgatacaaatttctccaatgtttctatttcctctgtacctcattgtggagaaggctgtatttggagatcagatttgattgtaagttttggtgtatggtgcattcaccgtattctagatctctcacttatggaaagtcggcctgaac)。而45位碱基为g时，hinf i酶无法识别该位点，无法实现酶切，pcr扩增产物为236bp。所述hinfi酶切的体系优选为pcr产物2μl，内切酶0.3μl，cutsmart 1μl，ddh2o 6.7μl。所述hinfi酶切的温度优选为37℃，酶切时间优选为3h。
40.在本发明中，所述hinfi酶切后，当获得一条195bp的酶切片段时，45位碱基优选为c，说明待测样品为耐寒黄瓜品种；当获得一条236bp的片段时，45位碱基优选为g，说明待测样品属于温度敏感黄瓜品种。
41.下面结合实施例对本发明提供的一种黄瓜幼苗耐寒基因ltt紧密连锁的snp分子标记及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
42.材料与方法
43.本发明所用的试验材料的亲本为cg104(p1)，cg37(p2)，及123份f2群体材料和68份自然群体材料。
44.cg104：生长势强，分枝中等，节间长度较长，叶片较大，茎粗壮，第一雌花节位为第4节，雌花节率为30％左右，瓜色深花绿，不亮，果粉轻，瓜长18.9cm，把长1.9cm，瓜粗4.1cm，心腔1.9cm，刺白稀，瘤大，微棱，少纹，为耐寒材料。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
45.cg37：生长势中等，分枝中等，节间长度中等，叶片较小，茎粗中等，第一雌花节位10节以上，雌花节率为17％左右，瓜色深绿，果粉较重，瓜长6.3cm，把长0.6cm，瓜粗3.7cm，心腔2.3cm，刺黑、较密，无瘤，无棱，无纹，为低温敏感材料。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
46.ltt-snp1标记引物是本实验室基于重测序的基因组信息、利用caps finder 2.0(http://helix.wustl.edu/caps/caps.html)网站和dnaman软件设计，并在北京生工公司合成。重测序的基因组信息详见qi等在《nature genetics》杂志2013年发表的论文《agenomic variation map provides insights into the genetic basis ofcucumber domestication and diversity》。
47.利用北京早春自然低温，分别于2017年和2018年在北京市昌平区南口镇中国农科院试验基地进行黄瓜幼苗低温处理。处理群体设置三个重复，每个重复种植8株，随机区组排列。期间正常管理，待幼苗培育至一叶一心时，分别置于不加温温室和塑料大棚内，处理期间用温度卡片记录环境温度。通过开关风口及加盖棚膜、棉被的方式控制平均温度在15℃左右，处理持续两周左右，待群体第一片真叶与子叶的黄化程度出现明显差异时，进行表型调查。根据黄化程度不同，共分为六个低温伤害等级：0级，子叶与第一片真叶均为深绿色。1级，子叶发生轻微黄化，呈浅绿色。3级，子叶呈黄绿色，边缘变黄。真叶呈浅绿色。5级，子叶大部分呈黄色。第一片真叶呈黄绿色。7级，子叶全部黄色，第一片真叶黄绿色。9级，子叶与真叶均出现干枯。根据以下公式i进行低温伤害指数的计算(dong et al.,2019)。
48.苗期低温伤害指数(low-temperature injury index)＝[(0
×
s0+1
×
s1+3
×
s3+5
×
s5+7
×
s7+9
×
s9)/n
×
9]
×
100,(s
0-s9：各分级对应植株数，n：总株数)。
[0049]
主要试剂
[0050]
pcr实验使用vazyme公司的2
×
3g taqmastermix forpage(red dye)；酶切使用cutsmart的限制性内切酶hinfi；凝胶电泳使用北京酷来搏科技有限公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6％后使用。测序在北京生工公司进行。
[0051]
在前期研究中我们利用初定位和in silico bulked segregantanalysis精细定位的方法，将黄瓜幼苗耐寒基因定位于6号染色体42.0kb的区间内，并预测基因csa6g44510和csa6g44530。基于以上结果，开展了本实验。
[0052]
实施例1
[0053]
黄瓜幼苗耐寒基因连锁的snp标记的获得
[0054]
结合黄瓜基因组序列的数据和两亲本重测序数据，利用生物信息学结合遗传群体的表型鉴定，分析定位该区域内的snp，找到ltt-snp1，发现该snp(位于6号染色体，物理位置为20,813,718)在黄瓜亲本材料cg104(p1)基因组中，该位点碱基为c；在材料cg37(p2)基因组中，该碱基为g。
[0055]
基于获得的与黄瓜幼苗耐寒基因连锁的snp分子标记ltt-snp1，开发与黄瓜幼苗耐寒基因连锁的caps标记(命名为ltt-snp1)。其中正向和反向引物分别为：
[0056]
ltt-snp1-f：gacagaagttctgggaatt(seq id no:2)；
[0057]
ltt-snp1-r：cctggatactgtgatgttgg(seq id no:3)。
[0058]
由于上述所得snp的关系(snp＝c/g)，当碱基c存在时，形成内切酶hinfi的识别序列(g
↓
aatc，
↓
为酶切位点)，扩增片段可以被内切酶hinfi切开；当碱基g存在时，不能形成内切酶识别序列，扩增片段无法被内切酶hinfi切开。
[0059]
通过上述引物(ltt-snp1-f/ltt-snp1-r)对双亲材料进行pcr扩增，并结合内切酶hinfi对扩增片段进行酶切，获得特异性条带，其中在材料cg104(耐寒)中，获得一个195bp的条带，在材料cg37(低温敏感)中，获得一个236bp的条带。
[0060]
具体操作方法：
[0061]
步骤1.dna提取和pcr扩增
[0062]
取黄瓜植株的嫩叶，用改良的ctab(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本cg104(p1)，cg37(p2)及f1、f2和自然群体各单株的基因组dna。
[0063]
caps标记pcr反应体系为：总反应体系10μl，1μl dna(10.0ngμl-1)，正向和反向引物(50ngμl-1)各1μl，5μl 2
×
3g taq mastermix for page(red dye)(vazyme公司产品)。
[0064]
pcr扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存。
[0065]
步骤2.hinfi完全酶切pcr产物
[0066]
酶切体系为：pcr产物2μl，内切酶0.3μl，cutsmart:1μl，双蒸水6.7μl，酶切温度为37℃，酶切时间为3h。
[0067]
步骤3.结果判定
[0068]
方法一：跳过步骤2，不经过酶切，将pcr产物直接测序。cg104(耐寒)所得序列在第45位碱基为c；cg37(低温敏感)所得序列在45位碱基为g；f1所得序列该位置有两种碱基，c
和g同时存在。
[0069]
方法二：经过内切酶完全酶切，酶切产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5
×
tbe，150v恒功率电泳分离90min，电泳后银染显色，统计带型。
[0070]
cg104(耐寒)得到一个为195bp的片段，条带带型记为a；cg37(低温敏感)得到一个236bp的片段条带带型记为b；f1中两个条带同时检测到，条带带型记为h(见图1)。
[0071]
实施例2
[0072]
ltt基因侧翼标记的验证
[0073]
利用cg104和cg37为亲本构建的123份f2群体和68份自然群体材料，对实施例1获得的与ltt基因连锁的标记ltt-snp1进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性：经和所选材料的田间表型相比，标记在123份f2群体材料中有102份材料带型反映的表型数据与田间调查结果一致，正确率为83.0％(表1)，扩增条带见图2。
[0074]
根据68份自然群体材料的表型数据，其中34份低温敏感材料中有28份材料的带型反映的表型数据与田间调查结果一致，在低温敏感材料的正确率为82.4％(表2)，扩增条带见图3。
[0075]
表1 f2群体的表型与基因型数据
[0076]
[0077][0078]
(续表1)
[0079]
[0080][0081]
表2自然群体的表型与基因型数据
[0082]
[0083]
[0084][0085]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。