一种用于精确分离大鼠kiss1神经元的方法
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，具体是一种用于精确分离大鼠kiss1神经元的方法；


背景技术：

2.青春期是人类发育过程中最重要的阶段之一，青春期生殖轴(下丘脑-垂体-性腺轴，hypothalamic pituitary gonadal axis，hpg)的活化，性激素的急剧增加，使得组织器官结构、生理及心理上都经历着巨大变化；青春期性发育异常可能与日后生长发育、生殖、内分泌、代谢以及精神心理性疾病的发生密切相关，是生殖内分泌研究重点关注的热点之一；促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，gnrh)节律性分泌是青春期性发育启动的标志；目前研究认为，gnrh神经元的发育及功能启动，受中枢神经系统内众多调控因子和细胞间信号传导系统调控；其中，kiss1 metastasis suppressor(kiss1)基因编码的kisspeptin蛋白及对应受体kiss1 receptor(又称gpr54)被认为是调控gnrh神经元分泌gnrh最关键作用因子；具体表现为分布在下丘脑弓状核位置的kiss1神经元合成kisspeptin蛋白，通过旁分泌的形式将蛋白作用于gnrh神经元；gnrh神经元表面gpr54受体响应kisspeptin，进而通过激活gαq/11偶联k离子通道使gnrh神经元持续去极化，从而对hpg轴发挥调控作用；因此表达并分泌kisspeptin的kiss1神经元是目前探索青春期性成熟中下丘脑神经内分泌网络触发机制的研究热点之一，也是研究和治疗性发育异常疾病的重要作用对象之一。
3.研究青春期性发育的常见动物模型有啮齿类动物中的sprague dawley品系大鼠(文中简称sd大鼠)；一般认为该大鼠出生后25天(postnatal day 25，文中简称pnd25)，35天(文中简称pnd35)和45天(文中简称pnd45)分别对应人的幼年期，青春发育期和完全性成熟期；人们通过研究不同生长发育时间点的sd大鼠的下丘脑组织，结合血液内促黄体素(luteinizing hormone，lh)、促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone，fsh)以及阴门形态等指标对hpg轴激活和沉默的细胞和生化机制开展研究；目前为止，人们一般通过免疫荧光(immunofluorescence，if)或荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，fish)对整个下丘脑进行kisspeptin等重要标志物染色，关注富含kiss1神经元的弓状核区域进行kisspeptin及其他蛋白的检测工作；但这种方法无法将kiss1神经元单独分离开来；许多研究涉及到高通量基因测序或芯片时，常常只能将弓状核所在的大致位置甚至整个下丘脑进行检测，这样做毫无疑问会把其他类型的神经元带入研究体系，极大地影响了最终的结果；为了解决这个问题，人们构建了绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，gfp)或者β半乳糖苷酶转基因大鼠，常见的方法有在kiss1基因的启动子和kiss1基因间插入一个gfp或者β半乳糖苷酶，使kiss1神经元在表达kiss1基因的同时也会表达gfp或β半乳糖苷酶，最终形成kisspeptin的融合蛋白，再分离出gfp或β半乳糖苷酶阳性的细胞，实现获得kiss1神经元的目的；但是转基因大鼠存在的问题主要有三个方面，一、表达不稳定，来自不同实验室的研究数据显示，gfp或β半乳糖苷酶会出现在下丘脑
非弓状核区域造成假阳性，也会在应该表达的时候表达丰度却非常低；二、kisspeptin-gfp融合蛋白很可能会造成kisspeptin的n端或c端蛋白结构异常，导致功能失活；三、造价昂贵，转基因大鼠需要拥有动物房的实验室不间断地进行饲养繁殖用以保种，目前这种转基因大鼠全球只有少数几家实验室拥有，并不普及；因此人们缺乏一种可以精确分离kiss1神经元的方法，且这种方法所需要的平台、仪器和技术可以为大部分实验室所接受。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种用于精确分离大鼠kiss1神经元的方法，以解决上述背景技术中提出的问题；
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于精确分离大鼠kiss1神经元的方法，所述方法包括如下步骤：
6.一种用于精确分离大鼠kiss1神经元的方法，所述方法包括如下步骤：
7.步骤一、找出kiss1神经元细胞膜上特异性表达蛋白质对应的基因；
8.s11、用oct包埋剂包埋sd大鼠全脑后充分冷却；
9.s12、将经过s11处理过的sd大鼠下丘脑切片；
10.s13、将切片放置在空间转录组文库构建专用载玻片的捕获区域内，对切片进行固定和透化，使细胞中所有的rna释放并结合到相应的捕获探针上，将捕获的这些rna为模板，进行cdna合成，制备测序文库；对制备好的测序文库，进行二代高通量短读长测序；
11.s14、根据每个点集中所有能检测到的基因表达的显著性差异将捕获区域的点降维聚类，选择kiss1具有显著高表达的点集，根据这一点集中所有能检测到的基因表达的显著性差异进一步降维聚类，选择kiss1显著高表达的子集；筛选出slc18a3作为kiss1显著高表达子集的细胞膜表达特异性标志物，slc18a3基因为sequence listing id no.1所示的核苷酸序列；
12.步骤二、根据slc18a3蛋白采用流式细胞术分选下丘脑中弓状核区域中的kiss1神经元细胞，slc18a3蛋白为sequence listing id no.3所示的氨基酸序列，具体步骤如下：
13.s21、取下丘脑中弓状核区域处理成单细胞悬液，将单细胞悬液在含10％胎牛血清、1％叠氮化钠的冰冷磷酸盐缓冲盐溶液溶液中重悬细胞至约5x 106细胞/ml；
14.s22、将s21得到的重悬细胞液加入slc18a3蛋白抗体冰上避光孵育；
15.s23、将s22得到的避光孵育后的细胞液离心后在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，重复操作3次；
16.s24、向s23得到的细胞液加入抗兔fitc二抗冰上避光孵育；
17.s25、将s24得到的细胞液离心后在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，重复操作3次；
18.s26、向s25得到的细胞液加入7-氨基放线菌素d，常温孵；
19.s27、采用流式分选仪进行流式分选。
20.作为本发明的一种优选技术方案，上述步骤一的s12中切片为前囱间距为2.52～2.92mm，双耳间距为6.08～6.48mm所在位置的组织。
21.作为本发明的一种优选技术方案，上述步骤一的s14中特异性基因筛选方法具体如下：借助生物信息学手段分析和找到kiss1具有显著高表达的子集相对于其它三个子集具有显著性表达的基因，在这些基因中选取表达的蛋白处于kiss1神经元细胞膜上的基因。
22.作为本发明的一种优选技术方案，上述步骤二的s27中流式分选方法具体为首先去除黏连细胞，然后去除7-氨基放线菌素d阳性的死细胞，最后去除碎片，并同时获得fsc large和fsc small两群细胞，分别为神经元和胶质细胞，然后对两群细胞进行分选，获得特异性蛋白阳性的胶质细胞、特异性蛋白阴性的胶质细胞、特异性蛋白阳性的神经元细胞和特异性蛋白阴性的神经元细胞，其中特异性蛋白阳性的神经元细胞为目标细胞；
23.作为本发明的一种优选技术方案，上述步骤一中冷却温度为-80℃。
24.作为本发明的一种优选技术方案，上述步骤一的s12中将sd大鼠下丘脑置于-20℃的冰冻切片机内，切片厚度为10μm。
25.作为本发明的一种优选技术方案，上述步骤一的s14中根据全基因表达的显著性程度将捕获区域的点降维聚类后分为14个点集，选择kiss1具有显著高表达的点集，根据全基因表达的显著性程度对这一点集进一步降维聚类成4个子集。
26.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
27.本发明通过提供一种通过kiss1神经元细胞膜上特异性表达蛋白质对应的基因的方法提取kiss1神经元活细胞，对野生型sd大鼠实现了kiss1神经元精准分离。与现有技术相比，本发明提供的提取方法在实施过程中无需养殖转基因大鼠，实验成本低，适宜推广；此外，根据本发明提供的kiss1神经元提取方法获得的kiss1神经元细胞为活细胞，不会破坏细胞、细胞内部的核酸和蛋白质，提取出的kiss1神经元细胞可用于后续细胞和分子实验。
附图说明
28.图1为1-14点集在25天sd大鼠的脑切片空间位置上的分布示意图；
29.图2为1-14点集在35天sd大鼠的脑切片空间位置上的分布示意图；
30.图3为1-14点集在45天sd大鼠的脑切片空间位置上的分布示意图；
31.图4为kiss1神经元在不同点集中表达水平的小提琴图；
32.图5为本发明中第九点集降维得出4个子集样本间t-sne分组展示图；
33.图6为本发明中pnd25大鼠弓状核流式分选中除游离的单细胞占比图；
34.图7为本发明中pnd25大鼠弓状核流式分选中选取7-氨基放线菌素d阳性的活细胞占比图；
35.图8为本发明中pnd25大鼠弓状核流式分选中fsc/ssc结果图；
36.图9为本发明中pnd25大鼠弓状核流式分选中fsc large细胞群进一步分选结果图；
37.图10为本发明中pnd35大鼠弓状核流式分选中除游离的单细胞占比图；
38.图11为本发明中pnd35大鼠弓状核流式分选中选取7-氨基放线菌素d阳性的活细胞占比图；
39.图12为本发明中pnd35大鼠弓状核流式分选中fsc/ssc结果图；
40.图13为本发明中pnd35大鼠弓状核流式分选中fsc large细胞群进一步分选结果图；
41.图14为本发明中pnd45大鼠弓状核流式分选中除游离的单细胞占比图；
42.图15为本发明中pnd45大鼠弓状核流式分选中选取7-氨基放线菌素d阳性的活细
胞占比图；
43.图16为本发明中pnd45大鼠弓状核流式分选中fsc/ssc结果图；
44.图17为本发明中pnd45大鼠弓状核流式分选中fsc large细胞群进一步分选结果图。
具体实施方式
45.为了使本领域的技术人员更好地理解本技术方案，下面将结合本技术实施例中的附图对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分的实施例，而不是全部的实施例；基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动成果前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本技术保护的范围；
46.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合，下面将结合实施例来详细说明本技术。
47.实施例1
48.本发明提供了一种用于精确分离大鼠kiss1神经元的方法，具体如下。
49.找出kiss1神经元细胞膜上的特异性表达蛋白质：
50.s1、取出生后25天(文中简称pnd25)，出生后35天(文中简称pnd35)和出生后45天(文中简称pnd45)的sd大鼠的完整下丘脑各1只，将全脑后基底部置于标本座底部，用oct包埋剂(thermo fisher scientific制造)均匀涂抹直至将全脑完全覆盖，放-80
°
充分冷却；
51.s2、将冷却后的下丘脑置于-20
°
冰冻切片机内，刀锋垂直于大脑纵裂，前囱2.52-2.92mm，双耳6.08-6.48mm所在位置进行冠状面切片，切片厚度为10μm；
52.s3、将切片安置在10x genomics空间转录组文库构建专用载玻片的捕获区域上，取三份不同年龄的大鼠的下丘脑切片分别放置于同一载玻片的不同捕获区域，每个捕获区域的大小为6.5x6.5mm，每个捕获区域包含5000个被条形码标记的点(barcoded spots)，每个点的直径为55μm，相邻点的中心距离为100μm，每个点上含有捕获探针，每个点中所有探针都有一个唯一barcode序列；对切片进行固定和透化，将细胞中的rna释放，并结合到相应的捕获探针上；以捕获的rna为模板，进行cdna合成，测序文库制备；对制备好的测序文库，进行二代高通量短读长测序。不同时间点样本的space ranger定量质控的高质量spot数目分布在3894～4317个，每个spot中的平均umi数分布在26546～33158，每个spot中的平均基因数分布在4881～5312，每个spot中平均线粒体基因比例分布在27.22％～28.26％。
53.s4、根据每个点集中所有能检测到的基因表达的显著性差异将s3中的每份捕获区域的点簇降维聚类后分为14个点集，图1-3反映的是不同点集在样本空间切片位置上的分布示意图，图中各个区域由若干不连续的点圈成；图中所标数字为该位置对应的点集编号，图1是25天sd大鼠的脑切片示意图；图2是35天sd大鼠的脑切片示意图，图3是45天sd大鼠的脑切片示意图；由图1-3可知，每个点集中的点在切片中的位置基本上是连续的。14个点集中的kiss1神经元表达丰度结果如图4所示，其中第九点集中kiss1神经元表达丰度最高，结合图1-3可知，第九点集中的所有点位于下丘脑切片中弓状核区域，这与现有研究结果弓状核区域kiss1神经元含量最高一致；
54.根据每个点集中所有能检测到的基因表达的显著性差异将第九点集进一步降维
聚类成4个子集，结果如图5中四个曲线圈出的区域所示，图5中曲线区域内的数字对应子集标号；对4个子集中的kiss1基因表达差异进行统计，选择kiss1显著高表达的子集，具体统计方法如下：将每个子集中的kiss1表达相对于其它三个子集的表达差异统计出来；具体计算方法为某一子集的kiss1表达在该子集中的表达量与剩余三个子集中的表达量的平均值的比值；p值表示基因表达蛋白差异的统计学意义的值，表示3个样本所得的表达差异的值的离散程度，根据统计学知识可知，p值小于0.05时，所得到的数据是具有统计学意义的；对这4个子集的kiss1基因表达量差异比较发现，kiss1在1号子集中的表达显著高于其他3个子集的1.417倍，p值3.58x10-24，说明kiss1神经元主要集中在9号点集上的1号子集中；kiss1基因为sequence listing id no.2所示的核苷酸序列；
55.接着筛选出1号子集中表达显著性明显高于其它三个子集的基因。筛选方法如下，将1号子集中的所有基因相对于其它三个子集的表达差异统计出来，具体计算方法为1号子集的基因在该子集中的表达量与在剩余三个子集中的表达量的平均值的比值，比值越大，说明基因的表达差异越大，即说明该基因越能够作为该子集的特异性基因。最后筛选出slc18a3基因。slc18a3基因为sequence listing id no.1所示的核苷酸序列；slc18a3蛋白是溶质载体18家族a亚科3号成员，全称为solute carrier family 18member a3，通用名称为slc18a3。slc18a3蛋白为sequence listing id no.3所示的氨基酸序列；slc18a3蛋白是一种跨膜蛋白，负责细胞膜上的氨基酸、核苷酸、糖、无机离子和药物的吸收和运输。slc18a3蛋白的表达差异为6，p值为5.10e-18，说明slc18a3蛋白在1号子集的表达量是其他3个子集表达量的平均值的6倍，所以slc18a3是位于kiss1神经元细胞膜上的特异性基因；p值小于0.05时，所以该表达差异倍数是具有统计学意义的。
56.采用流式细胞术分选pnd25 sd大鼠下丘脑中弓状核区域中高表达slc18a3蛋白的kiss1神经元细胞。用neural tissue dissociation kits(美天旎，130-092-628)和gentle macs tm octo dissociator with heaters将30只大鼠下丘脑弓状核位置所在的组织处理成单细胞悬液，然后将单细胞悬液在含10％胎牛血清、1％叠氮化钠的冰磷酸盐缓冲盐溶液溶液中重悬细胞至约5
×
106细胞/ml；接着加入30μl slc18a3抗体(abclonal，制造)冰上避光孵育30min；孵育结束后以400g的速度离心5min，然后在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，离心重悬操作共重复3次；接着加入15μl抗兔fitc二抗(abcam制造)，冰上避光孵育30min；以400g的速度离心5分钟，然后在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，离心重悬操作共重复3次；加入5μl 7-氨基放线菌素d(碧云天制造)，常温孵育15min；采用ariaiii流式分选仪(becton,dickinson and company制造)进行流式分选，流式分选方法具体为首先采用fsca/h，设门去除黏连细胞，将脑组织分成一个个游离的细胞，结果如图6中框线内部区域所示，游离的细胞占细胞总数的比例为70.88％；然后去除7-氨基放线菌素d阳性的死细胞，得到7-氨基放线菌素d阳性的活细胞，结果如图7所示，7-氨基放线菌素d阳性的活细胞占游离的细胞总数的89.48％；接着使用fsc/ssc(fsc是forward scatter的通用简称，表示前向散射光，这个参数和细胞的大小成正比；ssc是side scater的简称，代表的是侧向散射光，这个参数反映的是细胞的复杂程度，比如细胞内部有多少颗粒)，设门去除碎片，根据fsc参数将细胞分为大小两群，fsc参数大的那群叫fsc large细胞群，fsc参数小的叫fsc small细胞群，获得fsc large和fsc small两群细胞，结果如图8中框线区域所示，其中fsc large细胞为神经元，占7-氨基放线菌素d阳性的活细胞总数的31.17％，fsc small细胞为胶质细胞，占7-氨
基放线菌素d阳性的活细胞总数的31.74％；然后对fsc large细胞群进行分选，结果如图9中p5对应的框线所示，其中slc8a3阳性的神经元细胞占fsc large细胞总数的27.42％，所以slc8a3阳性的神经元细胞的占总下丘脑工装和区域的细胞总数比例为5.4％。
57.实施例2
58.实施例2中找出kiss1神经元细胞膜上的特异性表达蛋白质与实施例1相同，本实施例中不再详述。
59.采用流式细胞术分选pnd35 sd大鼠下丘脑中弓状核区域中具有slc18a3蛋白的kiss1神经元细胞。用neural tissue dissociation kits(美天旎，130-092-628)和gentle macs tm octo dissociator with heaters将30只大鼠下丘脑弓状核位置所在的组织处理成单细胞悬液，然后将单细胞悬液在含10％胎牛血清、1％叠氮化钠的冰磷酸盐缓冲盐溶液溶液中重悬细胞至约5
×
106细胞/ml；接着加入30μl slc18a3抗体(abclonal，制造)冰上避光孵育30min；孵育结束后以400g的速度离心5min，然后在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，离心重悬操作共循环3次；接着加入15μl抗兔fitc二抗(abcam制造)，冰上避光孵育30min；以400g的速度离心5分钟，然后在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，离心重悬操作共循环3次；加入5μl 7-氨基放线菌素d(碧云天制造)，常温孵育15min；采用ariaiii流式分选仪(becton,dickinson and company制造)进行流式分选，流式分选方法具体为首先采用fsca/h，设门去除黏连细胞，将脑组织分成一个个游离的细胞，结果如图10中框线内部区域所示，游离的细胞占细胞总数的比例为63.25％；然后去除7-氨基放线菌素d阳性的死细胞，得到7-氨基放线菌素d阳性的活细胞，结果如图11所示，7-氨基放线菌素d阳性的活细胞占游离的细胞总数的84.79％；接着使用fsc/ssc(fsc是forward scatter的通用简称，表示前向散射光，这个参数和细胞的大小成正比；ssc是side scater的简称，代表的是侧向散射光，这个参数反映的是细胞的复杂程度，比如细胞内部有多少颗粒)，设门去除碎片，根据fsc参数将细胞分为大小两群，fsc参数大的那群叫fsc large细胞群，fsc参数小的叫fsc small细胞群，获得fsc large和fsc small两群细胞，结果如图12中框线区域所示，其中fsc large细胞为神经元，占7-氨基放线菌素d阳性的活细胞总数的16.26％，fsc small细胞为胶质细胞，占7-氨基放线菌素d阳性的活细胞总数的47.85％；然后对fsc large细胞群进行分选，结果如图13中p5对应的框线所示，其中slc8a3阳性的神经元细胞占fsc large细胞总数的35.35％，所以slc8a3阳性的神经元细胞的占总下丘脑工装和区域的细胞总数比例为3.08％。
60.实施例3
61.实施例3中找出kiss1神经元细胞膜上的特异性表达蛋白质与实施例1相同，本实施例中不再详述。
62.采用流式细胞术分选pnd45 sd大鼠下丘脑中弓状核区域中具有slc18a3蛋白的kiss1神经元细胞。用neural tissue dissociation kits(美天旎，130-092-628)和gentle macs tm octo dissociator with heaters30只大鼠下丘脑弓状核位置所在的组织将载玻片上的下丘脑组织处理成单细胞悬液，然后将单细胞悬液在含10％胎牛血清、1％叠氮化钠的冰磷酸盐缓冲盐溶液溶液中重悬细胞至约5
×
106细胞/ml；接着加入30μl slc18a3抗体(abclonal，制造)冰上避光孵育30min；孵育结束后以400g的速度离心5min，然后在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，离心重悬操作共循环3次；接着加入15μl抗兔fitc二抗(abcam制造)，冰上避光孵育30min；以400g的速度离心5分钟，然后在冰磷酸盐缓冲盐溶液中重悬，离心重
悬操作共循环3次；加入5μl 7-氨基放线菌素d(碧云天制造)，常温孵育15min；采用ariaiii流式分选仪(becton,dickinson and company制造)进行流式分选，流式分选方法具体为首先采用fsca/h，设门去除黏连细胞，将脑组织分成一个个游离的细胞，结果如图14中框线内部区域所示，游离的细胞占细胞总数的比例为62.15％；然后去除7-氨基放线菌素d阳性的死细胞，得到7-氨基放线菌素d阳性的活细胞，结果如图15所示，7-氨基放线菌素d阳性的活细胞占游离的细胞总数的93.13％；接着使用fsc/ssc(fsc是forward scatter的通用简称，表示前向散射光，这个参数和细胞的大小成正比；ssc是side scater的简称，代表的是侧向散射光，这个参数反映的是细胞的复杂程度，比如细胞内部有多少颗粒)，设门去除碎片，根据fsc参数将细胞分为大小两群，fsc参数大的那群叫fsc large细胞群，fsc参数小的叫fsc small细胞群，获得fsc large和fsc small两群细胞，结果如图16中框线区域所示，其中fsc large细胞为神经元，占7-氨基放线菌素d阳性的活细胞总数的18.11％，fsc small细胞为胶质细胞，占7-氨基放线菌素d阳性的活细胞总数的44.62％；然后对fsc large细胞群进行分选，结果如图17中p5对应的框线所示，其中slc8a3阳性的神经元细胞占fsc large细胞总数的47.94％，所以slc8a3阳性的神经元细胞的占总下丘脑工装和区域的细胞总数比例为5.02％.。
63.64.65.66.67.68.69.70.71.72.73.74.75.76.77.78.79.[0080][0081]
以上所述的，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。