一种光滑假丝酵母sllsm3及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种光滑假丝酵母sllsm3及其应用。


背景技术：

2.菊糖，又称菊粉，属于果聚糖中的一组非消化性碳水化合物，在19世纪早期由德国科学家valentine rose发现，在1817年由thomson命名为菊糖。菊糖的甜度水平约为蔗糖的 10％，与可消化的碳水化合物相比，它仅提供25-35％的能量，现已被美国食药局认为安全的添加剂。目前酶法合成菊糖，以蔗糖为唯一底物，反应体系中仅含有果糖、葡萄糖、蔗糖、低聚果糖等成分，纯化过程简单，产物纯度高。微生物菊糖的生产研究发现l.gasseri dsm20604来源的菊糖蔗糖酶在最适条件下可产生53g/l的菊糖。另外，除了蔗糖，制糖工业的副产品如糖蜜等，也具有作为酶法生产菊糖的潜力。酶法生产菊糖不仅能降低成本，还有利于资源的综合利用。目前的菊糖蔗糖酶活低，催化转化率低本，而发明的发明人自行筛选发现光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株可以会产生高酶活的菊糖蔗糖酶，而且采用光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株培养得到的菊糖蔗糖酶酶液催化蔗糖合成菊糖，具有绿色高效、反应温和的优势。因此，将菌株光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3 专利申请保护有重要的意义。


技术实现要素：

3.本发明克服了上述技术问题，提供一种光滑假丝酵母sllsm3及其应用。
4.本发明的光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株，属于真菌界，子囊菌门，半知菌亚门，芽孢菌纲，假丝酵母属，光滑假丝酵母种。所述光滑假丝酵母(candida glabrata) sllsm3菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctccno：m2021699，保藏日期为2021年6月09日。
5.进一步的，所述光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株从广西来宾甘蔗地的土壤中筛选分离得到。
6.本发明的另一目的还在于保护含有上述光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株的微生物制剂。
7.其中，所述微生物制剂中，所述光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株的活菌数不低于1.0
×
106cfu/ml。
8.本发明的另一目的还在于保护上述光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株在制备菊糖蔗糖酶上的应用。
9.本发明的另一目的还在于保护利用上述光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株制备菊糖蔗糖酶的方法，其包括如下步骤:在无菌操作下，用灭菌接种环将光滑假丝酵母 (candida glabrata)sllsm3菌株接种到已高温灭菌的发酵培养基中，于25-30℃下，采用 120-180r/min摇床恒温发酵培养24h后，取发酵液接入新的发酵培养基中摇床恒温培养 68-72h，经9000-11000r/min、15min离心机离心得到上清液即为菊糖蔗糖酶粗酶
液。
10.优选的方案中，制备菊糖蔗糖酶的方法为：在无菌操作下，用灭菌接种环将光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株接种到已高温灭菌的发酵培养基中，于30℃下，采用 180r/min摇床恒温发酵培养24h后，取发酵液接入新的发酵培养基中摇床恒温培养72h，经 10000r/min、15min离心机离心得到上清液即为菊糖蔗糖酶粗酶液。
11.进一步的，所述发酵培养基配方为：1g酵母膏、2g蛋白胨、2g乳糖、100ml，ph值7。
12.本发明的另一目的还在于保护上述光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株在制备菊糖上的应用。
13.本发明的另一目的还在于保护利用光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株制备菊糖的方法，其包括如下步骤:将保存的光滑假丝酵母光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3 菌活化后获得菌种悬浮液，将菌种悬浮液接种至发酵培养基培养，常温下摇床恒温发酵培养，培养后离心取其上清液；以蔗糖为底物，加入磷酸缓冲液，以上清液作为催化剂，在40℃的摇床中反应即转化制备得到菊糖。
14.其中，所述菌种悬浮液中，光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株的活菌数为不低于1.0
×
106cfu/ml。
15.本发明与现有技术相比较具有以下有益效果：本发明的光滑假丝酵母(candida glabrata) sllsm3菌株可以发酵培养产生菊糖蔗糖酶，酶活最高可达86.82u，菊糖产量达到46.72g/l，酶活高，转化率高。
附图说明
16.图1为本发明光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株菌落图；
17.图2为不同发酵时间对光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3产酶能力的影响图；
18.图3为不同发酵培养基ph对光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3产酶能力的影响图；
19.图4为菌种不同接种量对光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3产酶能力的影响图；
20.图5为不同发酵温度对光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3产酶能力的影响图。
具体实施方式
21.下面结合实施例和试验对本发明作进一步说明。
22.实施例1
23.本发明的光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株，属于真菌界，子囊菌门，半知菌亚门，芽孢菌纲，假丝酵母属，光滑假丝酵母种。所述光滑假丝酵母(candida glabrata) sllsm3菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctccno：m2021699，保藏日期为2021年6月09日。
24.本发明的光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株由如下方法筛选得到：
25.土样取自广西来宾甘蔗地的土壤，以ps培养基形成筛选培养基筛选产菊糖蔗糖酶
的菌株，具体工艺为：
26.菌种初筛：取土壤1g加入装有9ml的无菌生理盐水中，制成10-1
浓度的样品液，震荡混匀后逐级稀释到10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
浓度，静置备用。取后3个稀释度，采用涂布法在ps培养基平板上进行菌种分离，在平板上划线分离，反复纯化，从而得到分离菌株的纯培养物。平板置于4℃冰箱保存。
27.保藏培养基：ps琼脂斜面固体培养基；
28.ps培养基配方：0.5g蔗糖、0.02gkh2po4、0.61gna2hpo4、0.1gnh4cl、0.01g酵母膏、 0.05gmgso4·
7h2o、0.5mgcacl2、琼脂粉1g，100ml蒸馏水,自然ph，121℃湿热灭菌。
29.将上述筛选分离得到的光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株进行如下检测鉴定：
30.1、菌落形态观察：将斜面菌点接至有ps培养基的平皿中，于30℃培养48h，培养得到的光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株菌落形态图如图1所示，观察菌落形态，观察到白色奶油样菌落，柔软、光滑、湿润，有浓厚的酵母气味，营养体细胞出芽生殖，无菌丝。
31.2、菌株的鉴定：将纯化好的菌株送至上海美吉生物医药科技有限公司鉴定。通过 nucleotide blast分析，与光滑假丝酵母菌株的26s r dna序列同源性为100％，可初步确定sllsm3菌株为光滑假丝酵母。
32.一种含有光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株的微生物制剂，并利用所述微生物制剂应用于制备菊糖蔗糖酶或者制备菊糖。其中，所述微生物制剂中的光滑假丝酵母 (candida glabrata)sllsm3菌株的活菌数1.0
×
106cfu/ml。
33.利用上述光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株制备菊糖蔗糖酶的方法，其包括如下步骤:将保存的光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌接种于斜面培养基上，置于 37℃恒温培养箱培养2天，获得活化菌种，用无菌水洗脱菌种获得菌种悬浮液，菌种悬浮液的光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌活菌数为1.0
×
106cfu/ml，将菌种悬浮液接入摇瓶发酵培养基；在无菌操作下，用灭菌接种环接菌到已高温灭菌的发酵培养基中，于30℃下，采用180r/min摇床恒温发酵培养24h后，取发酵液接入新的发酵培养基中摇床恒温培养72h，经10000r/min、15min离心机离心得到上清液即为菊糖蔗糖酶粗酶液。得到的菊糖蔗糖酶粗酶液酶活达到最高值86.82u。
34.上述中的斜面培养基为ps培养基。ps培养基配方为：0.5g蔗糖、0.02gkh2po4、0.61 gna2hpo4、0.1gnh4cl、0.01g酵母膏、0.05gmgso4·
7h2o、0.5mgcacl2、琼脂粉1g，100 ml蒸馏水，自然ph，121℃湿热灭菌。
35.上述中的发酵培养基配方为1g酵母膏，2g蛋白胨，2g乳糖，100ml，ph 7.0，121℃湿热灭菌。
36.利用光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株制备菊糖的方法，其包括如下步骤: 在上述获得菊糖蔗糖酶粗酶液的基础上，以100g的蔗糖为底物，加入100ml的磷酸缓冲液，以20ml的酶液作为催化剂，在40℃的摇床中反应8h。菊糖产量达到46.72g/l。
37.光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株产酶条件优化
38.(1)研究发酵时间对产酶的影响
39.以发酵培养基接种光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株，在温度为30
℃、ph7、装液量100ml/250ml、接种量10％，转速180r/min的条件下分别发酵36、48、60、72、84h 取上清液测酶活。
40.所述发酵培养基为改良ypd培养基；
41.改良ypd培养基：1g酵母膏，2g蛋白胨，2g乳糖、100ml，ph 7.0，121℃湿热灭菌。
42.检测得到的酶活结果如表1和图2：
43.表1不同发酵时间对光滑假丝酵母产酶能力
44.项目36h48h60h72h84h酶活(u/ml)32.0242.7453.6377.6761.75
45.(2)研究发酵培养基ph对酶活的影响
46.以发酵培养基接种光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株，将发酵培养基的初始ph盐酸调为5、6、7、8、9，取上清液测酶活。配制成液体培养基在摇床上30℃，转速180r/min，发酵培养72h，取出发酵液10000rpm离心10min，取其上清液测酶活。
47.检测得到的酶活结果如表2和图3：
48.表2不同发酵培养基ph对光滑假丝酵母产酶能力
49.项目ph(5)ph(6)ph(7)ph(8)ph(9)酶活(u/ml)41.9663.5473.5466.9751.78
50.(3)研究接种量对产酶的影响
51.以发酵培养基接种光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株，将菌种分别以6％、8％、 10％、12％、14％的接种量接种。配制成液体培养基在摇床上30℃，转速180r/min，发酵培养 72h，取出发酵液10000rpm离心10min，取其上清液测酶活。
52.检测得到的酶活结果如表3和图4：
53.表3菌种不同接种量对光滑假丝酵母产酶能力
54.项目6％8％10％12％14％酶活(u/ml)67.9380.1965.2051.9741.78
55.(4)研究发酵温度对产酶的影响
56.以发酵培养基接种光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株，在ph7、装液量 100ml/250ml、接种量10％，转速180r/min的条件下分别在25、28、30、35、37℃发酵72h 取上清液测酶活。
57.检测得到的酶活结果如表4和图5：
58.表4菌种不同发酵温度对光滑假丝酵母产酶能力
59.项目25℃28℃30℃35℃37℃酶活(u/ml)55.7263.5273.5461.6441.78
60.以上检测得到的酶活数据可以确定光滑假丝酵母(candida glabrata)sllsm3菌株发酵产酶的最佳条件条件为：发酵时间72h，接种量量为8％，发酵温度为30℃，酵母膏1g、蛋白胨2g、乳糖2g、100ml水，初始ph为7.0。
61.上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。