一种栖木假单胞菌l1及其应用
技术领域
1.本发明属于污水生物处理技术领域，特别地涉及一种栖木假单胞菌l1及其应用。


背景技术：

2.随着电镀行业的不断发展，电镀废水排放造成的重金属污染已广泛存在。电镀过程中会排放大量含重金属和其他持久性有毒物质的有机污染废水，导致电镀行业成为全球化学密集型行业中风险最高的行业之一。由于在电镀过程中会使用不同的化学药品和金属，清洗电镀产品产生的清洗废水往往含有大量重金属离子，例如铜(cu)，镍(ni)，铬(cr)等。这些重金属污染物进入环境后不易降解，易在动物体内富集，并通过食物链被人体吸收，引起肺纤维化、肾水肿、皮炎和胃肠道疾病，严重危害人类健康，导致严重的健康问题和环境风险。此外，电镀厂在酸洗过程中使用硝酸盐(no
3-)，导致电镀废水中硝酸盐的积累。大量的硝酸盐进入环境会导致水体富营养化，对自然环境和人类健康产生负面影响。因此，重金属和硝酸盐是电镀行业废水中需要重点去除的污染物质。
3.目前，重金属和硝酸盐的去除往往是分别进行的，这增加了复合电镀废水处理的复杂性。常见的重金属处理方法包括膜分离、反渗透、离子交换等。而硝酸盐主要是在缺(厌)氧的条件下通过反硝化细菌进行去除。这些方法处理费用较高或操作复杂，且在去除复合污染物方面存在局限性。因此，迫切需要一种经济便捷的替代方案，可以同时去除污水中的硝酸盐和重金属。已有一些研究通过物理化学方法去除硝酸盐和重金属，例如铁碳基人工湿地，零价铁等。采用物理化学方法处理含有硝酸盐和重金属的污水具有一定的效果，但存在二次污染和处理费用高等问题。微生物法因其经济、便捷、无二次污染等优势成为研究热点。已有研究报道了一些能对单一重金属进行去除的细菌，例如brucell sp.,lysinibacillus sp.和ochrobactrum sp.等。然而，电镀废水中的污染物质往往都包含硝酸盐和多种重金属，目前对于这类复合污染物的生物去除研究还相对较少。甚至在已有的研究中发现相对于单一重金属，多种重金属的共存往往会降低菌种对重金属的耐受程度，导致菌种对复合污染物的去除效果变差。因此，寻求能够同时去除多种重金属的菌株成为了实际应用之需。本发明旨在提供一种能够同时去除硝酸盐和多种重金属的微生物新技术，从而在实际应用中实现对含硝酸盐和重金属复合污染的有机污水的良好去除。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种栖木假单胞菌l1，该菌株兼具重金属去除能力和好氧反硝化性能，为有机污水的处理提供了更多的选择，解决现有有机污水中同时存在硝酸盐和重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)复合污染，而现有的微生物处理技术存在环境适应性差和去除效果欠佳等问题。
5.为实现上述目的，本发明提供了栖木假单胞菌(pseudomonas hibiscicola strain)l1，所述菌株于2021年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：
100101)，保藏编号为cgmcc no.23319。
6.本发明的另一个目的在于，还提供了一种污水处理菌剂，所述污水处理菌剂包括保藏编号为cgmcc no.23319的栖木假单胞菌l1。
7.进一步，所述栖木假单胞菌l1的活菌含量≥1
×
107cfu/ml。
8.本发明的另一个目的在于，还提供了上述栖木假单胞菌l1或其制备的污水处理菌剂在处理同时含硝酸盐和重金属有机污水中的应用。
9.进一步，所述重金属为ni(ii)、cr(vi)和cu(ii)中的一种或多种，且所述有机污水中ni(ii)的初始浓度为20～100mg/l。
10.进一步，所述有机污水的ph值为5～8。
11.本发明的另一个目的在于，还提供了一种同时含硝酸盐和重金属有机污水的处理方法，将保藏编号为cgmcc no.23319的栖木假单胞菌l1或由其制备的污水处理菌剂投入到所述有机污水中。
12.进一步，所述重金属为ni(ii)、cr(vi)和cu(ii)中的一种或多种，且所述有机污水中ni(ii)的初始浓度为20～100mg/l。
13.进一步，所述栖木假单胞菌l1或由其制备的污水处理菌剂的投加量为有机污水量的0.5％～1％(v/v)。
14.进一步，所述有机污水的ph值为5～8。
15.本发明栖木假单胞菌l1对污水中重金属处理的机理：栖木假单胞菌l1通过微生物内的cr还原酶将cr(vi)还原成毒性较低的cr(iii)，生成络合物crpo4吸附在细菌的表面；同时能将ni(ii)、cu(ii)以络合物nico3、niso4(h2o)、ni(oh)2、cu(oh)2、cuso4、cu(po4)(oh3)的形式吸附在细菌的表面。将菌体从污水中进行回收，一方面实现污水中重金属的去除；另一方面，还可实现重金属的回收和资源化利用。
16.相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
17.1、本发明的栖木假单胞菌l1，其具有好氧反硝化脱氮能力，能够在好氧条件下实现对污水中硝酸盐的去除，且亚硝酸盐积累量很少，解决了硝酸盐还原过程中亚硝酸盐积累的弊端。另一方面，栖木假单胞菌l1在脱氮的同时还能够去除污水中的重金属ni(ii)或重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)；栖木假单胞菌l1对重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)具有较好的耐受性，多种重金属的共存不会抑制栖木假单胞菌l1的生长代谢活性和好氧反硝化脱氮能力。并且，与相同浓度下含硝酸盐和单一重金属ni(ii)的有机污水相比，在重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)共存的有机污水中，栖木假单胞菌l1具有更高的硝酸盐和ni(ii)去除能力；更进一步地，栖木假单胞菌l1还能将毒性较强的cr(vi)还原成毒性较低的cr(iii)，降低污水中重金属的毒性。因此，该菌株的应用突破了传统的缺(厌)氧反硝化脱氮技术，实现了在好氧条件下通过一种微生物对硝酸盐及多种重金属同时去除的目的。这表明菌株l1在处理存在硝酸盐及重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的复合有机污水方面具有良好的应用前景。
18.2、本发明提供的污水处理菌剂，具有制备简单，成本低，易于工业化生产，能在生物反应器中表现出良好的去除硝酸盐及重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的能力，污水处理效果良好，且不会造成环境污染，具有良好的开发应用前景。
19.3、本发明的有机污水的处理方法具有工艺简便、基础设施和运维成本低等特点，
在处理存在硝酸盐及重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)污染的有机污水方面表现出良好的经济效益。
附图说明
20.图1为栖木假单胞菌l1在不同初始ni(ii)浓度下的生长和污染物去除特性。(a)菌株l1生长特性；(b)ni(ii)浓度；(c)no
3-‑
n浓度；(d)no
2-‑
n浓度。
21.图2为栖木假单胞菌l1的生长及对ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)和no
3-‑
n的去除特性。(a)菌株l1生长特性；(b)ph值和污染物浓度变化。
22.图3为栖木假单胞菌l1在不同ph条件下对ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)和no
3-‑
n的去除特性。
23.图4为实施例5中生物反应器装置的结构示意图：
①
反应瓶；
②
进水瓶；
③
出水瓶；
④
搅拌器；
⑤
磁力转子；
⑥
气泵；
⑦
气体流量计；
⑧
蠕动泵；
⑨
空气滤膜；
⑩
恒温培养箱。
24.图5为生物反应器中ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)和no
3-‑
n的去除特性。
具体实施方式
25.为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
26.在本发明的描述中，需要说明的是：下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规的实验方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均自常规生化试剂商店购买得到的；下述实施例中所涉及的各实验均设置三次重复，结果取平均值。
27.以下实施例中所涉及到的培养基：
28.luria-bertani(lb)培养基(每升)：蛋白胨10g、酵母浸出粉5g、nacl 5g。
29.dm培养基(每升)：kno30.7221 g、c6h5na3o7·
2h2o 4.085g、nacl 4g、微量元素3ml、nah2po4·
2h2o 1.83g和na2hpo4·
12h2o 4.37g。
30.含重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的dm培养基：在每升dm中加入1ml的2000mg/l的ni(ii)标准液、1ml的2000mg/l的cr(vi)标准液和2ml的1000mg/l cu(ii)标准液得到含ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的dm培养基。
31.dm固体选择培养基：在dm培养基中加入琼脂粉，琼脂粉15～20g/l。
32.微量元素溶液(每升)：mnso4·
h2o 3.36g；h3bo31.12 g；znso4·
7h2o 3.0g；cacl20.6 g；mgso4·
7h2o 0.1027g；feso4·
7h2o 0.0497g。
33.ni(ii)标准液：将6.1379g nino3加入一升去离子水中得到2000mg/l的ni(ii)标准液。
34.cr(vi)标准液：将5.6586g k2cr2o7加入一升去离子水中得到2000mg/l的cr(vi)标准液。
35.cu(ii)标准液：将2.5g cuso4加入一升去离子水中得到1000mg/l cu(ii)标准液。
36.a培养基(每升)：kno30.7221 g、c6h5na3o7·
2h2o 4.085g、nacl 4g、微量元素3ml、nah2po4·
2h2o 1.83g、na2hpo4·
12h2o 4.37g和1ml 2000mg/l的ni(ii)标准液。
37.b培养基(每升)：kno30.7221 g、c6h5na3o7·
2h2o 4.085g、nacl 4g、微量元素3ml、
nah2po4·
2h2o 1.83g、na2hpo4·
12h2o 4.37g和2ml 2000mg/l的ni(ii)标准液。
38.c培养基(每升)：kno30.7221 g、c6h5na3o7·
2h2o 4.085g、nacl 4g、微量元素3ml、nah2po4·
2h2o 1.83g、na2hpo4·
12h2o 4.37g和3ml 2000mg/l的ni(ii)标准液。
39.d培养基(每升)：kno30.7221 g、c6h5na3o7·
2h2o 4.085g、nacl 4g、微量元素3ml、nah2po4·
2h2o 1.83g、na2hpo4·
12h2o 4.37g和4ml 2000mg/l的ni(ii)标准液。
40.e培养基(每升)：kno30.7221 g、c6h5na3o7·
2h2o 4.085g、nacl 4g、微量元素3ml、nah2po4·
2h2o 1.83g、na2hpo4·
12h2o 4.37g和5ml 2000mg/l的ni(ii)标准液。
41.无特殊说明，用1m hcl或2m naoh将上述培养基的ph值调至7。上述液体培养条件为恒温30℃、摇床转速为120rpm；固体平板培养条件为恒温30℃。
42.实施例1菌株栖木假单胞菌l1的分离筛选及鉴定
43.本发明所提供的栖木假单胞菌l1是从晏家表面处理中心(中国重庆)取原泥，对原泥中的菌群进行活化后，在含重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的dm培养基中进行首次性能筛选，随后对经过初筛的细菌悬液进行后续的划线分离和选择培养，经过多次固体平板划线和液体选择培养的往复循环筛选及分离后得到目标菌株l1。
44.具体地，分离筛选方法：从晏家表面处理中心(中国重庆)的膜生物反应器(mbr)中取新鲜的污泥。将5ml污泥接种到95ml装有生理盐水的无菌烧瓶中，然后放入恒温摇床中，在30℃和120rpm下振荡1h。然后，将1ml菌液放入含重金属ni(ii)、cr(vi)和cu(ii)的dm培养基中进行培养。混浊后，将1ml培养液转移到新鲜的含重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的dm培养基中，在30℃和120rpm下继续培养120h。此步骤重复3～4次。之后，将菌液在dm固体选择培养基上划线以获得单菌落。将分离的单一菌落在含重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的dm培养基中培养，并测定ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)和硝酸盐去除效率。得到去除ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)和硝酸盐效果良好的菌株，将其在dm固体选择培养基上划线培养获取单菌落。接着，继续将获得的单菌落在含重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的dm培养基中培养，并测定ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)和硝酸盐去除效率。重复进行平板划线和性能检测。选择去除重金属和硝酸盐效果良好的菌株，将其命名为菌株l1，长期保存。
45.鉴定方法：用omega细菌dna试剂盒提取菌株基因组dna作为模板，通过聚合酶链式反应(pcr)获得该菌株的16s rdna。16s rdna的引物是通用引物27f(5'agagtttgatcmtggctcag 3')和1492r(5'ggttaccttgttacgactt 3')。pcr反应扩增程序包括38个循环，具体程序是先在98℃预变性2min，循环是在98℃下进行10s，55℃下进行15s，72℃下进行15s，最后72℃再延伸5min。pcr产物在琼脂糖凝胶上割胶回收后提交给北京擎科生物技术有限公司成都分公司进行测序分析。本发明中栖木假单胞菌l1的16s rdna基因具体序列如seq id no.1所示，序列长度为1443bp。序列结果与genbank中已有细菌的序列进行比对，比对结果与pseudomonas hibiscicola高度相似，故该菌命名为栖木假单胞菌(pseudomonas hibiscicola strain)l1。于2021年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为cgmcc no.23319。
46.实施例2菌株栖木假单胞菌l1好氧反硝化去除no
3-‑
n同时去除ni(ii)的特性研究。
47.将栖木假单胞菌l1接种于lb培养基，在30℃和120rpm下预培养24h。之后，将栖木假单胞菌l1以1％(v/v)接种于含有no
3-‑
n浓度为100mg/l、ni(ii)浓度分别为20～100mg/l、
toc(总有机碳)/n为10，ph为7的a、b、c、d、e培养基(在121℃灭菌30min)，在30℃和120rpm条件下进行震荡培养。其中，初始ni(ii)浓度分别是20、40、60、80、100mg/l(分别对应a、b、c、d、e培养基)。定期取上述培养液用于分析od
600
(溶液在600nm波长处的吸光值，表示菌体密度)，并将菌液在8000rpm、4℃下离心10min，取上清液测定ni(ii)、no
3-‑
n和no
2-‑
n浓度，结果如图1所示。
48.从图1a可以看出，菌株l1在初始ni(ii)浓度为20、40、60、80、100mg/l的溶液中都能生长。菌株的od
600
在48h左右达到最高值。其中，菌株l1在ni(ii)浓度为60mg/l时生长最好。从图1b中可以看出，在初始ni(ii)浓度分别为20、40、60、80、100mg/l的溶液中，120h时ni(ii)的去除率分别达到32.55％、23.57％、19.81％、17.96％和15.51％。从图1c可以看出，在不同ni(ii)浓度的培养液中，好氧培养120h后硝酸盐下降到74～82mg/l(no
3-‑
n的去除率可达18％～26％)，且亚硝酸盐积累较少(图1d)。这是由于本发明的栖木假单胞菌l1能以硝态氮作为电子受体，以好氧反硝化的方式将废水中no
3-‑
n转化成n2和n2o等气态产物从水体中去除。并且本发明的栖木假单胞菌l1对不同浓度的ni(ii)均表现出较好的耐受性，能够去除溶液中的ni(ii)。ni(ii)通过与细菌表面官能团c
–
o、
–
cho、
–
nh、酰胺、
–
no2、
–
oh和醚等结合以从水中去除，其结合的络合物的形态主要是nico3，ni(oh)2·
2h2o，ni(nh2)2。也就是说，本发明的栖木假单胞菌l1能够应用于处理含硝酸盐和重金属镍的有机废水。
49.实施例3菌株栖木假单胞菌l1好氧反硝化去除no
3-‑
n同时去除重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的特性研究
50.将栖木假单胞菌l1以1％(v/v)接种于含重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的dm培养基。该培养基中no
3-‑
n浓度为100mg/l，ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)浓度各为20mg/l。将上述培养液在30℃和120rpm条件下进行震荡培养。分别于0h、12h、24h、48h、72h、96h、120h取上述培养液分析od
600
，再将菌液在8000rpm，4℃下离心10min，取上清液用于ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)、no
3-‑
n、no
2-‑
n以及ph测定，结果如图2所示。
51.从图2a中可以看出，栖木假单胞菌l1在处理含硝酸盐和重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的有机污水时，菌株生长良好，od
600
在48h左右达到最高值。随着反硝化作用的进行，ph值从7上升到8.86，污染物浓度逐渐下降(图2b)。在120h时，重金属去除率依次为ni(ii)(50.33％)》cr(vi)(38.21％)》cu(ii)(21.25％)；硝酸盐浓度降至46.05mg/l(no
3-‑
n的去除率可达54％左右)。由此可知，栖木假单胞菌l1对于含no
3-‑
n和重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的污水具有良好的去除效果。与相同浓度下含硝酸盐和单一重金属ni(ii)的有机污水相比，在重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)共存时，栖木假单胞菌l1仍具有良好的生长性能，且具有更高的硝酸盐和ni(ii)去除能力。当栖木假单胞菌l1应用于处理同时含有硝酸盐、ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)四种污染物的有机废水时，栖木假单胞菌l1不仅能以硝态氮作为电子受体，对硝酸盐进行还原去除；其还能以cr(vi)作为电子受体，通过微生物内的cr还原酶将cr(vi)还原成毒性较低的cr(iii)，生成络合物crpo4吸附在细菌的表面，从而达到降低水体中cr污染的目的；同时能将ni(ii)、cu(ii)以络合物nico3，niso4(h2o)，ni(oh)2、cu(oh)2、cuso4、cu(po4)(oh3)的形式吸附在细菌的表面。因此，本实施例表明栖木假单胞菌l1具有良好的同步好氧反硝化脱氮以及去除ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的能力，能够用于处理存在硝酸盐和重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)污染的废水。
52.实施例4菌株栖木假单胞菌l1在不同ph条件下好氧反硝化去除no
3-‑
n同时去除重
金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的特性研究
53.将栖木假单胞菌l1接种在含重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的dm培养基中，其中，培养基中硝酸盐氮浓度为100mg/l，ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)浓度各为20mg/l。通过1m hcl或2m naoh调节培养基的ph至5、6、7和8，探究不同ph对脱氮和去除ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的影响。接种后，将其置于30℃、120rpm恒温振荡培养箱中连续好氧培养120h。培养后，测定培养液的od
600
，并于8000rpm、4℃条件下离心10min后测定上清液中no
3-‑
n及ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的含量，结果如图3所示。
54.从图3可以看出，在ph值为5、6、7和8时，ni(ii)的去除率分别是59.90％，60.95％，61.22％，65.54％；cr(vi)的去除率分别是57.56％，42.92％，38.63％，30.05％；cu(ii)的去除率分别是27.63％，22.06％，21.25％，21.13％；硝酸盐的去除率为55.91％，56.83％，53.96％，58.30％。上述结果表明细菌在不同的ph值下都能正常的代谢，并且能够表现出较好的去除重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)和硝酸盐的能力。
55.实施例5菌株栖木假单胞菌l1在生物反应器中去除no
3-‑
n和重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的特性研究。
56.为模拟栖木假单胞菌l1在生物反应器内对含硝酸盐和重金属污水的处理效果，设计了两组完全相同的小型生物反应器以作平行实验，如图4所示。反应瓶(型号：schott，德国)容积为500ml。反应瓶内装有400ml含重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的dm培养基，其中，dm培养基中硝酸盐氮为100mg/l，ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)各20mg/l。处理装置主要包括进水瓶、反应瓶、出水瓶等部件，都通过无菌橡胶软管连接。将整套污水处理生物反应器放置于培养箱以保持30℃恒温。空气进入反应器之前通过无菌滤膜(0.22μm)过滤，空气流速为100～110ml/min。采用蠕动泵控制反应器的进水和出水，采用曝气器和磁力搅拌器进行曝气搅拌。将栖木假单胞菌l1接种于300ml的lb培养基中，在30℃和120rpm下培养24h。之后于8000rpm、4℃条件下离心10min收集菌体，向菌体内加入适量无菌水调整其od
600
为1.0左右，获得栖木假单胞菌l1的活菌含量≥1
×
107cfu/ml的污水处理菌剂。在无菌条件下将污水处理菌剂以0.5％(v/v)的投加量加入反应瓶中进行连续培养。定期取样测定出水的od
600
，并于8000rpm、4℃条件下离心10min后测定上清液中no
3-‑
n、no
2-‑
n、ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)及ph，结果如图5所示。
57.从图5中可以看出，在反应瓶中添加污水处理菌剂后，随着反应器的运行，出水中污染物的浓度逐渐降低。反应器运行120h后，出水中ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)和硝酸盐的浓度分别为11.032、12.644、14.873和69.766mg/l，ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)和硝酸盐的去除率分别可达45％、37％、26％和30％，并且产生了0.834mg/l的亚硝酸盐。说明栖木假单胞菌l1在反应器中仍能对no
3-‑
n及ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)达到有效去除，并且亚硝酸盐的积累量较少，实现对含no
3-‑
n及重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)有机废水的处理。
58.综上，本发明栖木假单胞菌l1及其制备的污水处理菌剂均表现出良好的反硝化脱氮能力和重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)去除能力，且亚硝酸盐积累量很少。这表明菌株l1在处理存在硝酸盐及重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)的复合有机污水方面具有良好的应用前景，不仅适合用于处理含硝酸盐和重金属ni(ii)的有机污水，还适用于处理受硝酸盐和重金属ni(ii)、cr(vi)、cu(ii)污染的复杂水体。
59.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较
佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。