dna”对每条测序结果进行序列比对，比对参数为系统默认参数；
16.(6)结果判断：
17.对引物primer_1扩增的三个品种特异条带序列进行比对，其中含有一个37bp长度的indel标记并且序列为：atttgaacaatagcttcaaagcaaatttatgacctat的品种即为品丽珠，如果无此标记，则对引物primer_2的扩增产物进行比对，其中存在一个含有多个snp标记的片段，当差异片段序列为：ttcattatcgtaatggcctagatctattgcatcgcccttcatcggacc，品种即为赤霞珠，当差异片段序列为：atcattattttaatggaagagattaattgaaatgttgtacatcatgaa，品种即为蛇龙珠。
18.本发明方法是针对赤霞珠、品丽珠和蛇龙珠三个酿酒葡萄品种的亲缘关系较近，早期形态学鉴别难道较大等问题，以三个葡萄品种的全基因组重测序为基础，开发出一组合适这三个品种早期鉴别的snp和indel分子标记组合，可实现对三个品种的快速鉴别，尤其是苗期的鉴别。
附图说明
19.图1为引物primer_1对赤霞珠、品丽珠、蛇龙珠的pcr扩增产物电泳图；
20.图2为引物primer_1对赤霞珠、品丽珠、蛇龙珠的pcr扩增产物部分测序结果；
21.图3为引物primer_2对赤霞珠和蛇龙珠的pcr扩增产物电泳图；
22.图4为引物primer_2对赤霞珠和蛇龙珠的pcr扩增产物部分测序结果。
具体实施方式
23.本发明提供了一种鉴别方法，采用一组用于鉴别酿酒葡萄品种
‘
赤霞珠’、
‘
品丽珠’、
‘
蛇龙珠’的snp和indel分子标记，用于三个品种的鉴别。该方法操作简单，鉴别结果准确，是一种快速鉴别三个品种的可靠方法，尤其适合三个品种的苗期鉴别。
24.1、一种用分子标记鉴别酿酒葡萄品种赤霞珠品丽珠蛇龙珠的方法，
25.(1)dna提取：
26.利用植物dna提取试剂盒对赤霞珠、品丽珠和蛇龙珠三个酿酒葡萄品种的新梢倒2-3叶进行dna提取；
27.(2)pcr扩增：
28.分别利用引物primer_1、引物primer_2两个引物对赤霞珠、品丽珠、蛇龙珠三个品种用步骤(1)提取到的dna进行pcr扩增；
29.(3)pcr扩增产物电泳：
30.采用2％浓度的琼脂糖凝胶对步骤(2)获得的pcr扩增产物进行电泳，电泳液为1
×
tae，电压90v，电泳时间40min，通过凝胶成像系统中观察pcr产物电泳结果；
31.(4)pcr产物测序：
32.将经过步骤(3)的琼脂糖电泳确定的分别含有大小为300bp
±
20bp(primer_1)的pcr产物和大小为300bp
±
5bp左右(primer_2)的pcr产物进行测序，测序要求为测通；
33.(5)测序数据分析：
34.将测序数据转化成fast格式，利用软件mega11中“alignment”功能下的“align dna”对每条测序结果进行序列比对，比对参数为系统默认参数；
35.(7)结果判断：
36.对引物primer_1扩增的三个品种特异条带序列进行比对，其中含有一个37bp长度的indel标记(序列为：atttgaacaatagcttcaaagcaaatttatgacctat)的品种即为品丽珠，如果无此标记，则对引物primer_2的扩增产物进行比对，其中存在一个含有多个snp标记的片段，当差异片段序列为：ttcattatcgtaatggcctagatctattgcatcgcccttcatcggacc，品种即为赤霞珠，当差异片段序列为：atcattattttaatggaagagattaattgaaatgttgtacatcatgaa，品种即为蛇龙珠。
37.实施例1：
38.(1)用于三个品种鉴别的pcr扩增引物序列：
[0039][0040]
(2)pcr反应体系
[0041]
采用天根生物科技有限公司pcr试剂盒，pcr反应体系为50μl，具体成分为：
[0042]
成分浓度体积primer_f10μmol2μlprimer_r10μmol2μl2
×
mix-25μl10
×
buffer-5μltaq酶10u
·
μl-1
2μldna模板20ng
·
μl-1
2μl去离子水-12μl
[0043]
(3)pcr反应程序
[0044]
94℃预变性5min,94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃保温7min，4℃保存备用。
[0045]
(4)pcr产物多态性
[0046]
首先用引物primer_1对三个品种进行pcr扩增，获得大小为311bp左右的扩增产物(详见图1，备注：m为分子marker，1为品丽珠，2为赤霞珠，3为蛇龙珠)，对pcr产物进行测序，测序结果表明：在三个品种中，只有品丽珠有一个长度为37bp(序列为：atttgaacaatagcttcaaagcaaatttatgacctat)的indel标记(详见图2)，可以利用primer_1从三个品种中鉴别出品丽珠。
[0047]
再用引物primer_2对赤霞珠和蛇龙珠进行pcr扩增，获得大小为300bp左右的扩增
产物(详见图3，备注：m为分子marker，1为赤霞珠，2为蛇龙珠)，对pcr产物进行测序，测序结果表明：在两个品种中，有一段序列存在多个snp标记(详见图4)，可以利用primer_2将赤霞珠和蛇龙珠鉴别开来。其中赤霞珠的差异片段序列为：ttcattatcgtaatggcctagatctattgcatcgcccttcatcggacc，蛇龙珠的差异片段序列为：atcattattttaatggaagagattaattgaaatgttgtacatcatgaa。


技术特征：
1.一种用分子标记鉴别酿酒葡萄品种赤霞珠品丽珠蛇龙珠的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)dna提取：利用植物dna提取试剂盒对赤霞珠、品丽珠和蛇龙珠三个酿酒葡萄品种的新梢倒2-3叶进行dna提取；(2)pcr扩增：分别利用引物primer_1、引物primer_2两个引物对赤霞珠、品丽珠、蛇龙珠三个品种用步骤(1)提取到的dna进行pcr扩增；(3)pcr扩增产物电泳：采用2％浓度的琼脂糖凝胶对步骤(2)获得的pcr扩增产物进行电泳，电泳液为1
×
tae，电压90v，电泳时间40min，通过凝胶成像系统中观察pcr产物电泳结果；(4)pcr产物测序：将经过步骤(3)的琼脂糖电泳确定的分别含有大小为300bp
±
20bp的引物primer_1扩增的pcr产物和大小为300bp
±
5bp引物primer_2扩增的pcr产物进行测序，测序要求为测通；(5)测序数据分析：将测序数据转化成fast格式，利用软件mega11中“alignment”功能下的“align dna”对每条测序结果进行序列比对，比对参数为系统默认参数；(6)结果判断：对引物primer_1扩增的三个品种特异条带序列进行比对，其中含有一个37bp长度的indel标记并且序列为：atttgaacaatagcttcaaagcaaatttatgacctat的品种即为品丽珠，如果无此标记，则对引物primer_2的扩增产物进行比对，其中存在一个含有多个snp标记的片段，当差异片段序列为：ttcattatcgtaatggcctagatctattgcatcgcccttcatcggacc，品种即为赤霞珠，当差异片段序列为：atcattattttaatggaagagattaattgaaatgttgtacatcatgaa，品种即为蛇龙珠。

技术总结
本发明涉及一种用分子标记鉴别酿酒葡萄品种赤霞珠品丽珠蛇龙珠的方法。其特点是，包括(1)DNA提取；(2)PCR扩增；(3)PCR扩增产物电泳；(4)PCR产物测序；(5)测序数据分析；(6)结果判断。本发明方法是针对赤霞珠、品丽珠和蛇龙珠三个酿酒葡萄品种的亲缘关系较近，早期形态学鉴别难道较大等问题，以三个葡萄品种的全基因组重测序为基础，开发出一组合适这三个品种早期鉴别的SNP和Indel分子标记组合，可实现对三个品种的快速鉴别，尤其是苗期的鉴别。尤其是苗期的鉴别。


技术研发人员：徐美隆 乔改霞 牛锐敏 谢军 许泽华 刘玉娟 黄小晶 陈卫平 王荣 秦彬彬
受保护的技术使用者：宁夏农林科学院园艺研究所
技术研发日：2021.10.13
技术公布日：2022/2/15