一种用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型研究的3d打印浓度梯度芯片
技术领域
1.本发明涉及医药和工程技术领域，特别是一种用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型研究的3d打印浓度梯度芯片。


背景技术：

2.胰岛素抵抗（insulin resistance, ir）是指机体靶组织对正常剂量胰岛素产生低于正常生物学效应的一种病理生理状态，主要发生在肝脏及外周组织，是导致ii 型糖尿病、代谢综合征、高血压病、肥胖、动脉粥样硬化等常见临床疾病发生的共同病理生理基础。ir主要表现为胰岛素敏感性降低，外周组织葡萄糖利用率下降，肝脏组织不能有效抑制糖异生和糖原分解。饮食结构、生活习惯、遗传和环境因素均可造成胰岛素抵抗。通常，研究人员通过建立动物模型或者二维界面细胞模型来研究ir的发病机制并筛选治疗ir的有效药物。但是，动物与人类在生理生化和解剖结构上存在差异，且动物模型有着周期长、造价高的缺点；传统的二维培养细胞模型在缺乏三维微环境的二维界面生长仅能保存部分原有生物化学性质，如细胞表型、代谢及基因表达，不能模拟相对真实的生物学或生理学发生的环境。而三维细胞培养体系是简单的二维培养模型和复杂而昂贵的动物模型的折中选择，它可提供细胞-细胞和细胞-细胞外基质动态相互作用的类体内微环境，允许氧、代谢物和蛋白因子等浓度梯度的发生，又兼具周期短，成本相对较低的特点，为构建合适的ir体外模型研究胰岛素抵抗发病机制和降糖药物的作用机制提供了新的方向。
3.微流控芯片可在微米或纳米级别的通道内实现微纳流体的精确操控，通过精心设计微通道网络，调节入口样品流速和流量，以分子扩散主导的方式经多次分流、汇流形成预定浓度梯度，又被叫做微流控梯度发生器。微流控梯度发生器因其高通量、低消耗、小体积等优势被广泛应用于分析化学、生物学、材料科学等领域，尤其在生物学方面展现出得天独厚的优势。首先，微加工技术的进步使通道几何结构的不断微型化成为可能，物质运输时间更贴近生理范围，提供了具有生理意义的时间尺度和空间尺度。其次，微流控芯片可将多个模块设计集成到同一操作平台中，同时实现梯度的发生和细胞的三维培养，使细胞的生长状态和药物的作用模式更接近生物体内的情况，改变了体外研究中控制细胞微环境的方法。尽管拥有巨大的开发潜能，巨大而昂贵的外加驱动泵使其仅能应用于实验室，无法实现商业化的批量生产。液体运输的动力问题，成为困扰微流控梯度发生器走出实验室的一大阻碍。
4.在此研究基础上，本工作利用3d打印技术快速成型、微流控平台易集成和纸纤维依靠毛细作用运输液体的特点，构建了3d打印浓度梯度芯片用于胰岛素抵抗hepg2三维细胞模型的建立与高通量药物的筛选。酶联免疫吸附实验测得的细胞葡萄糖摄取率显示，细胞在3.334
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10-6 μmol
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胰岛素作用下，经24 h后葡萄糖消耗率约降为正常对照组的一半；吡格列酮干预后，胰岛素抵抗细胞模型的胰岛素敏感性有所改善。


技术实现要素：

5.1.本发明的目的是提供一种用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型研究的3d打印浓度梯度芯片。
6.本发明的目的是这样实现的，一种用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型研究的3d打印浓度梯度芯片，其特征在于，以3d打印技术获得树形分支结构的芯片模型，以羧甲基纤维素钠（cmcna）溶液为粘合剂，以α-纤维素为纸基基质，构建开放式浓度梯度微流控芯片。
7.所述的一种用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型研究的3d打印浓度梯度芯片，其特征在于，开放式浓度梯度微流控芯片的芯片主体结构为树形分枝通道与圆形储液池，每一行的圆形储液池可用于细胞三维培养；树形分枝通道中的所有单元通道以水平或/和竖直排布，每一单元通道宽1000 μm，深500 μm，长0.8 cm；圆形贮液池直径为0.8 cm，深度为500 μm；在树形分枝通道顶部的单元通道上连接有圆柱形进样口，圆柱形进样口直径为1 cm，高度为1 cm；在单元通道和圆形储液池表面均匀涂布厚度为500 μm的cmcna-α-纤维素胶状液体，干燥后可形成具有传输作用的纸基介质。
8.所述的一种用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型研究的3d打印浓度梯度芯片，其特征在于，开放式浓度梯度微流控芯片中以3d打印所得模型通道为基础，利用纸基纤维的毛细作用实现物质的分流、混合以及浓度梯度的分布。
9.本发明上述的3d打印浓度梯度芯片用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗量的研究，包括如下步骤：（1）开放式浓度梯度微流控芯片上细胞的三维培养：取对数生长期细胞消化，计数，稀释至4
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105/ml，再加同体积水凝胶溶液稀释至2
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105/ml，以每孔30 μl细胞悬液接种到开放式浓度梯度微流控芯片的圆形储液池中，在37 ℃、5wt % co2的培养箱中静置培养；（2）胰岛素和吡格列酮的干预：细胞培养24 h后吸出培养基，分别在每个开放式浓度梯度微流控芯片的第一进样口加入浓度为1
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10-5
和1
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10-7 μmol
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的胰岛素溶液，第二进样口加入正常的细胞培养液，与细胞共培养24 h后，每孔吸取10 μl细胞培养液用于elisa实验；细胞培养24 h后吸出培养基，同样在开放式浓度梯度微流控芯片的第一进样口加入终浓度为1
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10-4 μmol
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的吡格列酮溶液，第二进样口加入正常的细胞培养液，吡格列酮与细胞共培养6 h，弃去含吡格列酮的细胞培养液，在圆形储液池中加入浓度为9.095
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10-6 μmol
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的胰岛素溶液，24 h后每孔吸取10 μl细胞培养液用于elisa实验；（3）细胞葡萄糖摄取率的测定：经吡格列酮和胰岛素干预后，采用商业化的elisa试剂盒测定培养液中剩余葡萄糖的含量，同时测定空白对照组和正常对照组培养液中葡萄糖含量，计算细胞葡萄糖摄取率变化。
10.2.本发明的另一目的是提供一种开放式浓度梯度芯片，以树形分支结构的芯片模型为基础，在通道内部修饰cmcna-α-纤维素自制纸基介质，利用纤维的毛细作用实现物质的分流、混合和浓度梯度分布。
11.3.本发明的第三个目的是在所述的开放式浓度梯度芯片上建立胰岛素抵抗体外三维细胞模型和吡格列酮干预胰岛素抵抗的细胞模型。
12.4.本发明解决的技术方案是，具体包括如下步骤 ：（1）浓度梯度芯片上细胞的三维培养取对数生长期细胞消化，计数，稀释至4
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105/ml，再加同体积水凝胶溶液稀释至2
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105/ml，以每孔30 μl细胞悬液接种到浓度梯度芯片的圆形细胞培养池中，在37 ℃、5 % co2的培养箱中静置培养。
13.（2）胰岛素和吡格列酮的干预细胞培养24 h后吸出培养基，分别在每个芯片的第一进样口1加入浓度为1
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10-5
和1
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10-7 μmol
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的胰岛素溶液，与细胞共培养24 h后，每孔吸取10 μl细胞培养液用于elisa实验；细胞培养24 h后吸出培养基，在芯片的第二进样口2加入终浓度为1
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10-4 μmol
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的吡格列酮溶液，吡格列酮与细胞共培养6 h，弃去含吡格列酮的细胞培养液，在圆形细胞培养池中加入浓度为9.095
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的胰岛素溶液，24 h后每孔吸取10 μl细胞培养液用于elisa实验。
14.（3）细胞葡萄糖摄取率的测定经吡格列酮和胰岛素干预后，采用商业化的elisa试剂盒测定培养液中剩余葡萄糖的含量，同时测定空白对照组和正常对照组培养液中葡萄糖含量，计算细胞葡萄糖摄取率变化。
15.本发明的有益效果：本章利用α-纤维素的毛细作用实现流体的扩散运输，摆脱传统微流控梯度发生器需要外部动力的困扰，同时将梯度发生器和细胞三维培养区域集成到同一芯片平台，实现高通量、可重复、低试剂消耗的药物筛选实验操作。
附图说明
16.图1为本发明一种用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型研究的3d打印浓度梯度芯片结构图（图中：1：进样口1；2：进样口2；3：流通通道；4：细胞培养池）。
17.图2为本发明一种用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型研究的3d打印浓度梯度芯片中浓度梯度芯片的测试图，图中：a为比色表征图；b为灰度分布图。
18.图3为本发明一种用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型研究的3d打印浓度梯度芯片中hepg2细胞-水凝胶共聚焦三维重构图，图中：a为琼脂糖凝胶图；b为hepg2细胞分布图；c为琼脂糖凝胶-hepg2细胞融合图。
19.图4为本发明一种用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型研究的3d打印浓度梯度芯片中hepg2细胞经胰岛素干预后的葡萄糖消耗水平考察图。
20.图5为本发明一种用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型研究的3d打印浓度梯度芯片中hepg2胰岛抵抗体外细胞模型经吡格列酮干预后的葡萄糖消耗水平图。
具体实施方式
21.为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及效果更加清晰，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。本发明中的第一和第二仅作为区别用途，不作为顺序关系。
22.如图1所示，本发明所述的一种用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型研究的3d打印浓度梯度芯片结构图：3d打印浓度梯度芯片（本发明也称开放式浓度梯度微流控芯片）的芯片主体结构为树形分枝通道与圆形储液池，每一行的圆形储液池可用于细胞三维培养；树形分枝通道中的所有单元通道以水平或/和竖直排布，每一单元通道宽1000 μm，深
500 μm，长0.8 cm；圆形贮液池直径为0.8 cm，深度为500 μm；在树形分枝通道顶部的单元通道上连接有圆柱形进样口，圆柱形进样口直径为1 cm，高度为1 cm；在单元通道和圆形储液池表面均匀涂布厚度为500 μm的cmcna-α-纤维素胶状液体，干燥后可形成具有传输作用的纸基介质；取对数生长期的细胞消化，计数，稀释至4
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105/ml，再加同体积水凝胶溶液稀释至2
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105/ml，以每孔30 μl细胞悬液接种到浓度梯度芯片（本发明也称开放式浓度梯度微流控芯片，简称芯片）的细胞培养池（本发明也称圆形储液池）4中，在37 ℃、5 % co2的培养箱中静置培养。分别在芯片的第一进样口1和第二进样口2加入细胞培养基和含药物的条件培养基，通过流通通道（本发明也称单元通道）3中纤维的毛细作用运输到细胞培养池（本发明也称圆形储液池）4，实现对药物的浓度梯度分布。
23.实施例1： 将蓝色墨水原液稀释200倍，在芯片的第一进样口1注入1 ml蓝色墨水稀释液，同时在第二进样口2注入1 ml去离子水，两侧压力保持平衡，完全依靠毛细作用进行溶液的混合传输，待形成稳定的比色梯度后用imagej分析处理颜色强度的变化。
24.如图2中的a所示，整个芯片的颜色梯度非常明显，最终出口处，从左至右蓝色依次变浅，最右端为无色，确证了浓度梯度的产生；由于α-纤维素粉的表面形态比较有序，芯片显色均匀，无明显咖啡圈反应。经imagej处理得到图2中的b，相对灰度值的变化与芯片颜色变化相一致，数字化的呈现方式更有利于直观的计算芯片出口处直接对应的特定浓度。
25.实施例2：一种用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型研究的3d打印浓度梯度芯片中细胞培养方法如下：取对数生长期的细胞消化，计数，稀释至4
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105/ml，再加同体积水凝胶溶液稀释至2
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105/ml，以每孔30 μl细胞悬液接种到浓度梯度芯片的圆形细胞培养池4中，在37 ℃、5 % co2的培养箱中静置培养。
26.如图3所示，为细胞在水凝胶中培养的共聚焦三维表征重构图，可观察到绿色荧光蛋白标记的hepg2细胞悬浮于水凝胶介质中间，细胞和细胞之间可充分接触，且可通过水凝胶向远处细胞传递信号分子，细胞生存空间呈指数型增长，为多层培养方式；细胞在水平方向分布均匀，细胞极化变小，突触变短，像是“镶嵌”在水凝胶之中一样，但是细胞的生命活力很强盛，足以说明水凝胶可以提供生物相容性的仿体内微环境用于细胞增殖。
27.实施例3：一种用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型研究的3d打印浓度梯度芯片中胰岛素抵抗细胞模型的建立方法如下：取对数生长期细胞消化，计数，稀释至4
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105/ml，再加同体积水凝胶溶液稀释至2
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105/ml，以每孔30 μl细胞悬液接种到浓度梯度芯片的圆形的细胞培养池4中。细胞培养24 h后吸出培养基，分别在每个芯片的第一进样口1加入浓度为1
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10-5
和1
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10-7 μmol
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的胰岛素溶液。胰岛素与细胞共培养24 h后，每孔吸取10 μl细胞培养液用于elisa实验，检测葡萄糖消耗率。
28.如图4所示，在胰岛素作用下，细胞消耗葡萄糖的水平下降，且呈剂量依赖的方式，随着胰岛素作用浓度增加，细胞摄取葡萄糖的水平越来越低，即细胞的胰岛素敏感性越来越低。水凝胶三维支架可以模拟复杂的肝脏周围微环境，小分子物质如氨基酸、葡萄糖、生
长因子、药物等在基质支架中以更接近生理微环境的浓度梯度存在，水凝胶的机械性质和生物化学性质成为细胞-细胞和细胞-水凝胶之间相互作用不可预估的变量，促进了细胞异质性发展，引导细胞对刺激的多样化反应，更接近体内真实的胰岛素抵抗发生发展情况。
29.实施例4：一种用于吡格列酮改善hepg2胰岛素抵抗模型研究的3d打印浓度梯度芯片中吡格列酮改善胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖摄取率的干预方法如下：取对数生长期细胞消化，计数，稀释至4
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105/ml，再加同体积水凝胶溶液稀释至2
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105/ml，以每孔30 μl细胞悬液接种到浓度梯度芯片的圆形培养池中。细胞培养24 h后吸出培养基，在芯片的第一进样口1加入终浓度为1
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的吡格列酮溶液，吡格列酮与细胞共培养6 h，弃去含吡格列酮的细胞培养液，在圆形细胞培养池中加入浓度为9.095
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的胰岛素溶液，24 h后每孔吸取10 μl细胞培养液用于elisa实验，检测葡萄糖消耗率。
30.如图5所示，在三维培养条件下，吡格列酮作用后明显提高了细胞葡萄糖消耗率，改善了细胞对胰岛素的敏感性。细胞对不同浓度的吡格列酮产生不同的响应水平，吡格列酮浓度越高越有利于改善细胞对胰岛素的敏感性，细胞消耗的葡萄糖越多。三维水凝胶支架培养条件下hepg2细胞更有利于保持原生理状态，1
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的吡格列酮干预下，细胞的葡萄糖摄取率提高了约20 %。