一类促进猪机体产生广谱性免疫应答的多肽及其应用
1.本技术是申请日为2020年08月26日、申请号为cn202010871941.8、发明名称为《一类促进猪机体产生广谱性免疫应答的多肽及其应用》的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一类促进猪机体产生广谱性免疫应答的多肽及其应用。


背景技术：

3.免疫增强剂是一类单独或与抗原配合使用，通过增强巨噬细胞活性、增强抗原物质的免疫原性和稳定性以及促进各类免疫因子和特异性抗体的合成与分泌等方式，从而增强动物机体免疫应答的物质。
4.免疫增强剂能够刺激机体体内产生由体液介导和细胞介导的免疫反应，从而达到消灭入侵的病原体，保护动物不受病原体的危害。
5.免疫增强剂的种类繁多，按照其成分特性大体上主要分为三大类：中草药提取物、化学合成物和细胞因子类。目前用于猪病疫苗的免疫增强剂较少。有报道将cvc1320作为口蹄疫疫苗的免疫增强剂(免疫增强剂提高猪口蹄疫灭活疫苗免疫效力的研究，于晓明，2019)，但是该免疫增强剂为复方制剂，成分复杂，而且使用剂量大，生产成本相对较高。而且该制剂只是验证能够应用于fmdv疫苗，并没有数据证明其具有广谱效应。唐波等(免疫增强剂提升猪用灭活疫苗免疫效力的研究，2016)用含va5免疫增强剂作为猪细小、乙脑二联灭活疫苗伴侣，能够提高抗体效价，但是没有数据证明其具有广谱效应。目前，缺少迫切需要一种促使猪机体产生广谱性免疫应答的免疫增强剂。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一类促进猪机体产生广谱性免疫应答的多肽及其应用，本发明的多肽能够通过促进猪机体中单核巨噬细胞、t细胞和b细胞分泌ifn-γ从而促使猪机体产生广谱性免疫应答，并且该多肽能够作为asfv亚单位疫苗的有效成分，增强猪的免疫应答。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了一类促进猪机体产生广谱性免疫应答的多肽；所述多肽包括第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽中的一种或几种；
9.所述第一多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示；
10.所述第二多肽的氨基酸序列如seq id no.2所示；
11.所述第三多肽的氨基酸序列如seq id no.3所示；
12.所述第四多肽的氨基酸序列如seq id no.4所示；
13.所述第五多肽的氨基酸序列如seq id no.5所示；
14.所述多肽通过同时促进猪机体中淋巴细胞和单核巨噬细胞增殖来促进猪机体产
生广谱性免疫应答。
15.优选的，所述淋巴细胞包括脾脏淋巴细胞、外周血t细胞和外周血中的b细胞。
16.优选的，所述单核巨噬细胞包括脾脏单核巨噬细胞和外周血单核巨噬细胞。
17.本发明提供了一类由上述方案所述多肽聚合得到的多肽聚合物。
18.本发明提供了上述方案所述多肽或者所述多肽聚合物在制备促进猪机体产生广谱性免疫应答的制剂中的应用。
19.本发明提供了上述方案所述多肽或者所述多肽聚合物在制备促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的制剂中的应用。
20.本发明提供了一种猪的免疫增强剂，所述免疫增强剂的活性成分包括上述方案所述多肽或者所述多肽聚合物。
21.优选的，所述免疫增强剂中所述多肽或者所述多肽聚合物的含量为100μg/组分/头份。
22.本发明提供了一种非洲猪瘟病毒的亚单位疫苗，所述非洲猪瘟病毒的亚单位疫苗包括上述方案所述多肽或者所述多肽聚合物。
23.优选的，所述亚单位疫苗中所述多肽或者所述多肽聚合物的含量为100μg/组分/头份。
24.本发明的有益效果：本发明提供了一类促进猪机体产生广谱性免疫应答的多肽；所述多肽包括第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽中的一种或几种；所述第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽的氨基酸序列分别如seq id no.1～seq id no.5所示。本发明的多肽能够通过同时促进猪机体中淋巴细胞和单核巨噬细胞增殖，从而促使猪机体产生广谱性免疫应答；并且，本发明的多肽能够促进猪体内asfv抗原特异性免疫应答，因而能够作为asfv亚单位疫苗的有效成分，增强猪的免疫应答。
附图说明
25.图1为ap1的鉴定色谱图；
26.图2为ap1的质谱图；
27.图3为ap2的鉴定色谱图；
28.图4为ap2的质谱图；
29.图5为ap3的鉴定色谱图；
30.图6为ap3的质谱图；
31.图7为ap4的鉴定色谱图；
32.图8为ap4的质谱图；
33.图9为ap5的鉴定色谱图；
34.图10为ap5的质谱图；
35.图11为ap1～ap5促asfv致敏淋巴细胞及单核巨噬细胞增殖的流式数据统计图；
36.图12为ap1～ap5促健康猪淋巴细胞及单核巨噬细胞增殖的流式数据统计图；
37.图13为ap1促进不同亚型免疫细胞分泌ifn-γ的水平；
38.图14为ap2促进不同亚型免疫细胞分泌ifn-γ的水平；
39.图15为ap3促进不同亚型免疫细胞分泌ifn-γ的水平；
40.图16为ap4促进不同亚型免疫细胞分泌ifn-γ的水平；
41.图17为ap5促进不同亚型免疫细胞分泌ifn-γ的水平；
42.图18为二免14d，b淋巴细胞亚群比例水平；
43.图19为cd8
+
t淋巴细胞亚群比例水平；
44.图20为二免14d，b淋巴细胞亚群比例水平；
45.图21为cd8
+
t淋巴细胞亚群比例水平。
具体实施方式
46.本发明提供了一类促进猪机体产生广谱性免疫应答的多肽；所述多肽包括第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和第五多肽中的一种或几种；所述多肽通过通过同时促进猪机体中淋巴细胞和单核巨噬细胞增殖来促进猪机体产生广谱性免疫应答；所述淋巴细胞优选的包括脾脏淋巴细胞、外周血t细胞和外周血中的b细胞；所述单核巨噬细胞优选的包括脾脏单核巨噬细胞和外周血单核巨噬细胞。
47.在本发明中，所述第一多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体为：kmrieifwel(lys-met-arg-ile-glu-ile-phe-trp-glu-leu)，平均分子量为1364.65g/mol，化学式为：c
65h101n15o15
s。该多肽的理论等电点为ph 7，该多肽的gravy值为0.12，具有疏水性。该特性利于其与宿主蛋白或细胞表面进行结合，能够更为有效的启动免疫应答。
48.在本发明中，所述第二多肽的氨基酸序列如seq id no.2所示，具体为：rsmmmvfnql(arg-ser-met-met-met-val-phe-asn-gln-leu)，平均分子量为1256.56g/mol，化学式为：c
53h89n15o14
s3。该多肽的理论等电点为ph 11.05，该多肽的gravy值为0.42，具有疏水性，该特性利于其与宿主蛋白或细胞表面进行结合，能够更为有效的启动免疫应答。
49.在本发明中，所述第三多肽的氨基酸序列如seq id no.3所示，具体为：ygialqyvl(tyr-gly-ile-ala-leu-gln-tyr-val-leu)，平均分子量为1039.22g/mol，化学式为：c
51h78n10o13
。该多肽的理论等电点为ph7，该多肽的gravy值为1.29，具有疏水性，该特性利于其与宿主蛋白或细胞表面进行结合，能够更为有效的启动免疫应答。
50.在本发明中，所述第四多肽的氨基酸序列如seq id no.5所示，具体为：ifnfieniws(ile-phe-asn-phe-ile-glu-asn-ile-trp-ser)，平均分子量为1282.44g/mol，化学式为：c
63h87n13o16
。该多肽的理论等电点为ph 3.28，该多肽的gravy值为0.69，具有疏水性。
51.在本发明中，所述第五多肽的氨基酸序列如seq id no.4所示，具体为：ytemlalii(tyr-thr-glu-met-leu-ala-leu-ile-ile)，平均分子量为1066.31g/mol，化学式为：c
50h83
n9o
12
s。该多肽的理论等电点为ph 3.28，该多肽的gravy值为1.64，具有疏水性，该特性利于其与宿主蛋白或细胞表面进行结合，能够更为有效的启动免疫应答。
52.在本发明中，上述技术方案所述的多肽是通过对asfv流行毒株序列进行测定，并通过计算机辅助生物信息学预测获得，具有特异性。
53.在本发明中，所述多肽优选的由上海生工生物工程股份有限公司合成得到。
54.本发明提供了一种包括上述方案所述多肽的多肽聚合物。
55.本发明提供了上述方案所述多肽或者所述多肽聚合物在制备促进猪机体产生广谱性免疫应答的制剂中的应用。
56.在本发明中，所述多肽或者所述多肽聚合物通过同时促进猪机体中淋巴细胞和单核巨噬细胞增殖来促进猪机体产生广谱性免疫应答。
57.本发明提供了上述方案所述多肽或者所述多肽聚合物在制备促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答的制剂中的应用；所述多肽或者所述多肽聚合物通过促进猪机体的脾脏淋巴细胞和单核巨噬细胞增殖来促进猪机体产生非洲猪瘟病毒抗原特异性免疫应答。
58.本发明提供了一种猪的免疫增强剂，所述免疫增强剂的活性成分包括上述方案所述多肽或者所述多肽聚合物；所述免疫增强剂中所述多肽或者所述多肽聚合物的含量优选为100μg/组分/头份，即每种多肽或每种多肽聚合物的含量均为100μg/头份。
59.本发明提供了一种非洲猪瘟病毒的亚单位疫苗，所述非洲猪瘟病毒的亚单位疫苗包括上述方案所述多肽或者所述多肽聚合物；所述亚单位疫苗中所述多肽或者所述多肽聚合物的含量优选为100μg/组分/头份，即每种多肽或每种多肽聚合物的含量均为100μg/头份。
60.本发明上述方案所述制剂或者上述方案所述免疫增强剂或者上述方案所述亚单位疫苗的剂型分别包括注射剂。
61.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
62.实施例1多肽的固相合成及纯度检测
63.本发明的多肽如下：
64.seq id no.1：kmrieifwel；
65.seq id no.2：rsmmmvfnql；
66.seq id no.3：ygialqyvl；
67.seq id no.4：ifnfieniws；
68.seq id no.5：ytemlalii；
69.上述多肽由上海生工生物工程股份有限公司合成。
70.检测波长为214nm。得到最终的多肽提纯产物纯度》98％，并经esi-ms鉴定结构，鉴定结果参见图1～图10，其中图1为ap1的鉴定色谱图，图2为ap1的质谱图，鉴定分子量为1364.85g/mol，与理论值相符；图3为ap2的鉴定色谱图，图4为ap2的质谱图，鉴定分子量为1256.6g/mol，与理论值相符；图5为ap3的鉴定色谱图，图6为ap3的质谱图，鉴定分子量为1039.6g/mol，与理论值相符；图7为ap4的鉴定色谱图，图8为ap4的质谱图，鉴定分子量为1282g/mol，与理论值相符；图9为ap5的鉴定色谱图，图10为ap5的质谱图，鉴定分子量为1066.6g/mol，与理论值相符。由图1～图10可知，成功合成了上述5条多肽。
71.实施例2猪淋巴细胞增殖实验
72.1、asfv灭活病毒免疫猪。
73.用asfv流行毒株灭活病毒(来源于中国农业科学院兰州兽医研究所非洲猪瘟区域实验室)(10hid50)免疫5只90日龄雄性长白猪，一个月后加强免疫一次，7天后对猪执行安乐死，解剖后取出脾脏。用未免疫的健康猪作为阴性对照组。
74.2、脾细胞的制备、培养及增殖情况检测。
75.1)用75％酒精对采取的猪脾脏进行无菌处理，pbs清洗三次后，将脾脏剪成小块，置于折叠的无菌纱布(2层)中，并在含5ml含血清1640培养基的平皿中研磨脾脏。
76.2)之后吸取液体于15ml离心管中，1000rpm，离心5min。
77.3)弃去上清，敲击沉淀物(细胞)使其均匀悬浮。
78.4)加入10ml红细胞裂解液，裂解10min，之后加入6ml含血清1640培养基终止裂解，混匀后1000rpm，离心5min。
79.5)弃去上清，再次敲击沉淀物使其均匀悬浮，之后取10μl悬浮液稀释40倍，进行细胞计数，调整细胞浓度为1
×
106个细胞/ml。
80.6)cfse染色后，将制备好的脾细胞接种到24孔板中(1
×
106个细胞/孔)。
81.7)分别加入0.2μg本发明提供的第一多肽～第五多肽，置于co2培养箱中培养60h，流式细胞术检测asfv抗原特异性脾细胞增殖情况。
82.检测结果参见图11。图11为ap1～ap5促asfv致敏淋巴细胞及单核巨噬细胞增殖的流式数据统计图。由图11可知，本发明的5条多肽均能显著促进asfv特异性脾免疫细胞增殖，免疫细胞的主要类型为单核巨噬细胞。
83.同样的方式处理健康猪脾淋巴细胞，检测该多肽对猪机体内非抗原特异性脾细胞增殖的影响。
84.检测结果参见图12。图12为ap1～ap5促健康猪单核巨噬细胞增殖的流式数据统计图。由图12可知，本发明的5条多肽也能显著促进健康猪脾免疫细胞增殖。说明该5条多肽具有广谱促进猪免疫力的作用。
85.实施例3不同亚型脾淋巴细胞分泌ifn-γ的情况检测。
86.猪免疫程序及脾细胞分离培养同实施例2。获得分散的脾细胞后，以rpmi1640完全培养基制备成单细胞悬液，浓度为1
×
106/ml。接种到24孔板中，每孔加入0.2μg本发明提供的多肽，置于co2培养箱中培养60h。收集每孔细胞，分别用猪cd3、cd4、cd8及ifn-γ特异性抗体标记细胞，之后用含2％血清的pbs缓冲液洗涤2次，最后用该洗涤液分散成细胞悬液，利用流式细胞仪检测、分别确定cd4
+
t淋巴细胞和cd8
+
t淋巴细胞分泌ifn-γ的水平。
87.检测结果参见图13～图17。其中图13为ap1促进不同亚型免疫细胞分泌ifn-γ的水平；图14为ap2促进不同亚型免疫细胞分泌ifn-γ的水平；图15为ap3促进不同亚型免疫细胞分泌ifn-γ的水平；图16为ap4促进不同亚型免疫细胞分泌ifn-γ的水平；图17为ap5促进不同亚型免疫细胞分泌ifn-γ的水平；由图13～图17可知，本发明中的五条多肽均能显著增强单核巨噬细胞分泌ifn-γ的能力。
88.实施例5多肽免疫动物免疫细胞分型实验
89.用本发明中的5条多肽混合(每种多肽100μg/头份)免疫3只90日龄雄性长白猪，一个月后加强免疫一次，二免后14d流式细胞仪检测外周血中免疫细胞的比例。同样体积pbs免疫组作为对照。
90.检测结果参见图18～图19。其中图18为二免14d，b淋巴细胞亚群比例水平；图19为cd8
+
t淋巴细胞亚群比例水平。由图18～图19可知本发明中的5条多肽混合免疫能够促进猪机体产生淋巴细胞免疫应答，增强猪的免疫力。
91.实施例6多肽作为免疫增强剂免疫动物免疫细胞分型实验
92.用口蹄疫o/mya98/by/2010毒株灭活疫苗或灭活疫苗加本发明中的5条多肽混合(每种多肽100μg/头份)免疫3只90日龄雄性长白猪，一个月后加强免疫一次，二免后14d流式细胞仪检测外周血中免疫细胞的比例。同样体积pbs免疫组作为对照。
93.检测结果参见图20～图21，其中图20为二免14d，b淋巴细胞亚群比例水平；图21为cd8
+
t淋巴细胞亚群比例水平。由图20～图21可知本发明中的5条多肽能够增强猪口蹄疫疫苗淋巴细胞免疫应答的水平，提高了疫苗的免疫原性。
94.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。