稳定地保持外源基因的人工重组rna病毒的制作方法
技术领域
1.本发明涉及一种稳定地保持外源基因的人工重组rna病毒的制作方法。


背景技术：

2.属于呼肠孤病毒科的轮状病毒可引发婴幼儿的急性胃肠炎，每年约有20万人因感染轮状病毒而死亡。在轮状病毒方面，人工制作任意病毒的技术开发落后，然而最近本技术的发明人成功开发出了实用的轮状病毒的人工合成方法(专利文献1、非专利文献1)。通过该技术，能够自由制作具有任意突变的人工重组轮状病毒、或带有外源基因的人工重组轮状病毒。然后，本技术的发明人发现，在导入了外源基因的人工重组轮状病毒中，全长的外源基因会在短期内消失，即难以长期稳定地保持或表达外源基因，在经过反复研究后发表了用于稳定地保持或表达外源基因的一些改良方法的报告(非专利文献2)。
3.在异源宿主中表达外源基因时，出于提高外源基因的表达的目的，从很久以前开始就一直采用使外源基因的密码子组成接近于宿主基因的密码子组成的密码子优化技术(非专利文献3)，并提供了大量的密码子优化软件。然而，密码子优化技术能否应用于稳定地保持导入于人工重组rna病毒中的外源基因是未知的。现有技术文献专利文献
4.专利文献1：国际公开wo2018/062199非专利文献
5.非专利文献1：kanai et al.,proc natl acad sci usa.2017feb 28；114(9):2349-2354非专利文献2：kanai et al.,journal of virology,2019feb 5；93(4).pii:e01774-18非专利文献3：gustafsson et al.,trends biotechnol.2004jul；22(7):346-353


技术实现要素：

本发明要解决的技术问题
6.本发明的技术问题在于提供一种稳定地保持外源基因的人工重组rna病毒的制作方法及稳定地保持导入于人工重组rna病毒的外源基因的方法。解决技术问题的技术手段
7.为了解决上述技术问题，本发明包括以下各个发明。[1]一种稳定地保持外源基因的人工重组rna病毒的制作方法，其特征在于，包括：(1)获取外源基因的工序，所述外源基因具有以近似于rna病毒基因的密码子组成的方式发生了改变的密码子组成；(2)将在(1)中获取的外源基因插入到rna病毒的基因组中的工序；及，(3)使用反向遗传学方法人工合成人工重组rna病毒的工序。
[2]根据所述[1]所述的方法，其中，rna病毒为属于呼肠孤病毒科的病毒。[3]根据所述[2]所述的方法，其中，属于呼肠孤病毒科的病毒为属于轮状病毒属或正呼肠孤病毒属的病毒。[4]根据所述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，在工序(1)中，获取具有改变至rna病毒基因的密码子组成
±
30％的范围内的密码子组成的外源基因。[5]一种稳定地保持导入到使用反向遗传学方法人工合成的人工重组rna病毒中的外源基因的方法，其特征在于，使外源基因的密码子组成近似于rna病毒基因的密码子组成。[6]根据所述[5]所述的方法，其中，rna病毒为属于呼肠孤病毒科的病毒。[7]根据所述[6]所述的方法，其中，属于呼肠孤病毒科的病毒为属于轮状病毒属或正呼肠孤病毒属的病毒。[8]根据所述[5]～[7]中任一项所述的方法，其中，使外源基因的密码子组成在rna病毒基因的密码子组成
±
30％的范围内与rna病毒基因的密码子组成近似。发明效果
[0008]
根据本发明，能够提供一种长期稳定地保持外源基因的人工重组rna病毒。
附图说明
[0009]
图1为示出猴轮状病毒sa11株的nsp1基因(rv nsp1基因)、荧光素酶基因(nluc基因)及密码子改变荧光素酶基因(rv-nluc基因)的各氨基酸密码子的组成的图。图2为示出荧光素酶基因(nluc基因)的碱基序列(seq id no:12)及密码子改变荧光素酶基因(rv-nluc基因)的碱基序列(seq id no:13)的图。图3为示出插入了荧光素酶基因(nluc基因)的猴轮状病毒sa11株的nsp1基因及插入了密码子改变荧光素酶基因(rv-nluc基因)的猴轮状病毒sa11株的nsp1基因的结构的图。图4为示出对具有荧光素酶基因(nluc基因)的人工重组轮状病毒及具有密码子改变荧光素酶基因(rv-nluc基因)的人工重组轮状病毒进行10次传代培养并研究外源基因的稳定性而得到的结果的图。图5为示出猴轮状病毒sa11株的nsp1基因(rv nsp1基因)、绿色荧光蛋白基因(zsg基因)及密码子改变绿色荧光蛋白基因(rv-zsg基因)的各氨基酸密码子的组成的图。图6为示出绿色荧光蛋白基因(zsg基因)的碱基序列(seq id no:14)及密码子改变绿色荧光蛋白基因(rv-zsg基因)的碱基序列(seq id no:15)的图。图7为示出插入了绿色荧光蛋白基因(zsg基因)的猴轮状病毒sa11株的nsp1基因及插入了密码子改变绿色荧光蛋白基因(rv-zsg基因)的猴轮状病毒sa11株的nsp1基因的结构的图。图8为对具有绿色荧光蛋白基因(zsg基因)的人工重组轮状病毒及具有密码子改变绿色荧光蛋白基因(rv-zsg基因)的人工重组轮状病毒进行10次传代培养并研究外源基因的稳定性而得到的结果的图。图9为示出猴轮状病毒sa11株的nsp1基因(rv nsp1基因)、红色荧光蛋白基因(asr基因)及密码子改变红色荧光蛋白基因(rv-asr基因)的各氨基酸密码子的组成的图。
图10为示出红色荧光蛋白基因(asr基因)的碱基序列(seq id no:16)及密码子改变红色荧光蛋白基因(rv-asr基因)的碱基序列(seq id no:17)的图。图11为示出插入了红色荧光蛋白基因(asr基因)的猴轮状病毒sa11株的nsp1基因及插入了密码子改变红色荧光蛋白基因(rv-asr基因)的猴轮状病毒sa11株的nsp1基因的结构的图。图12为示出对具有红色荧光蛋白基因(asr基因)的人工重组轮状病毒及具有密码子改变绿色荧光蛋白基因(rv-zsg基因)的人工重组轮状病毒进行10次传代培养并研究外源基因的稳定性而得到的结果的图。图13为示出在荧光显微镜下观察具有绿色荧光蛋白基因(zsg基因)的人工重组轮状病毒及具有密码子改变绿色荧光蛋白基因(rv-zsg基因)的人工重组轮状病毒的绿色荧光蛋白表达量而得到的结果的图。图14为示出以蛋白质印迹法(western blotting)对具有绿色荧光蛋白基因(zsg基因)的人工重组轮状病毒及具有密码子改变绿色荧光蛋白基因(rv-zsg基因)的人工重组轮状病毒的绿色荧光蛋白表达量进行定量而得到的结果的图。图15为示出对具有绿色荧光蛋白基因(zsg基因)的人工重组轮状病毒及具有密码子改变绿色荧光蛋白基因(rv-zsg基因)的人工重组轮状病毒的增殖能力进行比较而得到的结果的图。图16为示出在荧光显微镜下观察具有红色荧光蛋白基因(asr基因)的人工重组轮状病毒及具有密码子改变红色荧光蛋白基因(rv-asr基因)的人工重组轮状病毒的红色荧光蛋白表达量而得到的结果的图。图17为示出对具有荧光素酶基因(nluc基因)的人工重组轮状病毒及具有密码子改变荧光素酶基因(rv-nluc基因)的人工重组轮状病毒的荧光素酶活性进行测定而得到的结果的图。图18为示出猴轮状病毒sa11株的野生型nsp1基因、插入了密码子改变萤火虫荧光素酶基因(rv-akaluc基因)的猴轮状病毒sa11株的nsp1基因及插入了密码子改变诺如病毒vp1基因(rv-nov vp1基因)的猴轮状病毒sa11株的nsp1基因的结构的图。图19为示出对具有密码子改变萤火虫荧光素酶基因(rv-akaluc基因)的人工重组轮状病毒进行10次传代培养并研究外源基因的稳定性而得到的结果的图。图20为示出对具有密码子改变诺如病毒vp1基因(rv-nov vp1基因)的人工重组轮状病毒进行10次传代培养并研究外源基因的稳定性而得到的结果的图。图21为示出插入了绿色荧光蛋白基因(zsg基因)的蝙蝠呼肠孤病毒的s1基因及插入了密码子改变绿色荧光蛋白基因(rv-zsg基因)的蝙蝠呼肠孤病毒的s1基因的结构的图。图22为示出具有密码子改变绿色荧光蛋白基因(rv-zsg基因)的人工重组蝙蝠呼肠孤病毒感染细胞的相差显微镜观察结果(左)及荧光显微镜观察结果(右)的图。图23为示出哺乳类呼肠孤病毒t1l型的l1基因(mrv l1基因)、绿色荧光蛋白基因(zsg基因)及密码子改变绿色荧光蛋白基因(mrv-zsg基因)的各氨基酸密码子的组成的图。图24为示出插入了绿色荧光蛋白基因(zsg基因)或密码子改变绿色荧光蛋白基因(mrv-zsg基因)的哺乳类呼肠孤病毒的l1基因的结构的图。图25为示出对具有绿色荧光蛋白基因(zsg基因)或密码子改变绿色荧光蛋白基因
(mrv-zsg基因)的人工重组哺乳类呼肠孤病毒感染细胞进行使用了mrv特异性抗体的免疫染色并在荧光显微镜下观察病毒感染细胞中的绿色荧光蛋白(zsg)的表达而得到的结果的图，其中，上段为具有zsg基因的哺乳类呼肠孤病毒感染细胞、下段为具有mrv-zsg基因的哺乳类呼肠孤病毒感染细胞，左侧为使用了mrv特异性抗体的免疫染色的观察图像、中间为绿色荧光蛋白表达细胞的观察图像、右侧为二者的合成图像。图26为示出对具有绿色荧光蛋白基因(zsg基因)的人工重组哺乳类呼肠孤病毒及具有密码子改变绿色荧光蛋白基因(mrv-zsg基因)的人工重组哺乳类呼肠孤病毒进行1～3次传代培养并研究外源基因的稳定性而得到的结果的图。
具体实施方式
[0010]
本发明提供一种稳定地保持外源基因的人工重组rna病毒的制作方法(以下记作“本发明的制作方法”)。本发明的制作方法包括以下的工序(1)、(2)及(3)即可：(1)获取外源基因的工序，所述外源基因具有以近似于rna病毒基因的密码子组成的方式发生了改变的密码子组成；(2)将在(1)中获取的外源基因插入到rna病毒的基因组中的工序；(3)使用反向遗传学方法获取人工重组rna病毒的工序。
[0011]
rna病毒可以为双链rna病毒，也可以为正链单链rna病毒，还可以为负链单链rna病毒。作为双链rna病毒，可列举出属于呼肠孤病毒科、双核糖核酸病毒科(birnaviridae)的病毒。作为正链单链rna病毒，可列举出属于冠状病毒科、小核糖核酸病毒科、披膜病毒科、黄病毒科、杯状病毒科、星状病毒科等的病毒。作为负链单链rna病毒，可列举出属于副粘液病毒科、弹状病毒科、纤丝病毒科、正粘病毒科、砂粒病毒科、布尼亚病毒科等的病毒。
[0012]
rna病毒可以为属于呼肠孤病毒科的病毒。属于呼肠孤病毒科的病毒为基因组中具有分为10～12个节段的直链双链rna的病毒，其病毒粒子显示直径为60～80nm的正二十面体结构。属于呼肠孤病毒科的病毒中包括：哺乳类正呼肠孤病毒(也称为哺乳类呼肠孤病毒)、纳尔逊海湾正呼肠孤病毒(也称为纳尔逊海湾呼肠孤病毒或蝙蝠呼肠孤病毒)、禽呼肠孤病毒等正呼肠孤病毒属(genus orthoreovirus)；非洲马瘟病毒、蓝舌病毒等环状病毒属(genus orbivirus)；轮状病毒等轮状病毒属(genus rotavirus)；科罗拉多蜱热病毒等colti病毒属(genus coltivirus)；水生呼肠孤病毒a等水生呼肠孤病毒属(genus aquareovirus)；质型多角体病毒等质型多角体病毒属(genus cypovirus)；南方水稻黑条矮缩病毒等斐济病毒属(genus fijivirus)；水稻矮缩病毒等植物呼肠孤病毒属(genus phytoreovirus)及水稻齿叶矮缩病毒(rice ragged stunt virus)等水稻病毒属(genus oryzavirus)。属于呼肠孤病毒科的病毒可以是属于轮状病毒属的病毒，也可以是属于正呼肠孤病毒属的病毒。
[0013]
外源基因没有特别限定。外源基因可以为动物的基因，可以为植物的基因，可以为菌类的基因，可以为细菌的基因，也可以为病毒的基因。外源基因的碱基长度没有特别限定，可以为10bp以上，可以为100bp以上，可以为500bp以上，可以为1000bp以上，可以为1500bp以上，可以为2000bp以上，可以为3000bp以上，可以为4000bp以上，也可以为5000bp以上。外源基因的碱基长度可以为500bp以下，可以为1000bp以下，可以为1500bp以下，可以为2000bp以下，可以为3000bp以下，可以为4000bp以下，也可以为5000bp以下。
[0014]
由外源基因编码的蛋白质没有特别限定。由外源基因编码的蛋白质可以为疫苗抗原。作为疫苗抗原，例如可列举出诺如病毒抗原、腺病毒抗原、a型肝炎抗原、札幌病毒抗原、手足口病病毒抗原、肠病毒抗原、hiv抗原、沙门氏菌抗原、弯曲杆菌抗原、副溶血性弧菌抗原、大肠杆菌o157抗原、霍乱孤菌抗原、肠伤寒杆菌抗原、痢疾杆菌抗原等。这些疫苗抗原也可以为表位肽。
[0015]
在工序(1)中，获取具有以近似于rna病毒基因的密码子组成的方式而发生了改变的密码子组成的外源基因。作为标准的rna病毒基因的密码子组成，可以为通过嵌合改变了密码子的外源基因而人工合成的rna病毒的基因的密码子组成，也可以为与通过嵌合改变了密码子的外源基因而人工合成的rna病毒不同的rna病毒的基因的密码子组成。在以不同的rna病毒的基因的密码子组成作为标准时，不同的rna病毒优选为与通过嵌合改变了密码子的外源基因而人工合成的rna病毒在系统上近似的rna病毒(例如，属于同科的病毒、属于同属的病毒、不同种的病毒等)。
[0016]
此外，作为标准的rna病毒基因的密码子组成，可以为作为标准的rna病毒的全基因的密码子组成，也可以为作为标准的rna病毒的部分基因的密码子组成。在以rna病毒的部分基因的密码子组成作为标准时，可以将一个基因的密码子组成作为标准，也可以将两个以上的基因的密码子组成作为标准。
[0017]
作为标准的rna病毒基因的密码子组成能够根据登录在公知的基因数据库(例如genbank等)中的rna病毒的基因信息而制作。
[0018]
表1示出轮状病毒sa11株的全基因的基因组组成。表2示出轮状病毒sa11株的nsp1基因的基因组组成。表3示出蝙蝠呼肠孤病毒(pteropine orthoreovirus)mb株的全基因的基因组组成。表4示出哺乳类呼肠孤病毒t1l型的全基因的基因组组成。能够将表1～4所示出的密码子组成用作本发明的制作方法中的标准密码子组成。其中能够使用属于呼肠孤病毒科的病毒、特别是属于轮状病毒属及正呼肠孤病毒属的人工重组病毒，并将其用作使外源基因表达时的标准密码子组成。
[0019]
[表1]轮状病毒sa11株全基因的基因组组成(％)
[0020]
[表2]轮状病毒sa11株nsp1基因的基因组组成
[0021]
[表3]蝙蝠呼肠孤病毒mb株全基因的基因组组成
[0022]
[表4]哺乳类呼肠孤病毒t1l型全基因的基因组组成
[0023]
使外源基因的密码子组成与作为标准的rna病毒基因的密码子组成近似是指，在不使外源基因的氨基酸发生突变的前提下，将对应于相同氨基酸的密码子变更为作为标准的rna病毒基因中出现频率高的密码子。与作为标准的rna病毒基因的密码子组成的近似程度，只要为能够实现稳定地保持外源基因这一目的的程度即可，没有特别限定。例如，可以将外源基因的密码子组成改变至作为标准的rna病毒基因的密码子组成
±
35％的范围内，可以将外源基因的密码子组成改变至作为标准的rna病毒基因的密码子组成
±
30％的范围内，可以将外源基因的密码子组成改变至作为标准的rna病毒基因的密码子组成
±
25％的范围内，可以将外源基因的密码子组成改变至作为标准的rna病毒基因的密码子组成
±
20％的范围内，可以将外源基因的密码子组成改变至作为标准的rna病毒基因的密码子组成
±
15％的范围内，也可以将外源基因的密码子组成改变至作为标准的rna病毒基因的密码子组成
±
10％的范围内。
[0024]
对于改变了密码子组成的外源基因，能够根据改变后的碱基序列通过dna合成而获取。此外，还能够使用以pcr为基础的定点突变法在现有的外源基因dna中导入突变而获取。
[0025]
在工序(2)中，将在(1)中获取的外源基因插入到rna病毒的基因组中。关于外源基因的插入位置，只要不妨碍使用反向遗传学方法而人工合成人工重组rna病毒，则没有特别限定。例如，将外源基因导入人工重组轮状病毒中时，可以插入到nsp1基因中，也可以插入到nsp3基因中，还可以插入到nsp5基因中。例如，将外源基因导入人工重组哺乳类呼肠孤病毒中时，可以插入到l1基因中，也可以插入到s1、s2、s4基因中。例如，将外源基因导入人工重组流感病毒中时，可以插入到ns1基因中，也可以插入到na基因中，还可以插入到pa基因中。例如，将外源基因导入阿尔法病毒属(辛德毕斯病毒、基孔肯雅病毒等)的人工重组病毒
birnavirus genome are infectious.proceedings of the national academy of sciences of the united states of america93(20):11131-11136.6.kolykhalov aa,et al.(1997)transmission of hepatitis c by intrahepatic inoculation with transcribed rna.science 277(5325):570-574.7.neumann g,et al.(1999)generation of influenza a viruses entirely from cloned cdnas.proceedings of the national academy of sciences of the united states of america 96(16):9345-9350.8.yount b,curtis km,&baric rs(2000)strategy for systematic assembly of large rna and dna genomes:transmissible gastroenteritis virus model.journal of virology 74(22):10600-10611.9.olchkov ve,et al.(2001)recovery of infectious ebola virus from complementary dna:rnaediting of the gp gene and viral cytotoxicity.science 291(5510):1965-1969.10.schneider u,schwemmle m,&staeheli p(2005)genome trimming:a unique strategy for replication control employed by borna disease virus.proceedings of the national academy of sciences of the united states of america 102(9):3441-3446.11.sanchez ab&de la torre jc(2006)rescue of the prototypic arenavirus lcmv entirely from plasmid.virology 350(2):370-380.12.kobayashi t,et al.(2007)a plasmid-based reverse genetics system for animal double-stranded rna viruses.cell host&microbe 1(2):147-157.13.lai cj,zhao bt,hori h,&bray m(1991)infectious rna transcribed from stably cloned full-length cdna of dengue type 4virus.proceedings of the national academy of sciences of the united states of america 88(12):5139-5143.14.chaudhry y,skinner ma,&goodfellow ig(2007)recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing t7 rna polymerase.the journal of general virology 88(pt8):2091-2100.15.yun si,kim sy,rice cm,&lee ym(2003)development and application of a reverse genetics system for japanese encephalitis virus.journal of virology 77(11):6450-6465.16.boyce m,celma cc,&roy p(2008)development of reverse genetics systems for bluetongue virus:recovery of infectious virus from synthetic rna transcripts.journal of virology 82(17):8339-8348.17.adachi a,et al.(1986)production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.journal of virology 59(2):284-291.
[0028]
根据本发明的制作方法而制作的人工重组rna病毒能够长期稳定地保持外源基
因，并能够长期稳定地表达外源基因产物，因此若使用例如疫苗抗原作为外源基因，则能够适宜地用作病毒疫苗。此外，还能够通过以(被认为是)由基因异常导致的消化道的遗传病(大肠癌、溃疡性结肠炎、克罗恩病、乳糜泄、非特异性多发性小肠溃疡等)为对象、以正常基因为外源基因并直达异常细胞而应用于基因治疗。
[0029]
本发明提供一种稳定地保持导入到使用反向遗传学方法人工合成的人工重组rna病毒中的外源基因的方法(以下，记作“本发明的稳定保持方法”)。本发明的稳定保持方法是特征为使外源基因的密码子组成近似于rna病毒基因的密码子组成的方法。关于使外源基因的密码子组成近似于作为标准的rna病毒基因的密码子组成的方法，能够通过与在上述本发明的制作方法中进行了说明的方法相同的方法来实施。实施例
[0030]
以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于这些实施例。
[0031]
[实施例1：表达荧光素酶的人工重组轮状病毒]1-1材料及方法(1)病毒使用了猴轮状病毒sa11株。本技术的发明人确定了该病毒株的11个分节段rna基因组各自的碱基序列，并对其进行了登录。将本实验中所使用的猴轮状病毒sa11株(以下称作“sa11株”)的11个分节段rna基因组各自的名称及genbank登录号示于表5。
[0032]
[表5]猴轮状病毒sa11株的分节段基因组序列基因组片段编码蛋白genbank登录号seq id n0片段1vp1(rna依赖性rna聚合酶)lc1785641片段2vp2(rna结合蛋白)lc1785652片段3vp3(鸟苷酸转移酶)lc1785663片段4vp4(血凝素、刺突蛋白)lc1785674片段5nsp1(免疫抑制因子)lc1785705片段6vp6(内衣壳)lc1785686片段7nsp3(翻译促进因子)lc1785727片段8nsp2(ntpase)lc1785718片段9vp7(外衣壳)lc1785699片段10nsp4(肠毒素)lc17857310片段11nsp5(rna合成辅助)lc17857411
[0033]
(2)包含sa11株的各分节段rna基因组表达盒的质粒(分节段rna基因组表达载体)为了制作人工重组轮状病毒而制作了包含sa11株的11个分节段rna基因组的cdna的质粒。将从病毒中提取的双链rna作为模板，使用基于各分节段rna基因组的碱基序列的特异性引物进行rt-pcr。将所得到的rt-pcr产物(各分节段rna基因组的cdna)插入到p3e5质粒的t7启动子序列与hdv核酶序列之间，从而得到包含各分节段rna基因组的表达盒的质粒(参照专利文献1)。各分节段rna基因组的表达盒具有在各分节段rna基因组的cdna的5’侧与t7启动子序列邻接、在3’侧与d型肝炎病毒(hdv)核酶序列邻接，且在其下游配置有t7终止序列的结构。将所制作的质粒(分节段rna基因组表达载体)分别称为pt7-vp1sa11、
pt7-vp2sa11、pt7-vp3sa11、pt7-vp4sa11、pt7-vp6sa11、pt7-vp7sa11、pt7-nsp1sa11、pt7-nsp2sa11、pt7-nsp3sa11、pt7-nsp4sa11及pt7-nsp5sa11。
[0034]
(3)荧光素酶基因作为荧光素酶基因，使用了作为来自细角刺虾(oplophorus gracilirostris)的荧光素酶基因的nluc基因。pnl1.1.tk[nluc/tk]载体(promega，genbank登录号：km359774，3817bp)的815位～1330位(seq id no:12)为nluc编码区域。
[0035]
(4)改变了密码子组成的荧光素酶基因对nluc基因的密码子组成及轮状病毒sa11株的nsp1基因(以下称作“rv nsp1基因”)的密码子组成进行考察，根据所得到的这两个基因的密码子组成，以接近于rv nsp1基因的密码子组成的方式改变nluc基因的密码子组成。将所得到的改变nluc基因称作“rv-nluc基因”。
[0036]
在图1的(a)～(u)中示出了rv nsp1基因、nluc基因及rv-nluc基因中的各氨基酸的密码子组成。此外，在图2中分别示出了nluc基因的碱基序列(seq id no:12)与rv-nluc基因的碱基序列(seq id no:13)。对于rv-nluc基因，在nluc基因的全长516个碱基中，70个碱基发生了改变。原始的nluc基因的gc含量为53％，而rv-nluc基因的gc含量降低至40％，其接近于rv nsp1基因的gc含量(31％)(参照表6)。
[0037]
[表6]
[0038]
(5)fast蛋白表达载体fast蛋白表达载体通过将纳尔逊海湾呼肠孤病毒p10基因(参照genbank登录号：ab908284)的蛋白质编码区域dna插入到pcaggs质粒(5699bp，matsuo et al.,2006,biochem biophys res commun 340(1):200-208)的bglii切割位点而制作(参照专利文献1)。将所得到的纳尔逊海湾呼肠孤病毒p10表达载体称为pcag-p10。
[0039]
(6)加帽酶表达载体加帽酶表达载体通过将牛痘病毒d1r基因的蛋白质编码区域dna(genbank登录号：nc006998的93948位～96482位)及牛痘病毒d12l基因的蛋白质编码区域dna(genbank登录号：nc006998的107332位～108195位)分别插入到上述pcaggs质粒的bglii切割位点而制作(参照专利文献1)。将所得到的牛痘病毒mrna加帽酶大亚基表达载体称为pcag-d1r，将牛痘病毒mrna加帽酶小亚基表达载体称为pcag-d12l。
[0040]
(7)sa11株的nsp2蛋白表达载体nsp2蛋白表达载体通过将sa11株nsp2基因的蛋白质编码区域dna(genbank登录号：lc178571的47位～1000位)插入到上述pcaggs质粒的bglii切割位点而制作(参照专利文献1)。将所得到的sa11株nsp2蛋白表达载体称为pcag-nsp2。
[0041]
(8)sa11株的nsp5蛋白表达载体nsp5蛋白表达载体通过将sa11株nsp5基因的蛋白质编码区域dna(genbank登录号：lc178574的22位～618位)插入到上述pcaggs质粒的bglii切割位点而制作(参照专利文
献1)。将所得到的sa11株nsp5蛋白表达载体称为pcag-nsp5。
[0042]
(9)荧光素酶表达人工重组轮状病毒的制作利用pcr分别对nluc基因及rv-nluc基因进行扩增，将扩增产物插入到pt7-nsp1sa11的nsp1基因(seq id no:5)的128位与129位之间，从而制作nluc基因插入nsp1基因表达质粒(称为pt7-nsp1sa11-nluc)及rv-nluc基因表达质粒(称为pt7-nsp1sa11-rv-nluc)(参照图3)。
[0043]
在荧光素酶表达人工重组轮状病毒的制作中，使用了下述11种质粒：自上述(2)中制作的11种包含分节段rna基因组的cdna的质粒中除去pt7-nsp1sa11的10种质粒、及上述pt7-nsp1sa11-nluc或pt7-nsp1sa11-rv-nluc。
[0044]
在实施转染的前一天，将bhk-t7/p5细胞以8
×
105个/孔接种于6孔培养板。使用转染试剂(transit-lt1(商品名称)、mirus)，将各0.8μg的11种分节段rna基因组表达载体、0.015μg的fast蛋白表达载体(pcag-p10)、各0.8μg的加帽酶表达载体(pcag-d1r及pcag-d12l)、nsp2蛋白表达载体(pcag-nsp2)、nsp5蛋白表达载体(pcag-nsp5)导入到bhk-t7/p5细胞中。对于每1μg的dna使用了2μg的转染试剂。使用含有5％的fbs、100单位/ml的青霉素及100μg/ml的链霉素的dmem培养基，在37℃、5％co2环境下，对bhk-t7/p5细胞进行培养。在进行转染的48小时后回收培养基及细胞。对回收的培养基及细胞进行3次冻融从而制备细胞裂解液，对猴ma104细胞(atcc crl-2378.1)进行传代培养。具体而言，在0.5μg/ml的胰蛋白酶的存在下，向12孔板中处于汇合(confluent)状态的ma104细胞中添加约0.5ml所述细胞裂解液。ma104细胞的培养中使用了不含fbs的dmem培养基。传代后培养7天，在此期间内确认到细胞变性时判断为制成了人工重组病毒。将此时所得到的病毒称为p1(passage 1(第1次传代))病毒。将使用包含pt7-nsp1sa11-nluc的11种质粒而制作的人工重组轮状病毒称为“rssa11-nluc”，将使用包含pt7-nsp1sa11-rv-nluc的11种质粒而制作的人工重组轮状病毒称为“rssa11-rv-nluc”。
[0045]
(10)通过电泳对荧光素酶基因进行确认为了考察rssa11-nluc及rssa11-rv-nluc传代后的nluc基因及rv-nluc基因的稳定性，在ma104细胞中将rssa11-nluc及rssa11-rv-nluc反复传代至p10。在12孔板中准备呈汇合状态的ma104细胞，在病毒感染前去除培养基，并置换为1ml含有0.5μg/ml的胰蛋白酶的不含fbs的dmem。分别向准备好的ma104细胞中添加1μl的rssa11-nluc及rssa11-rv-nluc的p1病毒并在37℃下培养5天。在培养5天后经2次冻融从而得到p2病毒。对于各转基因病毒，分别在5个孔中进行传代。
[0046]
反复进行传代至p10，从而得到rssa11-nluc的p10病毒克隆1～5及rssa11-rv-nluc的p10病毒克隆1～5。从所得到的各p10病毒的各克隆中提取病毒基因组rna，将其连同从p1病毒及野生型sa11病毒中得到的病毒基因组rna一起供于sds-page。
[0047]
1-2结果将结果示于图4。在rssa11-nluc p1病毒的病毒基因组rna中，确认到了nsp1-nluc基因，但在rssa11-nluc p10病毒的克隆1～5的病毒基因组rna中确认到了长的nsp1-nluc基因消失、可观察到发生短小突变的nsp1-nluc基因的克隆。另一方面，在rssa11-rv-nluc中，p1病毒及p10病毒的克隆1～5均仅确认到了长的nsp1-rv-nluc基因。对在rssa11-nluc p10病毒中确认到的短的突变nsp1-nluc基因进行测序分析时发现，nluc基因的大部分发生
了缺失。该结果表示，与nluc基因相比，rv-nluc基因在人工重组轮状病毒中得到更稳定的保持。
[0048]
[实施例2：表达绿色荧光蛋白的人工重组轮状病毒]2-1材料及方法作为绿色荧光蛋白基因，使用了包含于pzsgreen1-n1载体(clontech)中的zsgreen基因(以下称为“zsg基因”)。将zsg基因的碱基序列示于seq id no:14。考察了zsg基因的密码子组成及rv nsp1基因的密码子组成，根据所得到的这两个基因的密码子组成，以近似于rv nsp1基因的密码子组成的方式改变zsg基因的密码子组成。将所得到的改变zsg基因称为“rv-zsg基因”。
[0049]
在图5的(a)～(u)中示出了rv nsp1基因、zsg基因及rv-zsg基因中的各氨基酸的密码子组成。此外，在图6中分别示出了zsg基因的碱基序列(seq id no:14)与rv-zsg基因的碱基序列(seq id no:15)。对于rv-zsg基因，zsg基因的全长696个碱基中203个碱基发生了改变。原始的zsg基因的gc含量为63％，而rv-zsg基因的gc含量降低至38％，其接近于rv nsp1基因的gc含量(31％)(参照表7)。
[0050]
[表7]
[0051]
除了使用zsg基因及rv-zsg基因来代替nluc基因及rv-nluc基因以外，以与实施例1相同的方法进行实验。即，将利用pcr而扩增的zsg基因及rv-zsg基因分别插入到pt7-nsp1sa11的nsp1基因(seq id no:5)的128位与129位之间，从而制作zsg基因插入nsp1基因表达质粒(称为pt7-nsp1sa11-zsg)及rv-zsg基因表达质粒(称为pt7-nsp1sa11-rv-zsg)(参照图7)，以与实施例1相同的方法制作了表达绿色荧光蛋白的人工重组轮状病毒。将使用包含pt7-nsp1sa11-zsg的11种质粒而制作的人工重组轮状病毒称为“rssa11-zsg”，将使用包含pt7-nsp1sa11-rv-zsg的11种质粒而制作的人工重组轮状病毒称为“rssa11-rv-zsg”。将所得到的rssa11-zsg及rssa11-rv-zsg分别传代至p10后提取病毒基因组rna，供于sds-page。
[0052]
2-2结果将结果示于图8。与实施例1的结果相同，在rssa11-zsg p10病毒的克隆1～5的病毒基因组rna中，观察到了发生短小突变的nsp1-zsg基因。另一方面，在rssa11-rv-zsg中，即使经过10次传代后也未确认到发生短小突变的基因。另外，由于nsp1-zsg基因及nsp1-rv-zsg基因(2306bp)的大小与vp4基因(2362bp)相近，因此无法通过电泳判别。
[0053]
[实施例3：表达红色荧光蛋白的人工重组轮状病毒]3-1材料及方法作为红色荧光蛋白基因，使用了包含于pasred2-n1载体(clontech)中的asred基因(以下称为“asr基因”)。将zsg基因的碱基序列示于seq id no:16。考察了asr基因的密码子组成及rv nsp1基因的密码子组成，根据所得到的这两个基因的密码子组成，以近似于rv nsp1基因的密码子组成的方式改变asr基因的密码子组成。将所得到的改变asr基因称为“rv-asr基因”。
[0054]
在图9的(a)～(u)中示出了rv nsp1基因、asr基因及rv-asr基因中的各氨基酸的密码子组成。此外，在图10中分别示出了asr基因的碱基序列(seq id no:16)与rv-asr基因的碱基序列(seq id no:17)。对于rv-asr基因，在asr基因的全长699个碱基中，198个碱基发生了改变。原始的asr基因的gc含量为65％，而rv-asr基因的gc含量降低至40％，其接近于rv nsp1基因的gc含量(31％)(参照表8)。
[0055]
[表8]
[0056]
除了使用asr基因及rv-asr基因来代替nluc基因及rv-nluc基因以外，以与实施例1相同的方法进行实验。即，将利用pcr扩增的asr基因及rv-asr基因分别插入到pt7-nsp1sa11的nsp1基因(seq id no:5)的128位与129位之间，从而制作了asr基因插入nsp1基因表达质粒(称为pt7-nsp1sa11-asr)及rv-asr基因表达质粒(称为pt7-nsp1sa11-rv-asr)(参照图11)，以与实施例1相同的方法制作了表达红色荧光蛋白的人工重组轮状病毒。将使用包含pt7-nsp1sa11-asr的11种质粒而制作的人工重组轮状病毒称为“rssa11-asr”，将使用包含pt7-nsp1sa11-rv-asr的11种质粒而制作的人工重组轮状病毒称为“rssa11-rv-asr”。将所得到的rssa11-asr及rssa11-rv-asr分别传代至p10后提取病毒基因组rna，供于sds-page。
[0057]
3-2结果将结果示于图12。与实施例1及2的结果相同，在rssa11-asr p10病毒的克隆1～5的病毒基因组rna中，观察到了发生了短小突变的nsp1-asr基因。另一方面，在rssa11-rv-asr中，即使经过10次传代后也未确认到发生短小突变的基因。另外，由于nsp1-asr基因及nsp1-rv-asr基因(2309bp)的大小与vp4基因(2362bp)相近，因此无法通过电泳判别。
[0058]
[实施例4：来自改变外源基因的蛋白质的表达量]4-1材料及方法使用在实施例2中制作的表达绿色荧光蛋白的rssa11-zsg与rssa11-rv-zsg、以及野生型sa11。在12孔板中准备呈汇合状态的ma104细胞，以moi(multiplicity of infection，感染复数)为0.5pfu/cells的方式感染各病毒，在荧光显微镜下观察感染后经过24小时的zsg及rv-zsg的表达，并通过蛋白质印迹法进行定量。另行在12孔板中准备呈汇合状态的ma104细胞，以moi：0.01pfu/cells的方式感染各病毒，并以含有0.5μg/ml的胰蛋白酶的不含fbs的dmem进行培养。在感染24小时后，对细胞进行2次冻融，测定细胞破碎液中的病毒滴度。
[0059]
4-2结果将荧光显微镜的观察图像示于图13、将蛋白质印迹法的结果示于图14、将病毒滴度的测定结果示于图15。利用荧光显微镜，将曝光时间设为100ms及400ms而观察基于zsg及rv-zsg的绿色荧光时发现，与zsg相比，rv-zsg的发光更强(图13)。此外通过使用了zsg蛋白特异性抗体的蛋白质印迹法，确认到了rv-zsg的强烈表达(图14)。另一方面，rssa11-zsg与
rssa11-rv-zsg的增殖能力为相同程度(图15)，因此表示zsg与rv-zsg的表达量的差异与病毒的增殖能力无关。
[0060]
[参考例1：来自改变外源基因的蛋白质的表达量]使用了在实施例3中制作的表达红色荧光蛋白的rssa11-asr及rssa11-rv-asr。以与实施例4相同的方式，在12孔板中准备呈汇合状态的ma104细胞，以moi(multiplicity of infection)为0.5pfu/cells的方式感染各病毒，在荧光显微镜下观察感染后经过24小时的asr及rv-asr的表达。
[0061]
将结果示于图16。利用荧光显微镜(nikon)，将曝光时间设为400ms、800ms及1.5秒而观察基于asr及rv-asr的红色荧光时，未见差异。即，表示asr与rv-asr的表达量没有差异。
[0062]
[参考例2：来自改变外源基因的蛋白质的表达量]使用在实施例1中制作的表达荧光素酶的rssa11-nluc与rssa11-rv-nluc、以及野生型sa11。在12孔板中准备呈汇合状态的ma104细胞，以moi(multiplicity of infection)为0.1pfu/cells的方式感染各病毒，将感染后经过24小时的nluc及rv-nluc的表达作为荧光素酶活性(发光强度)进行定量。
[0063]
将结果示于图17。rssa11-nluc与rssa11-rv-nluc的荧光素酶活性没有差异。即，表示nluc与rv-nluc的表达量没有差异。
[0064]
[实施例5：表达碱基长度为1.6kbp的外源基因的人工重组轮状病毒]尝试制作表达具有长为1kbp以上的碱基长度的外源基因的人工重组轮状病毒。5-1材料及方法(1)外源基因作为外源基因，使用以接近于rv nsp1基因的密码子组成的方式改变作为萤火虫荧光素酶(fluc)基因的改变体的akaluc基因(genbank登录号：lc320664，1653bp)而成的改变akaluc基因(以下称为“rv-akaluc基因”)、及以接近于rv nsp1基因的密码子组成的方式改变诺如病毒vp1基因(genbank登录号：km268107，1623bp)的密码子组成而成的改变诺如病毒vp1基因(以下称为“rv-nov vp1基因”)。将改变akaluc基因的碱基序列示于seq id no:18，将改变诺如病毒vp1基因的碱基序列示于seq id no:19。
[0065]
(2)外源基因插入nsp1表达质粒的制作将利用pcr扩增的rv-akaluc基因及rv-nov vp1基因分别插入到pt7-nsp1sa11的nsp1基因(seq id no:5)的128位与129位之间。进一步，按照kanai等人的方法(非专利文献2)，在nsp1基因上增加722bp的缺失，制作rv-akaluc基因插入nsp1基因表达质粒(称为pt7-nsp1sa11-rv-akaluc)及rv-nov vp1基因插入nsp1基因表达质粒(称为pt7-nsp1sa11-rv-nov vp1)(参照图18)。
[0066]
(3)人工重组病毒的制作及外源基因保持的确认以与实施例1相同的方法，制作表达rv-akaluc的人工重组轮状病毒及表达rv-nov vp1的人工重组轮状病毒。将使用包含pt7-nsp1sa11-rv-akaluc的11种质粒而制作的人工重组轮状病毒称为“rssa11-rv-akaluc”，将使用包含pt7-nsp1sa11-rv-nov vp1的11种质粒而制作的人工重组轮状病毒称为“rssa11-rv-nov vp1”。将所得到的rssa11-rv-akaluc及rssa11-rv-nov vp1分别传代至p10后提取病毒基因组rna，供于sds-page。
[0067]
5-2结果将rssa11-rv-akaluc的结果示于图19，将rssa11-rv-nov vp1的结果示于图20。除了nsp1以外，均在与野生型sa11株相同的位置确认到了rssa11-rv-akaluc及rssa11-rv-nov vp1的各基因组rna的条带。另一方面，还分别在高于野生型sa11株的nsp1的条带的位置确认到了rssa11-rv-akaluc的nsp1-rv-akaluc基因的条带及rssa11-rv-nov vp1的rv-nov vp1基因的条带。此结果表示，即使是对于具有长1kbp以上的碱基长度的外源基因，也能够通过使其密码子组成接近于轮状病毒的密码子组成而制作稳定地保持具有1kbp以上的碱基长度的外源基因的转基因轮状病毒。
[0068]
[实施例6：表达绿色荧光蛋白的人工重组蝙蝠呼肠孤病毒]6-1材料及方法(1)病毒蝙蝠呼肠孤病毒(pteropine orthoreovirus，以下称为“prv”)与轮状病毒同属呼肠孤病毒科，其具有由l1、l2、l3、m1、m2、m3、s1、s2、s3及s4构成的10个节段的双链rna。以与实施例1的包含轮状病毒的各分节段rna基因组表达盒的质粒(分节段rna基因组表达载体)相同的制作方法，制作包含prv的10个分节段rna基因组的cdna的质粒。
[0069]
(2)绿色荧光蛋白基因与实施例2相同，使用了zsg基因及rv-zsg基因。将zsg基因及rv-zsg基因插入到prv s1基因中。prv s1基因为编码fast、p17及sigmac的基因，但是制作了将prv s1基因连续的fast-p17-sigmac替换为zsg-2a-fast或rvzsg-2a-fast的s1-zsg-2a-fast基因及s1-rvzsg-2a-fast(参照图21)。
[0070]
(3)表达绿色荧光蛋白的人工重组蝙蝠呼肠孤病毒的制作以与实施例1相同的方法，将包含除s1基因以外的野生型基因的9种质粒与包含s1-zsg-2a-fast基因的质粒转染于bhk-t7/p5细胞，并传代于猴ma104细胞从而得到人工重组蝙蝠呼肠孤病毒(称为“rsmb-zsg-2a-fast”)。同样地，将包含除s1基因以外的野生型基因的9种质粒与包含s1-rv-zsg-2a-fast基因的质粒转染于bhk-t7/p5细胞，并传代于猴ma104细胞从而得到人工重组蝙蝠呼肠孤病毒(称为“rsmb-rv-zsg-2a-fast”)。
[0071]
6-2结果利用蚀斑法在荧光显微镜下考察rsmb-zsg-2a-fast病毒的绿色荧光蛋白(zsg)的表达，结果发现全部病毒颗粒中的1/50～1/100左右呈现绿色荧光。然而，进行2～3次病毒的传代时，呈现绿色荧光的病毒消失。另一方面，rsmb-rv-zsg-2a-fast病毒中100％的病毒呈现绿色荧光，即使在进行2～3次病毒的传代后，病毒仍呈现绿色荧光(参照图22)，表示rv-zsg基因被稳定地保持。
[0072]
[实施例7：表达绿色荧光蛋白的人工重组哺乳类呼肠孤病毒]7-1材料及方法(1)病毒哺乳类呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus，以下称为“mrv”)与轮状病毒同属呼肠孤病毒科，其具有由l1、l2、l3、m1、m2、m3、s1、s2、s3及s4构成的10个节段的双链rna。以与实施例1的包含轮状病毒的各分节段rna基因组表达盒的质粒(分节段rna基因组表达载体)相同的制作方法，制作包含mrv的10个分节段rna基因组的cdna的质粒。
[0073]
(2)绿色荧光蛋白基因作为绿色荧光蛋白，使用了zsg基因、以及使zsg基因的密码子组成近似于mrv l1基因的密码子组成而得到的mrv-zsg基因。在图23的(a)～(u)中示出了mrv l1基因、zsg基因及mrv-zsg基因中的各氨基酸的密码子组成。原始的zsg基因的gc含量为63％，而mrv-zsg基因的gc含量降低至43％，其接近mrv l1基因的gc含量(46％)(参照表9)。
[0074]
[表9]
[0075]
将zsg基因及mrv-zsg基因插入到mrv l1基因中。mrv l1基因为编码λ3蛋白的基因，在zsg基因及mrv-zsg基因的下游插入编码自剪切肽的2a基因，从而制作了l1-zsg-2a-λ3及l1-mrv-zsg-2a-λ3(参照图24)。
[0076]
(3)表达绿色荧光蛋白的人工重组哺乳类呼肠孤病毒的制作以与实施例1相同的方法，将包含除l1基因以外的野生型基因的9种质粒与包含l1-zsg-2a-λ3基因的质粒转染于bhk-t7/p5细胞，并传代于小鼠l929细胞从而得到人工重组哺乳类呼肠孤病毒(称为“rsmrv-zsg”)。同样地，将包含除l1基因以外的野生型基因的9种质粒与包含l1-mrv-zsg-2a-λ3基因的质粒转染于bhk-t7/p5细胞，并传代于小鼠l929细胞，从而得到人工重组哺乳类呼肠孤病毒(称为“rsmrv-mrv-zsg”)。
[0077]
7-2结果利用使用了mrv特异性抗体的免疫染色法，在荧光显微镜下对rsmrv-zsg病毒的绿色荧光蛋白(zsg)的表达进行考察，结果所考察的所有rsmrv-zsg病毒感染细胞均未呈现绿色荧光。另一方面，rsmrv-mrv-zsg病毒中100％的病毒感染细胞呈现绿色荧光，即使在进行了3次病毒的传代后病毒也呈现绿色荧光(参照图25)，表示mrv-zsg基因被稳定地保持。此外，从进行1～3次传代后的rsmrv-zsg及rsmrv-mrv-zsg中提取病毒基因组rna，并进行电泳分析时确认到，rsmrv-zsg病毒的所插入的zsg基因在第一次传代时就发生缺失，而rsmrv-mrv-zsg病毒即使在进行3次传代后也保持有mrv-zsg基因(参照图26)。
[0078]
另外，本发明不受上述的各实施方案及实施例限定，可在权利要求所示的范围内进行各种变更，适当组合不同的实施方案所公开的技术手段而得到的实施方案也涵盖于本发明的技术范围内。此外，本说明书中记载的所有学术文献及专利文献均作为参考而被引用至本说明书中。