一种lncrim基因的检测试剂盒及其应用
(一)技术领域
1.本发明涉及一种检测lncrim核酸表达水平的试剂盒及其应用。
(二)

背景技术：

2.铁是人体中必需微量元素，机体每天从食物中摄取大概1-2mg的铁离子维持基本的生理代谢平衡。机体中铁缺乏会引起遗传性缺铁性贫血症，而铁离子过多则与多种癌症(如结肠癌、直肠癌、肝癌、乳腺癌等)的发生发展密切相关。
3.细胞内铁离子含量检测通常以calcein-am试剂盒、铁离子探针等方式进行。calcein-am试剂盒可以通过量化的手段准确地反映细胞内铁离子水平，但其所需的巨大的时间与人力成本进行细胞计数且步骤繁琐为研究人员带来了诸多不便；铁离子探针较前者略显简便，但相对而言使用成本较高。优化检测方法已然成为实时监控细胞生长状态的当务之急，一种高效、便捷、准确的细胞生长状态检测手段将为研究人员进行细胞生物学研究提供强有力的支持。
4.分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，在基因定位、基因克隆、基因库构建和遗传育种等方面广泛应用。相比于其他几种遗传标记方法，分子标记具有具高灵敏度、高特异性、可量化的优点。随着分子生物学技术的发展，分子标记的用途逐渐被广泛接受。因此，筛选合适的分子标记物对检测细胞内铁离子含量具有重要的意义。
5.lncrim(long non-coding rna related to iron metabolism)，是一个在人体基因组内稳定表达的基因，其通过信号通路调控细胞内铁离子代谢水平，lncrim的表达量与细胞内铁离子含量具有明显的正相关。以样品rna为模板，选择lncrim检测引物与内参引物进行rt-qpcr反应，按照2
δδcq
计算相对丰度，该数值反映了实验细胞或组织中lncrim的转录活跃水平，即可判断细胞铁离子水平。
6.基于上述理论，本发明开发了一个lncrim基因检测试剂盒，
(三)

技术实现要素：

7.本发明提供一种lncrim基因的检测试剂盒及其应用，该试剂盒内包含了两对lncrim表达水平检测引物，一对b2m内参引物。该试剂盒可用于所培养细胞系铁离子水平检测，具有高特异性，稳定性，灵敏性的特征，具有极大的潜在应用价值。只需少量病例样本，按照所提供的方法进行检测，即可对机体内铁离子含量做出检测进而对铁代谢异常诊断特别是临床乳腺癌的发生及预后效果诊断提供依据。该试剂盒为乳腺癌的术前精确诊断、预后准确评估乳腺癌的转移提供了新的高灵敏，高特异性的分子检测标志，具有很高临床应用价值。
8.本发明采用的技术方案是：
9.本发明提供一种lncrim基因检测试剂盒，所述试剂盒包括lncrim基因的检测引物和内参引物；所述检测引物为lncrim f#1/lncrim r#1、lncrim f#2/lncrim r#2中的一组
或两组；
10.所述检测引物：
11.lncrim f#1:5
’‑
ctcaaacttcactagccccgt-3’；
12.lncrim r#1:5
’‑
gaatgggatgggaggacaca-3’；
13.lncrim f#2:5
’‑
tcaaacttcactagccccgt-3’；
14.lncrim r#2:5
’‑
agtgaggagaatgggatggga-3’；
15.内参引物gapdh f：5
’‑
atggggaaggtgaaggtcg-3’；b2m r：5
’‑
ggggtcattgatggcaacaata-3’。
16.进一步，所述试剂盒还包括实时荧光定量pcr反应液，所述反应液优选itaq
tm universal sybr green supermix(bio-rad)。
17.进一步，所述试剂盒包括样品rna提取试剂，优选trizol(ambion)试剂盒。
18.进一步，所述试剂盒包括逆转录试剂，优选iscript
tm
gdna clear cdna synthesis kit(bio-rad)试剂盒。
19.本发明所述试剂盒由样品rna提取试剂、rna逆转录试剂、检测引物、内参引物和pcr反应液组成。
20.本发明还提供一种所述lncrim基因检测试剂盒在检测lncrim基因表达量中的应用，所述应用为：提取待测样品rna，逆转录为cdna，在检测引物和内参引物作用下，于pcr反应液中进行荧光定量pcr检测，若cq值大于正常对照，则lncrim基因低表达。
21.进一步，所述荧光定量pcr反应条件为94℃预变性2min，94℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共40个循环。
22.本发明还提供一种所述lncrim基因检测试剂盒在检测铁离子含量中的应用，所述应用是采用所述试剂盒检测样本中lncrim基因表达量，所述lncrim基因相对表达量与铁离子含量成正相关，若lncrim基因高表达，则铁离子含量高。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种lncrim基因检测试剂盒，灵敏性好，简单易操作，在科学实验中具有良好的适应性和实用性。本试剂盒提供2对检测引物同时使用，相比传统只使用1对检测引物大大减少结果的随机性，更具统计学意义，结果更加准确可靠；试剂盒内的检测引物具有很高的灵敏度，仅需少量样本即可完成筛查；本试剂盒可用于细胞铁代谢的监测，结果客观有效，可将细胞铁代谢水平转化为量化指标，便于统计研究。
(四)附图说明
24.图1为lncrim检测引物、内参引物的溶解曲线，a代表内参引物gapdh，b代表检测引物lncrim#1，c代表检测引物lncrim#2。
25.图2为野生型hek293t细胞和lncrim敲低细胞株中lncrim相对表达量柱形图。
26.图3为野生型hek293t细胞和lncrim过表达的hek293t细胞的铁离子荧光强度柱形图。
27.图4为不同铁离子刺激下hek293t细胞中lncrim的相对表达量柱形图。
28.图5为乳腺癌肿瘤组织和正常组织中lncrim的相对表达量。
29.(五)具体实施方法
30.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
31.实施例1、lncrim核酸转录本检测引物的选取与质量鉴定
32.lncrim核酸转录本mrna序列的ncbi数据库编码nr_034137.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nr_034137.1)，基于该序列，寻找具有合适tm值(60左右)及低自互补的序列作为检测引物，基于溶解曲线单峰、tm值位置以及拷贝数筛选得到两对检测引物。
33.两对检测引物：
34.lncrim f#1:5
’‑
ctcaaacttcactagccccgt-3’；
35.lncrim r#1:5
’‑
gaatgggatgggaggacaca-3’。
36.lncrim f#2:5
’‑
tcaaacttcactagccccgt-3’；
37.lncrim r#2:5
’‑
agtgaggagaatgggatggga-3’。
38.内参引物gapdh f：5
’‑
atggggaaggtgaaggtcg-3’；b2m r：5
’‑
ggggtcattgatggcaacaata-3’。
39.将该引物于ncbi blast检测(完全匹配时，total score大约在80左右，如果totalscore特别高，则说明该引物可能在这个序列上有多处匹配，重复性高，并不是好的引物；设计的目的基因，query coverage必须是100％；针对同种属的其他的基因，则query coverage越低越好)验证，没有非特异的靶向基因，引物溶解曲线质检结果如图1。结果显示，本发明提供的两对lncrim检测引物均检测有效，溶解曲线呈特异性单峰，证明扩增片段单一，可以特异性、高灵敏地用于检测lncrim基因表达情况。
40.实施例2、本试剂盒提供的引物对lncrim表达水平检测的灵敏度验证
41.试剂盒组成：检测引物、内参引物、pcr反应液、rna提取试剂、逆转录试剂。
42.利用t4 dna连接酶构建lncrim rna特异性敲低的hek293t细胞株(sh#1ctgctttctgaagttattatt及sh#2ggaagcaattgttctcaaact)。使用野生型hek293t细胞株为对照组，lncrimrna水平特异性敲低的hek293t细胞株(1#及2#两株)为实验组，每份样品处理方法如下：每组分别取适量(约100万个)细胞，加入到盛有1mltrizol试剂的1.5ml离心管中，充分混匀，之后依照trizol试剂盒(ambion)说明提取rna；使用nanodrop(thermo)按a260法将rna定量后，取等量rna按照iscript
tm
gdna clear cdna synthesis kit商品试剂盒(bio-rad)说明逆转录为cdna；使用实施例1筛选的两对引物(1#株选用#1引物，2#株选用#2引物)及内参引物(gapdh)，按照itaq
tm universal sybr green supermix(bio-rad)商品试剂盒说明，对此cdna模板进行荧光定量pcr检测，根据cq值计算2
δδcq
，获得lncrim的rna相对丰度，即表征lncrim基因的表达活跃水平。
43.荧光定量pcr的条件为：94℃预变性2min，94℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共40个循环，然后计算熔解曲线。将所有样品进行lncrim表达水平检测，分别以两对检测引物的检测效果为重复，以gapdh基因作为内参，统计分析后，绘制成表，结果如图2。将对照组细胞与两lncrim敲低细胞株分别对比分析，敲低细胞株中lncrim表达水平下调显著(**p《0.01)，统计误差(sd，标准差)小，检测结果符合预期。该实施例显示由本试剂盒提供的引物检测法对lncrim基因转录水平检测灵敏准确，误差小，效果好，可以用于细胞lncrim水平的准确特异性检测。
44.实施例3、lncrim表达水平与细胞内铁离子水平具有显著正相关性
45.使用plvx-sfb载体，利用同源重组方法构建lncrimrna过表达的hek293t细胞株，表达水平较正常hek293t细胞中的表达上调3倍，使用hek293t的野生型为对照组，lncrim过表达细胞株为实验组，进行细胞铁离子实验检测，具体如下：
46.各组细胞接种至含10％胎牛血清的dmem培养基，于37℃，5％co2培养36h-48h，使用血细胞计数板计数细胞。细胞均匀铺在加有含10％胎牛血清的dmem培养基的optiplate
tm-96孔板中，每一个实验孔接种50000个细胞，每组设置3次重复实验，每孔加入calcein-am试剂至终浓度为0.15μm，在37℃、5％co2培养箱孵育30min，注意避光。然后用pbs洗3次，去除多余的calcein-am试剂，用酶标仪在490nm测定数值，结果见图3。若细胞内铁离子水平高，则数值较小，反之则较大。结果显示，过表达lncrim的细胞株细胞内铁离子水平明显升高，证明了lncrim表达水平确实与细胞铁离子水平具有显著正相关性，lncrim检测指标越高，细胞内铁离子含量越高，显示出lncrim作为细胞铁代谢水平监测指标的可行性。
47.实施例4、lncrim相对表达量表征细胞铁代谢水平
48.将hek293t细胞1500个各自均匀铺于添加有2ml细胞培养液(即含10％胎牛血清dmem培养基)的6孔细胞培养板中，于37℃，5％co2培养12小时待细胞完全贴壁正常生长时，吸去细胞培养液。各孔分别加入2ml不含铁离子的细胞培养液继续培养12h。随后各孔分别加入pbs配置的100mm浓度的柠檬酸铁胺(fac))母液至终浓度分别为为0、100、200、400和500μm，继续培养24h。之后弃去培养液，收取细胞，按实施例2中方法，分别提取各组细胞的rna，并同时使用本试剂盒提供的两对lncrim核酸引物及gapdh内参引物进行rna提取、逆转录-荧光定量pcr(rt-qpcr)检测，根据cq值计算各组lncrim的相对丰度。结果(图4)显示随着铁离子刺激lncrim的丰度随时间进展梯度上调，但是当铁离子浓度超出生理最大承受浓度时，lncrim的丰度又下调。相对于对照组都呈现统计学显著差异(t-test分析，**p《0.01，)。该结果呈现出lncrim表达水平与细胞铁代谢呈显著正相关性，显示出了本细胞活力检测试剂盒良好的检测灵敏度，并且不仅能检出细胞内铁离子水平，也能反映出细胞生长水平能力。
49.实施例5、本试剂盒提供的lncrim核酸引物对组织中细胞铁代谢和生长的检测
50.收集中山大学肿瘤防治中心(sysucc)的乳腺癌临床组织样本48例和正常组织样本36例，样本收集均征得患者的知情同意。每份样品处理方法如下：分别剪取适量肿瘤组织与正常组织部分，分别置于研钵中，加入适量液氮迅速冰冻组织块，再研成粉末，用液氮预冷的药匙取100mg粉末加入到盛有1mltrizol试剂的1.5ml离心管中，充分混匀，之后依照实施例2中所述方法，同时使用实施例1筛选的两对引物(1#～2#)及内参引物(u6)，分别对各样本进行rt-qpcr检测，根据cq值获得lncrim的rna含量，即lncrim表达水平。
51.统计分析结果如图5。癌组织因其恶性增殖特性，通常相比正常组织具有更强的细胞生长活力。将癌旁组织lncrim的rna丰度与癌组织对比分析，结果显示癌细胞中lncrim是显著上调的，且二者差异显著(t-test，**p《0.01)，这与癌组织的细胞活力更强的事实吻合进一步证明了本试剂盒检测的准确性和广泛适用性。该实施例显示由本试剂盒提供的lncrim指标检测法不仅可以检测体外培养的细胞铁离子水平，还可以检测活体组织中细胞铁代谢水平，并以此来检测说明细胞生长能力，适用性广泛。
52.应当注意的是，以上实验列举的仅仅是本发明的若干具体实例，显然，本发明还有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明保护范围。