1.本技术涉及微生物技术领域，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌以及利用解 淀粉芽孢杆菌制备酱甜香烟草的方法。


背景技术：

2.四甲基吡嗪是由吡嗪环和四个甲基所构成的含氮杂环化合物，又名川穹 嗪，主要存在于伞形科植物根茎中。四甲基吡嗪因其广泛存在于豆制品、发 酵品、白酒中，具有发酵、烘烤、可可等香气。目前，四甲基吡嗪多应用于 白酒中。
3.1962年kousuge等人首次公开，在日本传统发酵食品纳豆中分离得到四 甲基吡嗪，且具有豆酱、酱油的发酵味道，nicholas等人从发酵的可可豆中发 现了四甲基吡嗪，证实了微生物发酵生成四甲基吡嗪方法是可行的。besson 等人用大豆研磨液为基质，利用枯草芽孢杆菌发酵且外源添加乙偶姻和苏氨 酸，14天后四甲基吡嗪含量达0.58g/l，就此提出了四甲基吡嗪是由乙偶姻 和氨合成的。因此作为四甲基吡嗪的前体物质乙偶姻的含量也是四甲基吡嗪 产量的重要指标。
4.申请公布号为cn102766592a的中国专利文件公开了一株可用于生产四 甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌，但其应用于酿酒过程中，并未关注菌株在酱香 型发酵液的制备以及烟草行业中的应用。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本技术从高温大曲中分离筛选出一株解淀粉芽 孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)，该菌株具有高效生物转化葡萄糖产四甲 基吡嗪的能力，并且可以烟叶为底物生产酱甜香风格烟叶，填补了酱甜香风 格烟叶制备的技术空白，为微生物发酵产酱甜香型风味产品提供一定的理论 依据。因此，本发明的目的之一是提供一株制备酱甜香风格烟叶的解淀粉芽 孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)imau 1-13，及该解淀粉芽孢杆菌可以生 物转化葡萄糖生产四甲基吡嗪。该菌具有对外抵抗能力强，生长繁殖快等优 点，十分适用于酱甜香风格烟叶及四甲基吡嗪的生产，并填补了酱甜香风格 烟叶制备用菌方面的技术空白。
6.一方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌，该解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）imau 1-13，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2021733（保藏单位地址：中国. 武汉. 武汉大学；保藏日期：2021年6月25日。菌落颜色为不透明淡黄色，表面粗糙，中间略有拱起，菌落边缘不规则。
7.另一方面，包含所述解淀粉芽孢杆菌的菌剂。
8.另一方面，所述的解淀粉芽孢杆菌和/或所述的菌剂在生产四甲基吡嗪中 的应用。
9.进一步的，利用葡萄糖和/或烟草作为生产四甲基吡嗪的发酵底物。
10.进一步的，利用葡萄糖和/或烟草生产四甲基吡嗪的方法包括：将所述解 淀粉芽孢杆菌的菌液接种至含有葡萄糖和/或烟草的培养基中，摇瓶培养，生 产四甲基吡嗪；
11.优选的，所述摇瓶培养中，控制初始ph为6.5～7.0，优选7.0；接种量为 4％～5％，优选5％；摇瓶装液量为10％～30％，优选20％；发酵温度为35℃ ～40℃，优选40℃；摇瓶转速为170～200r/min，优选180r/min；铵盐添加量为 30～50g/l，优选50g/l。
12.在一种优选的实施方式中，菌株imau 1-13于葡萄糖培养基的最佳发酵条 件为：在初始ph 7.0、发酵温度39℃、接种量5％、装液量20％(三角瓶容 量250ml)、摇床转速180r/min、铵盐添加量50g/l的条件下四甲基吡嗪产 量可达166.19mg/l。
13.另一方面，利用所述的解淀粉芽孢杆菌制备酱甜香烟草的方法，所述方 法包括利用所述解淀粉芽孢杆菌处理烟草的步骤；
14.优选的，所述烟草包括烟叶、烟梗、烟丝和烟末。
15.进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌采用解淀粉芽孢杆菌菌液，所述处理烟 草的方式包括喷洒。
16.进一步的，将所述解淀粉芽孢杆菌菌液喷洒至烟草原料进行固态发酵培 养；
17.优选的，所述解淀粉芽孢杆菌菌液的浓度为10万～100万cfu/ml，优选 为60万～70万cfu/ml；喷洒量为10％，控制烟草原料水分20％～25％，发酵 温度为38.5℃～40℃，空气湿度75％～85％，发酵时间45～50h，获得所述酱甜 香烟草。
18.在一种优选的实施方式中，发酵条件是39℃，湿度80％，物料水分 22％，发酵时间48h，发酵液中菌株imau 1-13添加量为10％。
19.另一方面，所述的方法制备获得的酱甜香烟草。
20.另一方面，所述的酱甜香烟草在制备烟草产品中的应用。
21.本发明具有如下有益效果：
22.1、本发明公开了一种可以制备酱甜香风格烟叶的解淀粉芽孢杆菌 (bacillus amyloliquefaciens)imau 1-13，在本发明之前，未有报道显示解淀 粉芽孢杆菌可以在发酵烟叶制备酱甜香风格烟叶，本发明的菌株为其制备提 供了一种新的途径，填补了酱甜香风格烟叶制备的技术空白。为酱甜香型烟 草制品提供了新的途径。
23.2、本发明的菌株可以在葡萄糖培养基中生产四甲基吡嗪，其中，发酵液 中四甲基吡嗪含量最大可达到166.19mg/l。为四甲基吡嗪的提取和生产提供 了新的工程菌株。在此过程中还能够产生乙偶姻、2-3丁二醇、丁酸乙酯、乳 酸乙酯、4-乙基愈创木酚、香兰素等物质。
24.3、本发明所生产的四甲基吡嗪不仅具有生产成本低、反应条件温和、对 环境污染小等优点，也进一步解决了前体物质乙偶姻化率低下的问题。
25.4、本发明中解淀粉芽孢杆菌参与的制备酱甜香型烟叶及生产四甲基吡嗪 应用途径具有原料丰富易得、生产成本低、生产工艺简单、安全清洁、无污 染等优点。
附图说明
26.此处所说明的附图用来提供对本技术的进一步理解，构成本技术的一部 分，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的 不当限定。在附图中：
27.图1是四甲基吡嗪标准曲线图；
28.图2是菌株imau 1-13的16s rdna pcr扩增结果图，注：m.dna标准 分子量；1.菌株imau 1-13的pcr扩增产物；
29.图3是菌株imau 1-13系统发育树图，其中1-13指imau 1-13菌株；
30.图4是初始ph对四甲基吡嗪产量的影响图；
31.图5是接种量对四甲基吡嗪产量影响图；
32.图6是装液量对四甲基吡嗪产量影响图；
33.图7是发酵温度对四甲基吡嗪产量影响图；
34.图8是转速对四甲基吡嗪产量影响图；
35.图9是铵盐添加量对四甲基吡嗪产量影响图；
36.图10是初始ph和发酵温度交互作用对四甲基吡嗪含量影响的响应面和 等高线图；
37.图11是铵盐添加量和发酵温度交互作用对四甲基吡嗪含量影响的响应面 和等高线图；
38.图12是铵盐添加量和初始ph交互作用对感官评分影响的响应面和等高 线图；
39.图13发酵烟叶中特征物质含量变化图。
具体实施方式
40.为了更清楚的阐释本技术的整体构思，下面结合说明书附图以实施例的 方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本 发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发 明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与 本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
41.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
42.如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商 者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
43.其中：葡萄糖，磷酸氢二铵，氯化钠由天津市智远化学试剂有限公司提 供；胰蛋白胨，酵母提取粉，琼脂由广东桓凯微生物科技有限公司提供；甲 醇(hplc)，三氟乙酸(hplc)由天津市广大化学试剂有限公司提供；四甲 基吡嗪(hplc)，乙偶姻(ar)由阿拉丁试剂(上海)有限公司提供；洁净 工作台hcb-1300v由上海一恒科学仪器有限公司；恒温振荡器thz-98c由上 海一恒科学仪器有限公司提供；全自动高压灭菌锅sx-500由上海新普仪器设 备有限公司提供；电热恒温鼓风干燥箱dhg-9053a由上海一恒科学仪器有限 公司提供；真空抽滤装置由天津津腾实验设备有限公司提供；sigma高速离心 机3-18ks由上海成贯仪器有限公司提供；液相色谱仪u3000由上海赛默飞世 尔科技提供；气相色谱质谱联用仪7890由安捷伦科技有限公司提供；pcr仪 veriti96由上海赛默飞世尔科技提供；酶标仪synergy h1由美国伯腾仪器有限 公司提供。
44.该菌株名为解淀粉芽孢杆菌imau 1-13，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2021733（保藏单位地址：中国. 武汉. 武汉大学；保藏日期：2021年6月25日）。菌落颜色为不透明淡黄色，表面粗糙，中间略有拱起，菌落边缘不规则。
45.四甲基吡嗪定性、定量分析：发酵液中四甲基吡嗪定性采用气相色谱质 谱联用仪
进行定性分析。发酵液中四甲基吡嗪含量用高效液相色谱法进行定 量分析，具体色谱条件参考陈梦圆文章(参考文献：陈梦圆,李志军,罗爱民. 高温大曲中高产四甲基吡嗪菌株的筛选及鉴定[j].酿酒科技,2018(8):6.)，其中 流速调整为0.5ml/min。
[0046]
残糖的测定：用3.5-二硝基水杨酸比色法测定发酵液中残糖含量，制作 葡萄糖标准曲线回归方程：y＝0.8906x-0.016，r2＝0.9995
[0047]
菌体量的测定：稀释发酵液以蒸馏水为空白对照，在600nm处测得吸光 度，用od值表示菌体量。
[0048]
下述实施例所涉及的培养基具体成分比配比如表1所示。
[0049]
表1培养基成分表
[0050][0051]
发酵培养基：胰蛋白胨30g/l、磷酸氢二铵30g/l、酵母提取粉10g/l、 葡萄糖50g/l(115℃条件下灭菌20min)，ph 7.0，121℃条件下灭菌20 min。
[0052]
实施例1菌株的筛选分离
[0053]
s1：称研磨后的高温大曲10g，加入装有90ml无菌生理盐水的三角瓶 中，在37℃、180r/min条件下振荡培养1h，将制成的菌悬液在80℃条件下 水浴30min。
[0054]
s2：配置10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
稀释梯度，分别取0.1ml涂布于 lb固体培养基上，在37℃条件下倒置培养24h。
[0055]
s3：选取培养基上长势良好，且菌落形态特征明显的单菌落在lb固体培 养基上进行平板划线，37℃倒置培养24h。编号后的单菌落接入斜面培养 基，37℃培养24h后，4℃保存备用。
[0056]
培养基具体配比见表1中lb固体培养基、斜面培养基。
[0057]
实施例2生产四甲基吡嗪菌株筛选
[0058]
将四甲基吡嗪标品制成不同浓度梯度制作标准曲线。图1为四甲基吡嗪 标准曲线的回归方程：y＝1.0412x-1.6985，r2＝0.9979。
[0059]
将筛选得到约103株疑似芽孢杆菌分别接入装有50ml发酵培养基(以葡 萄糖为底物)250ml摇瓶中，在37℃、180r/min条件下振荡培养72h。发酵 结束后将发酵液用70％的甲醇稀释并提取，10000r/min离心10min，上清液 过0.22um有机滤膜。高效液相检测对上清液中四甲基吡嗪定量分析。将发酵 液5000r/min离心10min，取上清液用95％的乙醇萃取，气质色谱质谱联用 仪对上清液中成分定性分析。利用外标法根据四甲基吡嗪标准曲线，计算各 菌株上清液中四甲基吡嗪含量，结果见表2。发酵液经高效液相色谱测得103 株菌中，有59株菌可以葡萄糖为底物发酵产四甲基吡嗪，其中菌株imau 1
‑ꢀ
13含量明显较高，故将imau 1-13菌株作为实验研究对象。
[0060]
表2发酵液中四甲基吡嗪含量检测结果
[0061][0062][0063]
将菌株imau 1-13的发酵液离心，用95％乙醇提取，用气相色谱质谱联用 仪检测发酵液中四甲基吡嗪。通过检测和图谱解析确定发酵液中含有四甲基 吡嗪、乙偶姻、丁酸乙酯、乳酸乙酯、2-3丁二醇、4乙基愈创木酚和香兰素 等物质，结果如表3所示。由此可见，本发明的菌株除可以生产四甲基吡嗪 外，还能产生乙偶姻、2-3丁二醇、丁酸乙酯、乳酸乙酯、4-乙基愈创木酚、 香兰素。
[0064]
表3发酵液其他风味物质含量
[0065][0066]
实施例3菌株的分类鉴定
[0067]
将保藏菌株接于lb培养基中活化，取2ml菌液在10000r/min条件下离 心10min，收集菌体后提取细菌基因组，利用细菌通用引物1492r和27fpcr进行扩增。pcr反应体系(25μ
l)：加上、下游引物各1.0μl，mix 12.5 μl，dna模板1.0μl，ddh2o 9.5μl。pcr程序：94℃预变性10min，在此 基础上进行30个循环，条件如下，95℃变性30s，55℃退火50s，72℃延 伸1.5min，最后72℃延伸10min。pcr结束后，取1μl dna依次点入1％ 琼脂糖凝胶孔中，120v电压，电泳20min。确定目的条带后，送往上海生物 工程有限公司测序。在ncbi数据库对测序结果进行blast比对，选取同源 性高的序列用mega10.0软件构建系统发育树，得到目标菌种系统发育情 况。
[0068]
将筛选出的菌株imau 1-13提取细菌基因组进行16s rdna基因序列扩 增，图2为菌株imau 1-13的琼脂糖电泳。
[0069]
采用mega10.0软件对测得的序列进行分析，构建系统发育树，构建结 果如图3所示，系统发育学分析显示菌株imau 1-13与bacillusamyloliquefaciens的16s rdna序列相似性达99.4％。
[0070]
实施例4产四甲基吡嗪发酵条件研究
[0071]
前期的筛选和鉴定后，将高产菌株imau 1-13作为本发明的下一步试验菌 株。为提高四甲基吡嗪的产量，从以下6个方面进行单因素试验。
[0072]
初始ph对四甲基吡嗪含量的影响：
[0073]
ph作为发酵水平的一项重要影响因素与微生物的生长代谢相关，ph过 高或过低都不利于其生长繁殖。在细菌生成过程中最适ph的范围为6.5-7.5， 本实验对发酵培养基的初始ph进行了控制。
[0074]
以初始ph作为变量进行单因素实验。具体操作方法为：将培养基初始 ph值调至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。发酵结束后，检测发酵液中四甲基吡 嗪、乙偶姻、生物量、残糖量，考察初始ph对菌株发酵情况影响。以四甲基 吡嗪含量为指示值，确定产四甲基吡嗪最佳ph值，结果如图4所示。
[0075]
由图4可知，当ph值在6.0-7.0时，四甲基吡嗪的产量与ph值成正比。 四甲基吡嗪在ph 7.0时，含量达到最大值为125.48mg/l。当ph值为7.0-8.0 时，四甲基吡嗪的产量与ph值成反比。此时，作为四甲基吡嗪前体物质乙偶 姻产量在ph7.0时积累到最高点为854.12mg/l，为四甲基吡嗪合成提供了保 证。生物量随着ph的增加逐渐减少，残糖量在ph 7.0时最低，因此当ph值 为7.0，最适合四甲基吡嗪合成。
[0076]
接种量对四甲基吡嗪产量的影响：
[0077]
接种量的多少影响着四甲基吡嗪的合成以及发酵周期长短。
[0078]
以接种量作为变量进行单因素实验。具体操作方法为：以2％、4％、 6％、8％、10％接种量接入培养基。发酵结束后，检测发酵液中四甲基吡嗪、 乙偶姻、生物量、残糖量，考察接种量对菌株发酵情况影响。以四甲基吡嗪 含量为指示值，确定产四甲基吡嗪最佳接种量，结果如图5所示。
[0079]
由图5可知，随着接种量的增大，四甲基吡嗪呈先增加后减少的趋势。 当接种量为5％时，四甲基吡嗪含量达到最大值为84.31mg/l。在此之后，接 种量增大乙偶姻含量也随着增大，而四甲基吡嗪的含量并没有增加反而减 少，可能的原因是，接种量过大使菌体大量增殖，产生了过多的代谢副产 物，降低了四甲基吡嗪的产生。因此当接种量为5％时，最适合四甲基吡嗪合 成。
[0080]
装液量对四甲基吡嗪产量的影响：
[0081]
细胞在进行物质代谢的同时也进行着能量代谢，在摇瓶发酵过程中，装 液量的多少影响着代谢物质的产量。
[0082]
以装液量作为变量进行单因素实验。具体操作方法为：在250ml三角瓶 中，设置装液量为10％、20％、30％、40％、50％。发酵结束后，检测发酵液 中四甲基吡嗪、乙偶姻、生物量、残糖量，考察发酵温度对菌株发酵情况影 响。以四甲基吡嗪含量为指示值，确定产四甲基吡嗪最佳装液量，结果如图6 所示。
[0083]
由图6可知，随着装液量的增大，四甲基吡嗪含量呈先上升后下降的趋 势，当装液量为20％四甲基吡嗪含量达到最大值为83.55mg/l，乙偶姻产量 也达到最大值为835.27ml/l。之后，生物量随着装液量的增加而减少。残糖 量在装液量为20％时最低。综上可能的原因是当装液量太少时，水分蒸发菌 液粘稠不利于生成四甲基吡嗪。当装液量过多时，液体与空气接触面积太 小，溶氧量过低影响了细胞代谢产物四甲基吡嗪的合成。因此当装液量为 20％时，最适合四甲基吡嗪合成。
[0084]
发酵温度对四甲基吡嗪产量的影响：
[0085]
温度对微生物的生长代谢有着重要的影响。在四甲基吡嗪合成过程中， 关键酶对温度的要求很高，合适的温度会使酶的活性增强，加速反应的进 行，从而影响四甲基吡嗪合成。
[0086]
以发酵温度作为变量进行单因素实验。具体操作方法为：设置发酵温度 为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃。发酵结束后，检测发酵液中四甲基吡 嗪、乙偶姻、生物量、残糖量考察发酵温度对菌株发酵情况影响。以四甲基 吡嗪含量为指示值，确定产四甲基吡嗪最佳发酵温度，结果如图7所示。
[0087]
由图7可得，四甲基吡嗪产量随着温度的增大呈先增加后减少的趋势， 当温度为40℃时，四甲基吡嗪含量达到最大值为132.06mg/l。此时乙偶姻 含量达到最高值794.12mg/l，残糖量最低。在此之后，生物量随着温度的增 加逐渐减少。综上可能原因是温度过高或过低使参与反应的酶活性减弱，细 胞逐渐衰亡，从而影响四甲基吡嗪合成。因此当发酵温度为40℃时，最适合 四甲基吡嗪合成。
[0088]
摇瓶转速对四甲基吡嗪产量的影响：
[0089]
影响溶氧的另一个因素是转速，转速过高和过低都不利于四甲基吡嗪的 合成。
[0090]
以摇瓶转速作为变量进行单因素实验。具体操作方法为：设定摇瓶转速 为140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min。发酵结束后，检 测发酵液中四甲基吡嗪、乙偶姻、生物量、残糖量，考察摇瓶转速对菌株发 酵情况影响。以四甲基吡嗪含量为指示值，确定产四甲基吡嗪最佳摇瓶转 速，具体结果如图8所示。
[0091]
由图8可知，四甲基吡嗪的含量，随着转速的增大呈增加后减少的趋 势。当转速为180r/min时，四甲基吡嗪的含量达到最大值为73.99mg/l，此 时乙偶姻的含量为792.38mg/l，残糖量最低。综上可能的原因是转速过低 时，溶氧量低，不利于细胞的生长代谢。转速过高时，会对细胞造成损伤， 影响了四甲基吡嗪的合成。因此当转速为180r/min时，最适合四甲基吡嗪合 成。
[0092]
铵盐添加量对菌株产四甲基吡嗪的影响：
[0093]
解淀粉芽孢杆菌代谢氨的能力有限，因此可以通过补加铵盐的方法提高 乙偶姻的转化率，增加四甲基吡嗪的产量。
[0094]
以铵盐添加量作为变量进行单因素实验。具体操作方法为：试验中当前 体物质乙偶姻达到最大浓度时，一次性加入不同浓度的铵盐，浓度分别为20 g/l、30g/l、40g/l、50g/l、60g/l。发酵结束后，检测发酵液中四甲基吡 嗪、乙偶姻、生物量、残糖量，考察铵盐添加量对菌株发酵情况影响。以四 甲基吡嗪含量为指示值，确定产四甲基吡嗪最佳铵盐添加量，具体结果如图9 所示。
[0095]
根据本试验前期得到的结果，发酵液在第六天时乙偶姻产量达到最值， 选择在第六天一次性加入磷酸氢二氨。由图9可知，随着铵盐添加量的增 加，四甲基吡嗪呈先增加后减少的趋势。在铵盐浓度为50g/l时四甲基吡嗪 含量达到最大值为155.08mg/l。铵盐添加量在20-40g/l时，磷酸氢二铵作 为缓冲溶液，使得发酵液的ph值趋于稳定，负责合成乙偶姻的乙酰乳酸合成 酶被激活，乙偶姻的含量增加。当铵盐添加量大于50g/l时，四甲基吡嗪产 量不再增加，这可能的原因是前体物质的乙偶姻的积累量不足以支持四甲基 吡嗪合成。乙偶姻含量的不足可能由于活细胞量少，以及为细胞生物代谢提 供能量的消耗。生物量随着磷酸氢二铵添加浓度的增加而减少，残糖的浓度 随着铵盐浓度的增加而增加，可能的原因是高浓度的铵盐抑制了细胞的生长 代谢。因此当铵盐添加量为50g/l时，最适合四甲基吡嗪合成。
[0096]
实施例5优化四甲基吡嗪发酵条件
[0097]
在单因素试验结果基础上，以box-behnken法进行了响应面试验研究， 考察各因素对菌株imau 1-13发酵产四甲基吡嗪含量的影响。其中发酵温度、 初始ph、铵盐添加量为响应变量，四甲基吡嗪为响应值。试验因素及水平如 表4所示，试验结果与分析如表5所示。
[0098]
表4box-behnken试验设计因素水平表
[0099][0100]
表5box-behnken试验结果
[0101][0102]
将得到的实验结果用design-expertv8.0.6软件，进行多元回归拟合分 析，得到
四甲基吡嗪含量对各因素的二次回归方程：y＝167.39
‑ꢀ
12.64a+12.53b+0.99c+8.83ab-0.89ac-4.89bc-38.85a
2-64.26b
2-28.87c2，对此 方程方差分析结果如表6所示。
[0103]
表6方差分析
[0104][0105][0106]
注：“**”表示影响极显著(p《0.01)。
[0107]
结果由表6可知，该模型p《0.01表明此模型极显著，失拟项 p＝0.0812》0.05不显著，表明模型可较好地拟合试验情况。回归系数 r2＝0.9816，拟合性良好，98.16％的四甲基吡嗪产量变化可以用此回归模型解 释，可较好反应出四甲基吡嗪与发酵温度、初始ph、铵盐添加量之间的关 系。r2adj＝0.9580，说明四甲基吡嗪产量有95.80％受试验因素影响。综上所 述，以四甲基吡嗪为响应值建立的四甲基吡嗪最佳发酵工艺模型，可对四甲 基吡嗪产量进行分析和预测。
[0108]
由表中f值可知，初始ph值和温度对四甲基吡嗪产量影响显著，铵盐添 加量对四甲基吡嗪产量影响不显著，各因素对四甲基吡嗪产量影响的程度 为：a》b》c。即：发酵温度＞初始ph＞铵盐添加量。
[0109]
根据回归方程绘制出响应面和等高线。通过响应面图的倾斜程度，等高 线的形状。分析发酵温度、初始ph、铵盐添加量的两两交互作用对四甲基吡 嗪产量的影响。
[0110]
由图10可知，当铵盐添加量不变，ph值处于最值时。随着温度的增 加，四甲基吡嗪含量，呈先增加后减少的趋势。当温度处于最值时，四甲基 比情含量也呈相同趋势。响应面开口向下，等高线为椭圆形，表明ph值和温 度之间有交互作用。
[0111]
由图11可知，当ph值不变，温度处于最值时，随着补加铵盐含量的增 加，四甲基吡嗪值变化不大，说明氨盐对四甲基吡嗪的影响较小。当铵盐处 于最值时，随着温度的增加，四甲基吡含量呈先增加后减少趋势。响应面开 口向下，等高线形状为椭圆形，表明铵盐和温度之间有交互作用。
[0112]
由图12可知，当温度不变时，铵盐处于最值，随着ph的增加，四甲基 吡嗪含量呈先增大后减少趋势。当ph值为最大值时，随着铵盐的增加，四甲 基吡嗪呈先增加后减少趋势，但是变化较为平缓。响应面呈开口向下的抛物 线，等高线为椭圆形，说明两因素有交互作
用。
[0113]
根据试验结果和模型分析，得到预测的发酵产四甲基吡嗪的最佳工艺参数为：发酵温度39.23 ℃、初始ph 7.04、铵盐添加量50.12 g/l。在此条件下四甲基吡嗪产量为168.90 mg/l。为了便于实际操作，将最佳发酵条件定为发酵温度39 ℃、初始ph 7.0、铵盐添加量50 g/l。在此条件下，取三次试验的平均值与预测值比较，结果如图13所示，在发酵第六天加入乙偶姻，保证了前体物质的供应使得四甲基吡嗪大量增加。四甲基吡嗪产量为166.19 mg/l，与理论值偏差1.60%。
[0114]
实施例8发酵烟叶的感官评价
[0115]
利用菌株imau 1-13的菌液发酵烟草原料，将菌株imau 1-13的菌液喷洒 到烟叶上，进行烟叶原料固态发酵培养。发酵条件为39℃，湿度80％，物料 水分22％，发酵48h，发酵液中菌株imau 1-13添加量为烟草原料质量的 10％。
[0116]
通过化学分析发酵前后烟叶原料酱甜香风味物质含量的变化和通过感官 评价确定酱甜香风格的提高程度。
[0117]
随机抽选33位专业感官评价人员，对菌株imau 1-13发酵处理前后的烟 叶香气进行感官质量评价。由专业感官评价人员对烟叶香气的感官质量打 分，再取平均值作为最后得分，所得感官质量评价评分结果如表7所示。感 官评价结果如表7所示，发酵前烟叶杂气明显，甜感微弱，酱香风格较弱， 而添加菌株imau 1-13的发酵液发酵的烟叶，即发酵后烟叶香气木质气变弱， 甜感明显提高，烟叶酱甜香风格明显增加。
[0118]
表7烟叶风格感官评价结果
[0119][0120]
烟叶发酵前后特征物质含量变化结果如表8、图13所示，烟叶发酵前后 酱香、甜香特征物质四甲基吡嗪、乙偶姻含量明显增加，2-3丁二醇及丁酸乙 酯含量也有所提高。
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表8烟叶发酵前后特征物质含量变化结果
[0122][0123]
以上所述仅为本技术的实施例而已，并不用于限制本技术。对于本领域 技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原理之 内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的权利要求范围 之内。