与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499紧密连锁的ssr标记
技术领域：
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499紧密连锁的共显性ssr标记及其应用。


背景技术：

2.烟草蔗糖酯是其叶片表面化学主要成分之一，也是烟草中重要的潜在致香前体物质，其中，栽培烟草中含量较高的为蔗糖四酯，其降解可产生小分子挥发性脂肪酸并可极大地提高烟叶的香气品质。
3.大量研究表明，普通烟草中的蔗糖四酯依据分子量的大小不同，进一步分为6个类型(组)，即，i型烟草蔗糖酯～vi型烟草蔗糖酯，其中，iii型～vi型烟草蔗糖酯中因含有3-甲基戊酰基而被称为bmvse(vontimitta v,danehower d a,steede t,moon h s,lewis r s,analysis of a nicotiana tabacum l.genomic region controlling two leaf surface chemistry traits.journal of agricultural and food chemistry,2010,58:294-300.)。不同栽培烟草类型中蔗糖四酯的结构类型和含量存在较大差异，烤烟、白肋烟和马里兰烟中仅含少量的i型和ii型烟草蔗糖酯，不含或含有痕量的bmvse；而香料烟和雪茄烟含有大量的bmvse。
4.已有人发现，bmvse经硅烷化气相色谱质谱(gc-ms)进一步解析后，依据葡萄糖环部分特征碎片离子大小又可分为bmvse471(iii型烟草蔗糖酯)、bmvse485(iv型烟草蔗糖酯)和bmvse499(v型烟草蔗糖酯)，上述3种类型烟草蔗糖酯也是培育含高蔗糖酯而具有高香气品质烤烟新品种的核心关注点。
5.但是，现有技术往往错误的将原本分别属于bmvse471(iii型)、bmvse485(iv型)和bmvse499(v型)三个不同独立基因视作一个基因(而且统一命名为bmvse)进行遗传定位研究。故此，获得的定位结果是不准确的。导致远未达到分子标记辅助选择(mas)精准要求。
6.比如，bmvse性状的基因呈显性，被定位于ssr标记pt30354和pt52061、pt61362之间约5.2cm区域内，且与ssr标记pt30209和pt20315呈共分离(vontimitta v,danehower d a,steede t,moon h s,lewis r s,analysis of a nicotiana tabacum l.genomic region controlling two leaf surface chemistry traits.journal of agricultural and food chemistry,2010,58:294-300.)。国内的烟草育种工作者利用上述5个ssr标记对不同遗传背景的烟草材料及192份重组自交系群体进行bmvse筛选验证，结果表明仅2个标记(pt20135和pt30354)可使用，但标记的基因型与bmvse表型的一致率约92.165％(陈彪，陈铭，李洋洋，屈亚芳，程立锐，杨爱国，胡日生，刘旦，罗成刚，向世鹏，冯全福，常爱霞，烟草糖酯ssr分子标记筛选及辅助育种应用.中国烟草科学,2019,40(3):8-15.)。主要原因为：文献的作者错误的将原本分别属于bmvse471(iii型)、bmvse485(iv型)和bmvse499(v型)三个不同独立基因视作一个基因。
7.鉴于此，本发明将bmvse中包含的bmvse471(ⅲ型)、bmvse485(iv型)和bmvse499(v型)三种类型烟草蔗糖酯进行区分，并以优质多抗雪茄烟品种beinhart1000-1(其叶片中的
高香气品质由bmvse控制，而bmvse受数量性状基因qbmvse471(ⅲ型)、qbmvse485(iv型)和qbmvse499(v型)控制)和烤烟品种红花大金元(综合性状优良但不含bmvse)为亲本，通过杂交、连续套袋自交，构建一个含有341份株系的烟草重组自交系(rils_f
7:8
)为作图群体，利用数量性状连锁分析(qtl)法和硅烷化气相色谱质谱(gc-ms)法，在烟草全基因组范围内筛选获得与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499紧密连锁的共显性ssr标记，以弥补现有技术和已报道文献的不足、加速分子标记辅助选择(mas)在烟草高香气品种选育中的精准、高效利用。
8.因此，将bmvse中包含的bmvse471(ⅲ型)、bmvse485(iv型)和bmvse499(v型)三种类型烟草蔗糖酯进行区分，精准获得与烟草蔗糖酯的某一独立基因紧密连锁的共显性ssr标记，是培育含高蔗糖酯而具有高香气品质烤烟新品种的重要途径。可以精准、高效地在烟草高香气品种选育中加速分子标记辅助选择(mas)的利用。


技术实现要素：

9.本发明的第一目的在于提供一种与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499紧密连锁的共显性ssr标记；第二目的在于将上述共显性ssr标记应用于检测烟草基因组dna中是否存在v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499。
10.本发明的创新点：本发明发现了现有技术中的一个重大错误认识。
11.本发明人发现，文献中将iii～v型烟草蔗糖酯混为一个基因(bmvse)进行定位是不准确的，甚至是错误的，应该在三种类型bmvse中具体选择一种类型才能精确定位。现有技术的这个错误或不足，严重地制约了利用与iii～v型bmvse基因紧密连锁标记开展高香气烟草新品种的选育进程。
12.本发明人的研究表明，iii～v型bmvse属于典型的数量性状，且受beinhart1000-1基因组内不同染色体或同一染色体上不同位置的qtls控制，这些基因/qtls被暂命名为qbmvse471、qbmvse485和qbmvse499。
13.本发明进一步将文献报道的5个与bmvse紧密连锁ssr标记信息与beinhart1000-1基因组比对可知，即使与bmvse呈共分离的pt30329和pt20315标记间仍存在约15mb的物理距离，也即，文献针对iii～v型烟草蔗糖酯作为一个基因(bmvse)进行定位的结果是不准确的，该定位结果极有可能只是三种类型bmvse中的一种。故此，国内的某烟草育种工作者进行bmvse筛选验证中才会出现了5个紧密连锁标记仅有2个可用，且无法精准实现标记基因型与bmvse表型一致的情况。
14.1、本发明将bmvse中包含的bmvse471(ⅲ型)、bmvse485(iv型)和bmvse499(v型)三种类型烟草蔗糖酯进行区分，并以优质多抗雪茄烟品种beinhart1000-1为亲本，和烤烟品种红花大金元通过杂交、连续套袋自交，构建了一个含有341份株系的烟草重组自交系(rils_f
7:8
)为作图群体。
15.所述抗雪茄烟品种beinhart1000-1叶片中的高香气品质由bmvse控制，而bmvse受数量性状基因qbmvse471(ⅲ型)、qbmvse485(iv型)和qbmvse499(v型)控制)。所述烤烟品种红花大金元综合性状优良，但不含bmvse。
16.2、利用数量性状连锁分析(qtl)法和硅烷化气相色谱质谱(gc-ms)法，在烟草全基因组范围内筛选，获得了一个与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499紧密连锁的共显性ssr标记。
17.本发明筛选获得的上述与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499基因连锁的共显性ssr标记，可用于v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率，提高培育简捷、精准、高效选择具有高香气品质潜力的v型烟草蔗糖酯烟草品种选育的效率。
18.所述与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499紧密连锁的共显性ssr标记，编号为tmc42886序列和tmc43016序列，其特征在于所述共显性ssr标记的pcr扩增产物选自以下核苷酸序列中的一种或几种：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4。
19.所述tmc42886序列和tmc43016序列所对应的2个位点的引物序列分别为：
20.tmc42886序列的引物：seq id no:5和seq id no:6；
21.tmc43016序列的引物：seq id no:7和seq id no:8。
22.本发明提供的上述与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499紧密连锁的共显性ssr标记可以应用于烟草基因的检测，尤其是检测烟草基因组dna中是否存在v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499。
23.检测方法是用前述tmc42886序列的引物和tmc43016序列的引物分别扩增待检测烟草基因组dna，然后检测pcr扩增产物，并按以下方式进行判断：
24.如果pcr扩增产物中同时含有如seq id no:1和seq id no:3所示序列，表明该待测烟草植株含有高香气品质的v型烟草蔗糖酯的纯合等位基因，基因型记为se499se499；
25.如果pcr扩增产物中同时含有如seq id no:2和seq id no:4所示序列，表明该待测烟草植株不含或含有痕量的v型烟草蔗糖酯的纯合等位基因，基因型记为se499se499；
26.如果pcr扩增产物中含有如seq id no:1和seq id no:2所示序列，或含有如seq id no:3和seq id no:4所示序列，或含有如seq id no:1、seq id no:3和seq id no:4所示序列，或含有如seq id no:3、seq id no:1和seq id no:2所示序列，表明该待测烟草植株含有v型烟草蔗糖酯的杂合等位基因，基因型记为se499se499。
27.为了简捷高效选择具有高香气品质潜力的v型烟草蔗糖酯烟草品种，本发明有针对性并特异性地选择含v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499的后代材料，可用于v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及高香气烟草品种选育的效率。利用本发明提供的两个与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499紧密连锁的共显性ssr标记，不仅可用于定性检测任何生育期的烟草基因组dna中是否存在v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499，还可以精准、高效、便捷且低成本的实现烟草v型烟草蔗糖酯含量的定量检测，并且还可清晰鉴别待测植株中的v型烟草蔗糖酯的基因型状态(即，具有最高含量值且稳定遗传的纯合基因型se499se499、具有中等含量值且遗传不能稳定的杂合基因型se499se499、不含或含痕量值且稳定遗传的纯合基因型se499se499)，进而既提高了具有高香气品质烤烟新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。
28.本发明与现有技术相比，其有益效果为：
29.1、纠正了现有技术的错误
30.本发明有效纠正并弥补了文献中将三种不同类型bmvse视作一个基因的错误与不足，同时也可精准的鉴别具有v型烟草蔗糖酯的基因型；
31.2、检测v型烟草蔗糖酯准确度高
32.提供了用于检测v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499的分子标记，可精准确定待测烟草中是否含有v型烟草蔗糖酯，与现有技术检测烟草蔗糖酯含量的方法相比，本方法的检测准
确度更高。
33.3、检测方法高效、稳定、可靠，且操作简捷和低成本
34.与现有的采用低通量、高成本、耗时费力的gc-ms法检测烟草蔗糖酯含量相比，本发明所述的共显性ssr标记具有高效、稳定、可靠、简捷和低成本的特点。
35.4、不限检测时机
36.本方法可在烟草生长的任何时期进行检测，极大的缩短了实验周期，进而加速了选育高香气品质烤烟新品种进程。
37.序列信息:
38.seq id no:1：是利用编号为tmc42886的ssr标记序列，在待测烟草基因组dna中进行pcr扩增时，获得含有v型烟草蔗糖酯的核苷酸序列。
39.seq id no:2：是利用编号为tmc42886的ssr标记序列，在待测烟草基因组dna中进行pcr扩增时，获得不含或含有痕量v型烟草蔗糖酯的核苷酸序列。
40.seq id no:3：是利用编号为tmc43016的ssr标记序列，在待测烟草基因组dna中进行pcr扩增时，获得含有v型烟草蔗糖酯的核苷酸序列。
41.seq id no:4：是利用编号为tmc43016的ssr标记序列，在待测烟草基因组dna中进行pcr扩增时，获得不含或含有痕量v型烟草蔗糖酯的核苷酸序列。
42.seq id no:5：是编号为tmc42886的ssr标记上游引物核苷酸序列
43.seq id no:6：是编号为tmc42886的ssr标记下游引物核苷酸序列
44.seq id no:7：是编号为tmc43016的ssr标记上游引物核苷酸序列
45.seq id no:8：是编号为tmc43016的ssr标记下游引物核苷酸序列
附图说明
46.图1是基于烟草重组自交系群体(rils_f
7:8
；红花大金元
×
beinhart1000-1)的第24号连锁群上ⅲ型烟草蔗糖酯qtl分析曲线图。
47.其中，利用软件为：qtl icimapping v4.2；参数设置：定位方法为icim-add：inclusive composite interval mapping of additive(and dominant)qtl，迭代次数为1000(permutation times＝1000)，显著性为0.01(significance＝0.01)，步长为0.5cm(walk speed＝0.5cm)。横坐标为遗传距离(单位：厘摩cm)；纵坐标为lod值。图中的横向虚线是在0.01显著性阈值下的lod值＝3.3733；lod曲线最高点为主效基因(qbmvse499_24)。
具体实施方式
48.下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照相关产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
49.本发明所述的与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499紧密连锁的共显性ssr标记的编号为tmc42886和tmc43016，其pcr扩增产物核苷酸序列分别为seq id no:1和seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4所示。
50.所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：
51.tmc42886序列为tmc42886f：5
’‑
gcatctattgtggtcggaaga-3’，
52.tmc42886r：5
’‑
tcgaacttctggatctccctta-3’；
53.tmc43016序列为tmc43016f：5
’‑
ggcgatcccttgatgctat-3’，
54.tmc43016r：5
’‑
cattgggaaaagtcgacaca-3’。
55.本发明所述的与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499紧密连锁的共显性ssr标记的应用为所述的与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499紧密连锁的共显性ssr标记在检测烟草基因组dna中是否存在v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499中的应用。
56.所述的与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499紧密连锁的共显性ssr标记的应用是分别以tmc42886序列的引物和tmc43016序列的引物扩增待检测烟草基因组dna，检测pcr扩增产物，如果pcr扩增产物中同时含有如seq id no:1和seq id no:3所示序列即为该烟草植株含有v型烟草蔗糖酯的纯合等位基因se499se499；如果pcr扩增产物中同时含有如seq id no:2和seq id no:4所示序列则为待测烟草植株不含或含有痕量的v型烟草蔗糖酯的纯合等位基因se499se499；如果pcr扩增产物中含有如seq id no:1和seq id no:2所示序列，或含有如seq id no:3和seq id no:4所示序列，或含有如seq id no:1、seq id no:3和seq id no:4所示序列，或含有如seq id no:3、seq id no:1和seq id no:2所示序列即为待测烟草植株中含有v型烟草蔗糖酯的杂合基因se499se499。
57.下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
58.实施例1与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499连锁的共显性ssr标记的筛选
59.采用数量性状连锁分析(qtl)法并结合硅烷化气相色谱质谱(gc-ms)法，在烟草全基因组范围内筛选与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499连锁的共显性ssr标记
60.一、实验材料
61.以综合性状优良且不含v型烟草蔗糖酯的烤烟品种红花大金元为母本，以含iii型、iv型和v型烟草蔗糖酯的雪茄烟品种beinhart1000-1(其iii～v型烟草蔗糖酯分别由qbmvse471、qbmvse485、qbmvse499基因控制)为父本，经杂交、连续自交，获得341份株系的重组自交系(rils_f
7:8
)作为遗传作图群体。
62.二、亲本及rils_f
7:8
群体v型烟草蔗糖酯含量数据获得
63.试验材料成苗后移栽至大田，待大田烟叶成熟时，每个株系随机选10株，且每株烟草选取3片中部叶片；将上述每个株系的30片中部叶片叠在一起，利用直径1cm的打孔器在叶片中部位置随机打2个孔，获得60个直径1cm的圆形叶片。
64.将获得的60个圆形小叶片按照文献(蔡莉莉，谢复炜，刘克建，张映，谢剑平，香料烟中蔗糖酯的气相色谱/质谱分析.烟草科技,2009,3:40-44.王瑞玲，王莹莹，毛多斌，贾春晓，烟草中蔗糖四酯类化合物的gc-ms分析.化学研究与应用,2011,23(8):1030-1035.)报道的方法，进行烟草蔗糖酯含量检测。
65.经gc-ms法检测获得的341份rils_f
7:8
群体v型烟草蔗糖酯含量作为rils_f
7:8
群体的表型值，用于下一步的qtl连锁分析。
66.三、ssr标记分析
67.烟草基因组dna提取：采用常规ctab法或植物组织dna提取试剂盒均可，方法可参考已有的文献或试剂盒中的说明书。
68.pcr扩增及电泳检测：pcr扩增体系是常规的体系可参照已发表的文献，其中，本发明所提供的标记退火温度均为60℃；pcr扩增程序信息可参照相关文献；电泳检测也是采用
常规的方法，可参照已发表的相关文献。
69.利用本实验室分别基于烤烟红花大金元和雪茄烟beinhart1000-1基因组信息开发的约50000个ssr标记，对rils_f
7:8
群体的双亲(红花大金元和beinhart1000-1)和子一代(f1)进行多态性筛选，最终，筛选获得2001个多态性ssr标记。
70.再利用筛选获得2001个多态ssr标记，对341份rils_f
7:8
样品进行基因型分析。
71.其次，利用遗传连锁作图软件joinmap 4.0对341份rils_f
7:8
样品的基因型数据进行连锁分析，绘制一张含有24条连锁群且均匀分布1974个ssr标记，覆盖烟草基因组长度为3213.138cm的高质量雪茄烟遗传连锁图谱，作为rils_f
7:8
群体的基因型值，用于下一步的qtl连锁分析。
72.四、v型烟草蔗糖酯(qbmvse499)的全基因组qtl定位分析
73.利用qtl定位分析软件qtl icimapping v4.2对rils_f
7:8
群体的基因型数据(构建获得雪茄烟遗传连锁群图谱)和表型数据(341份rils_f
7:8
群体的v型烟草蔗糖酯含量)，对v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499进行全基因组qtl扫描。
74.其中，相关参数设置为：定位方法选icim-add：inclusive composite interval mapping of additive(and dominant)qtl，迭代次数为1000(permutation times＝1000)，显著性为0.01(significance＝0.01)，步长为0.5cm(walk speed＝0.5cm)。
75.最后，在全基因组范围内的lod＝3.3733条件下，位于第24号连锁群的61.00cm处定位获得v型烟草蔗糖酯性状的1个主效qtl(暂时命名为qbmvse499_24)。该主效qtl可解释约19.35％的表型变异率，且此时的lod值约为7.70，详见图1和表1。
76.表1v型烟草蔗糖酯qtl(qbmvse499_24)信息统计
77.qtlchromosomeposition/cmleft markerright markerlodpve(％)addqbmvse499_242461.00tmc42886tmc430167.697319.35180.2618
78.注：pve为qtl的效应值，即，该qtl可解释表型变异百分比；add为加性效应。
79.实施例2共显性连锁标记在rils_f
8:9
群体单株中的验证
80.利用获得的与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499两侧紧密连锁的共显性ssr标记tmc42886和tmc43016，对苗期的rils_f
8:9
群体(红花大金元
×
beinhart1000-1)单株进行基因型分析，获得rils_f
8:9
群体各单株的基因型数据。
81.另一方面，待rils_f
8:9
群体的烟叶生长至成熟采烤前，采用gc-ms法对各株系的成熟中部叶片取样，检测叶片中的iii型烟草蔗糖酯含量。即，获取rils_f
8:9
群体各株系的表型值。
82.最后，分析341份rils_f
8:9
群体的基因型数据与v型烟草蔗糖酯表型值，发现本发明公布的两个共显性ssr标记tmc42886和tmc43016的基因型值与表型值完全吻合，即，一致率达100％。
83.具体的分析方法为：通过gc-ms检测获得的各株系v型烟草蔗糖酯含量高于或等于亲本beinhart1000-1含量时，该株系的基因型中也是同时呈现如seq id no:1(266bp)和seq id no:3(313bp)所示序列即为纯合基因型se499se499；
84.检测获得的各株系v型烟草蔗糖酯含量等于或低于亲本红花大金元含量时，该株系的基因型中也是同时呈现如id no.2(310bp)和seq id no:4(339bp)所示序列即为纯合基因型se471se471；
85.而当检测获得的各株系v型烟草蔗糖酯含量介于亲本红花大金元与beinhart1000-1之间，也即与子一代(f1)含量相近时，该株系的基因型中也是同时呈现如seq id no:1和seq id no:2所示序列，或含有seq id no:3和seq id no:4所示序列，或含有seq id no:1、seq id no:3和seq id no:4所示序列，或含有seq id no:3、seq id no:1和seq id no:2所示序列即为杂合基因型se499se499。
86.实验结论：
87.以上结果表明，共显性标记tmc42886和tmc43016分别与v型烟草蔗糖酯基因qbmvse499紧密连锁，且该两个标记位于目的基因(qbmvse499_24)两侧。
88.利用上述两个共显性紧密连锁ssr标记，不仅可以精准、高效、便捷且低成本的实现烟草任何生育期的v型烟草蔗糖酯含量的检测，而且也可清晰鉴别待测植株中的v型烟草蔗糖酯的基因型状态(即，具有最高含量值且稳定遗传的纯合基因型se499se499、具有中等含量值且遗传不能稳定的杂合基因型se499se499、不含或含痕量值且稳定遗传的纯合基因型se499se499)，进而既提高了具有高香气品质烤烟新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。