1.本发明属于基因的功能与应用领域，具体涉及一种硫胺素相关蛋白基因的用途。


背景技术：

2.苯乙醇(phenethyl alcohol)是一种具玫瑰气味的芳香醇，作为香料广泛用于食品、日化和轻工等领域。苯乙醇香气香甜柔和，是使用量仅次于香兰素的香料，其被用于各种食品香精、酒用香精和烟用香精的配制，是玫瑰等植物中不可或缺的风味物质。色醇(tryptophol)，分子式c
10h11
no，分子量为161.20，广泛存在于葡萄酒和啤酒等饮料中，是一种具有多种功效的吲哚衍生物，具有促进睡眠，抑制病原真菌生长和作为吲哚乙酸的前体物质等作用。
3.苯乙醇和色醇分别主要有2条生物合成路径：苯丙氨酸和色氨酸分别在转氨酶作用形成相应酮酸，然后在脱羧酶作用下形成相应醛，最后通过醇脱氢酶催化分别生成苯乙醇和色醇；以葡萄糖酵解产生的磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤藓糖为起始底物，经莽草酸途径生成分支酸，分支酸经几步酶促反应分别生成苯丙氨酸和色氨酸，后者再经第一条路径合成苯乙醇和色醇，此为从头合成途径。
4.目前，为了提高苯乙醇和色醇产量，大部分生物合成研究集中在上述代谢路径的改造，合成调控路径的研究较少。本发明以酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)为研究对象，利用比较转录组学分析和功能基因注释挖掘了一个硫胺素相关蛋白基因thi4，运用基因克隆和基因表达等技术研究了thi4基因的生物学功能，发现thi4基因在酵母菌的苯乙醇和色醇合成过程中发挥了重要作用。该研究在苯乙醇和色醇的生物和酶学合成领域具有重大意义。经文献检索，未见与本发明相同的公开文献报道。
5.为了解决以上问题，提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明提供一种硫胺素相关蛋白基因的用途，所述硫胺素相关蛋白基因在酵母菌中用于提高苯乙醇和色醇产量，所述基因thi4的核苷酸序列如seq id no:1所示。
7.所述硫胺素代谢相关蛋白基因thi4是从食源性酵母菌kmly1-2中克隆得到，食源性酵母菌kmly1-2来源于馒头酵子，保藏号为cctcc m 2018457。
8.本发明的过程如下：
9.以分离于馒头酵子的酿酒酵母野生型菌株kmly1-2(保藏编号为cctcc m2018457)为实验对象，分析其在不同培养基中高产苯乙醇和色醇的转录组数据，意外发现一个注释为硫胺素相关蛋白基因的差异表达基因thi4，其基因表达水平如表1所示。
10.克隆thi4基因全长cdna序列，对其进行序列分析和过表达研究。结果发现，thi4基因的cdna序列长度为981bp，序列如seq id no:1所示，将其翻译为氨基酸序列，为326个氨基酸。将thi4基因克隆至过表达质粒py26tef-gpd(淼灵质粒平台，武汉)中，然后通过peg/liac转化法转入酿酒酵母by4741(淼灵质粒平台，武汉)中，最后利用高效液相色谱法
(hplc)测定对照菌株by4741和基因过表达菌株by4741-thi4的苯乙醇和色醇含量。
11.本发明意外发现，基因过表达菌株by4741-thi4的苯乙醇和色醇产量较野生型菌株by4741显著上升，表明thi4基因在酵母菌产苯乙醇和色醇中有着关键的促进作用。因此，本发明为利用微生物和酶法生产苯乙醇和色醇提供理论支撑。
12.因此，针对thi4基因的上述功能，提供该基因在生物和酶法合成苯乙醇和色醇中的应用。
13.上述技术方案在不矛盾的前提下，可以自由组合。
14.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
15.1、本发明意外发现了一个硫胺素相关蛋白基因thi4的生物学功能，即硫胺素相关蛋白基因的过表达可以提高酵母菌的苯乙醇和色醇产量。具体结果表明，与对照菌株by4741相比，过表达菌株by4741-thi4在相同培养条件下苯乙醇和色醇产量显著增加，对照菌株的苯乙醇产量为287.22mg/l，过表达菌株的苯乙醇产量提高至414.08mg/l，提高了44.2％；色醇产量由16.79mg/l提高至44.35mg/l，提高了164.1％。
16.2、本发明的硫胺素相关蛋白基因thi4是从食源性酵母菌kmly1-2(来源于馒头酵子，保藏号为cctcc m 2018457)中克隆得到。因此，可以将该基因及其表达蛋白质用于食品、药品、化妆品等领域，保证了基因来源的安全性。
附图说明
17.图1为过表达菌株by4741-thi4和对照菌株by4741的苯乙醇和色醇含量；**表示在0.01水平具有显著性差异(p《0.01)。
具体实施方式
18.下面对本发明通过实施例作进一步说明，但不仅限于本实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件以及手册中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例和对比例中所需要的原料均为市售。
19.实施例1
20.硫胺素相关蛋白基因thi4的克隆及序列分析：
21.根据酿酒酵母kmly1-2转录组数据，选择差异表达基因thi4为研究对象，利用软件primerpremier 5设计扩增thi4基因开放阅读框的引物thi4-f(5
’‑
ggactagtatgtctgctacctctact-3’)和thi4-r(5
’‑
ccgctcgagttaagcagcaaagtgtttcaaa-3’)。利用trizol(invitrogen，美国)提取野生型酵母菌kmly1-2的总rna，以逆转录的cdna为模板，用上述引物进行pcr扩增。pcr扩增程序设为：95℃预变性5min，95℃变性25s，55℃退火20s，72℃延伸1min，30个循环后72℃终延伸5min。pcr产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，序列分析表明thi4基因长度为981bp，翻译成氨基酸序列，为326个氨基酸，分子量为35.01kda，等电点为5.82。
22.所述thi4基因的核苷酸序列如下seq id no:1所示。
23.seq id no:1
24.atgtctgctacctctactgctacttccacaagtgcctctcaattgcacttaaactctactccagttact
cactgcttatctgacatcgttaagaaagaagactggtctgactttaaattcgctcccatccgcgaatccactgtctctcgtgctatgacttctcgttatttcaaggatcttgacaagtttgccgtttctgacgtgattattgtcggtgccggctcttcaggtttatccgccgcttacgtcatcgccaagaacagaccagacttgaaggtttgtattatcgaaagttcagttgcaccaggtggtggtagttggttgggaggccaattgtttagtgccatggttatgagaaaaccagctcatttgttcttacaagagttggaaatcccttacgaagacgaaggtgactatgttgtcgttaagcatgccgctttgttcatctctaccgtcctttcaaaggtcttgcaattaccaaatgttaaactgttcaatgctacctgtgttgaagatttggttaccagaccacctaccgaaaagggcgaagtcaccgttgctggtgttgtcaccaactggacattagttacccaagctcacggtactcaatgttgcatggaccctaacgtaattgaattggctggttacaaaaatgacggaactcgtgacttgagtcaaaagcatggtgtcattttatccactaccggtcatgatggtccatttggtgctttctgcgccaagagaatcgtcgacattgatcaaaaccaaaaattgggcggtatgaagggtctggacatgaaccatgccgaacacgatgtcgttattcactctggtgcatactccggtgttgacaacatgtactttgctggtatggaagttgctgaactggatggattaaaccgtatgggtccaacttttggagctatggctttgagtggtgttcatgctgctgagcaaattttgaaacactttgctgcttaa
25.实施例2
26.thi4基因过表达载体构建：
27.以kmly1-2总rna逆转录得到的cdna为模板，利用引物thi4-f(5
’‑
ggactagtatgtctgctacctctact-3’，下划线为spei酶切位点)和thi4-r(5
’‑
ccgctcgagttaagcagcaaagtgtttcaaa-3’，下划线为xhoi酶切位点)扩增thi4基因，pcr产物和表达质粒py26tef-gpd分别用spei与xhoi双酶切，回收酶切产物，利用t4连接酶(宝生物，大连)在16℃中连接过夜。然后，连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的lb平板上。候选阳性转化子利用引物yz-f(5
’‑
ggcacaaacaggcaaaaaa-3’)和yz-r(5
’‑
ggttagagcggatgtggg-3’)进行菌落pcr验证。然后，从pcr条带大小正确的单菌落中提取质粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证，序列正确的质粒为过表达质粒py26tef-thi4。
28.实施例3
29.过表达质粒py26tef-thi4转入酿酒酵母菌by4741中：
30.通过peg/liac转化法将py26tep-thi4转入酿酒酵母菌by4741感受态细胞中。菌体转化参数为：10kv/cm，200ω，电击时间为20ms。采用尿嘧啶缺陷型平板筛选候选阳性转化子，选取多个单菌落，再次利用引物yz-f(5
’‑
ggcacaaacaggcaaaaaa-3’)和yz-r(5
’‑
ggttagagcggatgtggg-3’)进行菌落pcr验证，具有目标大小片段(1439bp)的单菌落为正确阳性转化子，即为基因过表达菌株by4741-thi4。
31.实施例4
32.过表达菌株by4741-thi4和对照菌株by4741的苯乙醇和色醇产量测定
33.挑取by4741-thi4和by4741单菌落接入sc-ura液体培养基中，于30℃，150rpm震荡培养24h。将培养物按照1％的接种量，接种至50ml的sc-ura液体培养基中，再在30℃下震荡(150rpm)培养12h。培养结束后，用无菌水洗涤3次，将菌体分别接入含0.6g/l色氨酸或1.75g/l苯丙氨酸的tm培养基(葡萄糖30g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、mgso4·
7h2o 0.05g/l、nacl 1g/l)中，保证接入后的起始od
600
在0.15～0.16之间。然后，在30℃，150rpm摇床条件下培养48h后，离心收集上清，0.45μm滤膜过滤，滤液中的苯乙醇和色醇浓度用hplc定量分析。
34.结果表明，与对照菌株by4741相比，过表达菌株by4741-thi4在相同培养条件下苯乙醇和色醇产量显著增加，对照菌株的苯乙醇产量为287.22mg/l，过表达菌株的苯乙醇产量提高至414.08mg/l，提高了44.2％；色醇产量由16.79mg/l提高至44.35mg/l，提高了164.1％。
35.其中，所述sc-ura培养基配方为：1.34gynb(yeast nitrogen base，无氨基酸，含硫酸铵)，加入蒸馏水补充体积到78ml，调节ph＝5.8，定容到79ml，121℃灭菌20分钟；待温度降至55℃时，加入10ml 10
×
dropout solution，10ml20％单独灭菌的葡萄糖溶液，1ml 1μm fe(nh4)2(so4)2溶液，0.2ml 0.02％过滤除菌的d-biotin。10
×
dropout solution配方如下：0.02g l-histidine hcl、0.1gl-leucine、0.02g l-methionine、0.03g l-tyrosine、0.05g l-glutamine和0.02gl-arginine，用蒸馏水定容至100ml，121℃灭菌20分钟。
36.上述实施例结果说明thi4基因能显著提高酵母菌苯乙醇和色醇产量，在苯乙醇和色醇生物和酶学合成领域具有重要应用前景。
37.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
38.表1 thi4基因的转录水平
[0039][0040]
注：tm-0t、tm-0.6t、tm-1.5t和tm-1.75p分别表示酿酒酵母kmly1-2在含0、0.6、1.5g/l色氨酸和1.75g/l苯丙氨酸的tm培养基中培养18h后得到的菌体样品；fpkm表示每百万测序碱基中每千个转录子测序碱基中所包含的测序片断数。