用于金钱白花蛇药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重pcr鉴别的引物及其应用、鉴别方法
技术领域
1.本发明涉及中药鉴别技术领域，尤其涉及一种用于金钱白花蛇药材、标准 汤剂及中药配方颗粒多重pcr鉴别的引物及其应用、鉴别方法。
背景技术：
2.我国蛇类物种约有两百余种，其中有20余种为常见蛇类，包括蕲蛇 agkistrodon acutus、乌梢蛇zaocys dhumnades、金钱白花蛇bungarus multicinctus、 金环蛇bungarus fasciatus、滑鼠蛇ptyas mucosus、圆斑蝰daboia russelii、眼镜 蛇naja naja、赤链蛇lycodon rufozonatus、王锦蛇elaphe carinata、灰鼠蛇ptyaskorros、短尾蝮蛇gloydius brevicaudus、黑眉锦蛇elaphe taeniura、百花锦蛇elaphemoellendorffi等，其多数不具有临床药效。由于多种蛇类形态近似，药材鉴别困 难，特别是加工处理时剖去内脏后，要进行干燥熏黑处理，皮上的花纹特征、 颜色几近消失，难以辨认，尤其是经过水提取制成标准汤剂，进一步加工成配 方颗粒后，在失去药材性状后，更难以进行有效的鉴别。
3.一些研究指出，可采用pcr法(聚合酶链式反应法)对金钱白花蛇药材进 行鉴定。然而，标准汤剂、中药配方颗粒中往往含有一定比例的辅料，导致现 有的pcr法难以适用。再者，标准汤剂、中药配方颗粒在制备过程中，往往需 要加热提取，导致dna降解，难以存留超过200bp的dna片段，导致现有方 法检测精度低。此外，现有的pcr法往往只能实现单个种类蛇的鉴定，效率较 低。
技术实现要素：
4.本发明所要解决的技术问题在于，提供一种用于金钱白花蛇药材、标准汤 剂及中药配方颗粒多重pcr鉴别的引物，其可同时有效鉴别金钱白花蛇、赤链 蛇、金环蛇。
5.本发明还要解决的技术问题在于，提供一种上述引物的应用。
6.本发明还要解决的技术问题在于，提供一种基于上述引物的鉴别方法。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于金钱白花蛇药材、标准汤 剂及中药配方颗粒多重pcr鉴别的引物，其包括第一引物对、第二引物对和第 三引物对；
8.其中，所述第一引物对的上游引物的序列如seq id no：1所示，其下游引 物的序列如seq id no：2所示；
9.所述第二引物对的上游引物的序列如seq id no：3所示，其下游引物的序 列如seq id no：4所示；
10.所述第三引物对的上游引物的序列如seq id no：5所示，其下游引物的序 列如seq id no：6所示。
11.相应的，本发明还公开了上述的引物在(1)或(2)中的应用：
12.(1)鉴别待测样品是否为金钱白花蛇、赤链蛇和金环蛇；
13.(2)制备用于鉴别金钱白花蛇、赤链蛇和/或金环蛇的试剂盒；
14.作为上述技术方案的改进，所述金钱白花蛇为药材、标准汤剂或中药配方 颗粒；
15.所述赤链蛇为药材、标准汤剂或中药配方颗粒；
16.所述金环蛇为药材、标准汤剂或中药配方颗粒。
17.相应的，本发明还公开了上述的引物在(1)或(2)中的应用：
18.(1)鉴别待测样品是否含有金钱白花蛇、赤链蛇和/或金环蛇；
19.(2)制备用于鉴别待检测样品是否含有金钱白花蛇、赤链蛇和/或金环蛇的 试剂盒。
20.相应的，本发明还公开了一种试剂盒，其特征在于，其包括上述的引物。
21.相应的，本发明还公开了一种基于上述的用于金钱白花蛇药材、标准汤剂 及中药配方颗粒多重位点特异性的pcr鉴别方法，其包括：
22.提取待检测样品的基因组dna；
23.以所述基因组dna为模板，采用上述的用于金钱白花蛇药材、标准汤剂及 中药配方颗粒多重pcr鉴别的引物进行pcr扩增，若扩增产物中含有160-170bp 的dna条带，则待检测样品含有金钱白花蛇药材、金钱白花蛇标准汤剂和/或 金钱白花蛇中药配方颗粒；
24.若扩增产物中含有201-210bp的dna条带，则待检测样品含有赤链蛇药材、 赤链蛇标准汤剂和/或赤链蛇中药配方颗粒；
25.若扩增产物中含有190-200bp的dna条带，则待检测样品含有金环蛇药材、 金环蛇标准汤剂和/或金环蛇中药配方颗粒。
26.作为上述技术方案的改进，提取待检测样品的基因组dna的方法如下：
27.取待检测样品，加入ctab沉淀液、蛋白酶k沉淀提取2～3次；取沉淀物 加入ctab提取液、β-巯基乙醇提取，然后加入氯仿-异戊醇萃取2～3次；取萃 取后上清液，加入异丙醇或异丙醇-乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵育后用 水溶解，即得待检测样品的基因组dna。
28.作为上述技术方案的改进，提取待检测样品的基因组dna的方法如下：
29.取待检测样品0.3～0.8g，研磨成粉末，置离心管中，加入1～1.8ml的ctab 沉淀液、15～25μl蛋白酶k，混合均匀，在50～60℃下加热45～65min，冷却至 室温后离心，弃去上清液；加入800～1000μl ctab沉淀液、15～25μl蛋白酶k， 混合均匀，在50～60℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；取 沉淀加入800～1000μl ctab提取液，5～15μlβ-巯基乙醇，混合均匀，在60～70℃ 加热100～150min，冷却至室温后取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液， 震荡混匀后离心，取上清液700～800μl，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液， 震荡混匀后离心，取上清液400～500μl，加入等体积的异丙醇或异丙醇-乙酸钠 混合液，于-30～-20℃静置30～60min，离心后弃去上清液，再用乙醇洗涤沉淀2～4 次，弃去上清液，沉淀于35～38℃孵育20～40min，待乙醇挥发后，加入30～50μl 灭菌水溶解，即得到待检测样品的基因组dna。
30.作为上述技术方案的改进，所述ctab沉淀液包括ctab、tris-hcl、edta 和水；其中，ctab的浓度为1～3％(w/v)，tris-hcl的浓度为80～120mmol/l， edta的浓度为10～30mmol/l；
31.所述ctab提取液包括ctab、tris-hcl、edta、nacl、pvp40和水；其 中，ctab的浓度为1～3％(w/v)，tris-hcl的浓度为80～120mmol/l，edta的浓 度为10～30mmol/l；nacl的
浓度为1～3mol/l，pvp40的浓度为10～30％(w/v)。
32.作为上述技术方案的改进，将模板、引物、pcr预混液、水混合均匀，得 到pcr扩增体系；
33.将所述pcr扩增体系按照预设扩增程序进行扩增，得到扩增产物；
34.将所述扩增产物进行电泳分析，记录其电泳图谱，若图谱中含有160bp的 dna条带，则待检测样品含有金钱白花蛇药材、金钱白花蛇标准汤剂和/或金钱 白花蛇中药配方颗粒；
35.若图谱中含有207bp的dna条带，则待检测样品含有赤链蛇药材、赤链蛇 标准汤剂和/或赤链蛇中药配方颗粒；
36.若图谱中含有191bp的dna条带，则待检测样品含有金环蛇药材、金环蛇 标准汤剂和/或金环蛇中药配方颗粒。
37.作为上述技术方案的改进，所述pcr扩增体系由下述物质组成：
38.pcr预混液12.5μl；第一引物对的上游引物、下游引物各0.3μl，第二引 物对的上游引物、下游引物各0.3μl，第三引物对的上游引物、下游引物各0.3μl， 模板1μl，ddh2o 9.7μl。
39.作为上述技术方案的改进，所述pcr扩增程序为：
40.将所述扩增体系在92～95℃预变性4～6min，然后在预设程序下循环30～40 次，最后在71～75℃延伸4～6min；
41.其中，所述预设程序为：将扩增体系在94～96℃变性28～32s，然后在60～62℃ 退火26～32s，再在70～73℃延伸28～35s。
42.作为上述技术方案的改进，所述pcr扩增程序为：
43.将所述扩增体系在95℃预变性5min，然后在预设程序下循环35次，最后 在72℃延伸5min；
44.其中，所述预设程序为：将扩增体系在95℃变性30s，然后在61℃退火30s， 再在72℃延伸30s。
45.作为上述技术方案的改进，所述电泳分析方法为：将所述扩增产物稀释后 点样于1.5～2％的琼脂糖凝胶上，于115～125v电压条件下电泳45～60min，经 gelred显色，得到电泳图谱。
46.实施本发明，具有如下有益效果：
47.1，本发明的引物，可进行多重位点特异性pcr反应，有效鉴别金钱白花蛇、 赤链蛇和金环蛇，提升了鉴别效率。
48.2，本发明中的引物、鉴别方法，可有效克服dna提取过程中辅料干扰的 问题，且可解决标准汤剂、中药配方颗粒在失去形态后难以鉴别的难题。
附图说明
49.图1是实施例3中蛇类样品多重pcr扩增后电泳检测结果图；其中，m为 dna分子量标准，1-6为金钱白花蛇药材，7-10为金钱白花蛇标准汤剂(冻干 粉)，11-12为金钱白花蛇中药配方颗粒，13-18为赤链蛇药材，19-24为赤链蛇 标准汤剂(冻干粉)，25-30为金环蛇药材，31-36为金环蛇标准汤剂(冻干粉)， 37为金钱白花蛇(2020061807)、赤链蛇
(2020081440)、金环蛇(2020102001) 药材混合品；38为金钱白花蛇(2020112020)、赤链蛇(2020101609)、金环蛇 (2020101618)标准汤剂(冻干粉)混合品；n为空白对照(ddh2o)。
具体实施方式
50.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实 施方式对本发明作进一步地详细描述。
51.本发明提供一种用于金钱白花蛇药材、标准汤剂、中药配方颗粒多重pcr 鉴别的引物，其包括第一引物对、第二引物对和第三引物对，其具体序列如下 表所示：
[0052][0053]
上述引物可在同一pcr反应体系中进行多重pcr反应，其相互之间无干扰， 易于扩增。
[0054]
基于上述特性，本发明中的引物可实现以下应用：
[0055]
(1)鉴别待检测样品是否为金钱白花蛇的药材、标准汤剂、中药配方颗粒； 或赤链蛇的药材、标准汤剂、中药配方颗粒；或金环蛇的药材、标准汤剂、中 药配方颗粒。
[0056]
(2)鉴别待检测样品是否含有金钱白花蛇和/或赤链蛇和/或金环蛇；例如 可用于鉴别含金钱白花蛇的中药复方(如风湿祛痛胶囊等)。
[0057]
(3)制备用于鉴别金钱白花蛇、赤链蛇和/或金花蛇的试剂盒。
[0058]
(4)制备用于鉴别待检测样品是否含有金钱白花蛇和/或赤链蛇和/或金环 蛇的试剂盒。
[0059]
相应的，本发明公开了一种试剂盒，其包括上述引物，还包括pcr预混液 和水。其中，pcr预混液可选用2
×
taq pcr master mixⅱ(天根生化科技(北 京)有限公司，kt201-12)或2
×
pfu pcr mix(天根生化科技(北京)有限公司， kp201)，但不限于此。
[0060]
本发明还公开了一种基于上述用于金钱白花蛇药材、标准汤剂及中药配方 颗粒多重pcr鉴别方法，其包括：
[0061]
一、提取待检测样品的基因组dna；
[0062]
其中，待检测样品以固态形式提供，标准汤剂以冻干粉的形式提供(即将 标准汤剂冷冻干燥后得到冻干粉)。
[0063]
具体的，提取方法如下：
[0064]
(一)取待检测样品，加入ctab沉淀液、蛋白酶k沉淀提取2～3次，得 到沉淀物；
[0065]
具体的，取待检测样品0.3～0.8g，研磨成粉末，置离心管中，加入1～1.8ml 的ctab沉淀液、15～25μl蛋白酶k，混合均匀，在50～60℃下加热45～65min， 冷却至室温后离心，弃去上清液；加入800～1000μl ctab沉淀液、15～25μl蛋 白酶k，混合均匀，在50～60℃
下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上 清液，即得。
[0066]
其中，ctab沉淀液的组成为2％(w/v)ctab，100mmol/l tris-hcl(ph＝8.0)， 20mmol/l edta(ph＝8.0)。
[0067]
(二)取沉淀物加入ctab提取液、β-巯基乙醇提取；然后加入氯仿-异戊 醇萃取2～3次，得萃取后上清液；
[0068]
具体的，在沉淀物加入800～1000μl ctab提取液，5～15μlβ-巯基乙醇，混 合均匀，在60～70℃加热100～150min，冷却至室温后取上清液，加入等体积的 氯仿-异戊醇(24:1)混合液，震荡混匀后离心，取上清液700～800μl，再加入 等体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，震荡混匀后离心，取上清液400～500μl， 即得。
[0069]
需要说明的是，在本步骤中，在采用ctab提取液、β-巯基乙醇提取结束 后，可直接加入氯仿-异戊醇，也可取提取后所得上清液再加入氯仿-异戊醇，取 上清液再加入氯仿-异戊醇可提升提取准确度。
[0070]
其中，ctab提取液：1～3％(w/v)ctab，80～120mmol/l tris-hcl(ph＝8.0)， 10～30mmol/l edta(ph＝8.0)，1～3mol/lnacl，10～30％(w/v)pvp40。
[0071]
(三)取提取液加入异丙醇或异丙醇-乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵 育后用水溶解，即得待检测样品的基因组dna。
[0072]
具体的，取提取液，加入等体积的异丙醇或异丙醇-3mol/l乙酸钠混合液， 于-30～-20℃静置30～60min，离心后弃去上清液，再用乙醇洗涤沉淀2～4次，弃 去上清液，沉淀于35～38℃孵育20～40min，待乙醇挥发后，加入30～50μl灭菌 水溶解，即得到待检测样品的基因组dna。
[0073]
需要说明的是，申请人在面临金钱白花蛇标准汤剂、金钱白花蛇中药配方 颗粒中基因组dna提取时，尝试了传统的ctab法、螯合树脂法、曲拉通-100 法、sds法、碱式裂解法、dneasy blood&tissue kit法、磁珠法，但均得到了 不溶性沉淀。故，本发明人在传统ctab法的基础上，对ctab沉淀液、ctab 提取液以及提取程序加以改进，得到了上述提取方法。上述提取方法尽量多地 保留金钱白花蛇标准汤剂、金钱白花蛇中药配方颗粒中的基因组dna信息，同 时可克服辅料干扰的问题。
[0074]
二、形成pcr扩增体系，并进行扩增，得到扩增产物；
[0075]
具体的，将模板、引物、pcr预混液、水混合均匀，得到pcr扩增体系；
[0076]
更具体的，pcr扩增体系的总体积为25μl，其包括：pcr预混液12.5μl； 第一引物对的上游引物、下游引物各0.3μl，第二引物对的上游引物、下游引物 各0.3μl，第三引物对的上游引物、下游引物各0.3μl，模板1μl，ddh2o 9.7μl。
[0077]
具体的，pcr预混液可选用2
×
taq pcr master mixⅱ(天根生化科技(北京) 有限公司，kt201-12)或2
×
pfu pcr mix(天根生化科技(北京)有限公司， kp201)，但不限于此。
[0078]
扩增程序为：92～95℃预变性4～6min；94～96℃变性28～32s，60～62℃退火 26～32s，70～73℃延伸28～35s，循环30～40次；最后在71～75℃延伸4～6min。
[0079]
优选的，扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，61℃退火30s， 72℃延伸30s，循环35次，最后在72℃延伸5min。
[0080]
(3)将扩增产物进行分析；
[0081]
具体的，可采用电泳法或荧光染色法对扩增产物进行分析，但不限于此。
[0082]
优选的，采用电泳法对扩增产物进行分析，具体如下：
[0083]
取扩增产物，所述扩增产物稀释后点样于1.5～2％的琼脂糖凝胶上，于 115～125v电压条件下电泳45～60min，经gelred显色，得到电泳图谱。
[0084]
若图谱中含有160bp的dna条带，则待检测样品含有金钱白花蛇药材、金 钱白花蛇标准汤剂或金钱白花蛇中药配方颗粒；若图谱中含有207bp的dna条 带，则待检测样品含有赤链蛇药材、赤链蛇标准汤剂或赤链蛇中药配方颗粒； 若图谱中含有191bp的dna条带，则待检测样品含有金环蛇药材、金环蛇标准 汤剂或金环蛇中药配方颗粒。
[0085]
下面以具体实施例对本发明进行说明。
[0086]
实施例1引物设计
[0087]
以中国药典2020年版金钱白花蛇及常见蛇类nadh；cytochrome oxidase i； 12s rrna；16s rrna；cytochrome b序列分析为基础，利用bioedit软件对 genebank数据库中常见蛇类物种的cytochrome oxidase i序列进行同源比对， 校对后分析金钱白花蛇的特异性snp位点，将包含snp位点的碱基序列导入到 primer premier 5软件中，进行引物设计。
[0088]
经序列对比发现，金钱白花蛇特异性位点为t而其他为c，确定该snp位 点后，使snp位点接近正向引物3’端，通过移动上游引物位置，调节引物得分 及gc含量，并借助primer premier 5软件，进一步调节反向引物位置，通过最 终引物评分、产物条带得分以确定最佳组合。在设计过程中，还需考虑到经高 温提取后，对dna碱基序列的破坏作用。
[0089]
综合以上因素，获得的引物组合如下：
[0090]
jqbhs-f：5
’‑
ggagcaatcaattttattacaacat-3’；
[0091]
jqbhs-r：5
’‑
gatcggttaaaagtattgtaactgc-3’；
[0092]
cls-f：5
’‑
accgtgtacccgccactg-3’；
[0093]
cls-r：5
’‑
aagcatgatagcagtaattagcaca-3’[0094]
jhs-f：5
’‑
cctgggtcacttctaggtagc-3’；
[0095]
jhs-r：5
’‑
gctggtgggagtagtcagaaac-3’。
[0096]
实施例2鉴定方法建立
[0097]
(1)dna提取及浓度调节
[0098]
取干燥的样品0.5g，研磨成粉末，置于2ml离心管中，加入1.5ml在56℃ 预热的ctab沉淀液、20μl蛋白酶k，混匀，56℃水浴加热60min，冷却至室 温后，以10000r/min离心5min，弃上清液，再加入900μl ctab沉淀液、20μl 蛋白酶k，同法操作。向该离心管中依次加入900μl ctab提取液、10μlβ-巯 基乙醇，混匀，65℃水浴加热120min，离心，待冷却至室温后取上清液；加入 等体积的氯仿-异戊醇(24﹕1)，震荡3min，混匀；再以12000r/min，4℃离心 10min，取上清液750μl加入新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24 ﹕1)，震荡3min，混匀，12000r/min，4℃离心10min；再取上清液450μl于1.5ml 离心管中，加入等体积异丙醇，于-20℃静置30～60min。取出该离心管以 12000r/min离心5min，弃上清液，再分别用75％乙醇及无水乙醇洗涤沉淀两次， 弃上清液，沉淀于37℃孵育30min，待乙醇挥发后，加灭菌水30μl使溶解。
[0099]
其中，ctab沉淀液组成如下：2％(w/v)ctab(上海源叶生物科技有限 公司)，100mm tris-hcl(ph＝8.0)(beijing solarbio)，20mmedta(ph＝8.0)(shanghai yu bo biotech co.,ltd)。
[0100]
ctab提取液组成如下：2％(w/v)ctab(上海源叶生物科技有限公司)， 100mm tris-hcl(ph＝8.0)(beijing solarbio)，20mm edta(ph＝8.0)(shanghai yubo biotech co.,ltd)，2.5mol/l nacl(西陇科学股份有限公司)，20％pvp40(上 海源叶生物科技有限公司)。
[0101]
取上述dna样品，采用biospec-nano微量紫外分光光度计测定dna浓度， 同时记录od260/od230，od260/od280，并调整浓度到50ng/μl，得到dna 模板。
[0102]
(2)设计引物
[0103]
引物序列如seq id no：1～6所示。
[0104]
(3)pcr扩增
[0105]
pcr扩增体系：2
×
taq pcr预混试剂12.5μl，10μmol/l的jqbhs-f引物 0.3μl，10μmol/l的jqbhs-r引物0.3μl，10μmol/l的cls-f引物0.3μl，10μmol/l 的cls-r引物0.3μl，10μmol/l的jhs-f引物0.3μl，10μmol/l的jhs-r引物 0.3μl，50ng/μl的dna模板1μl，去离子水9.7μl。上述液体振荡混匀，瞬时 离心，即得pcr扩增体系。
[0106]
pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。
[0107]
(4)电泳检测
[0108]
取扩增产物，加入6
×
loading buffer 5μl，混匀，取混合产物6μl点样于2％ 的琼脂糖凝胶上，于120v电压的条件下电泳60min，经gelred显色，最后于凝 胶成像仪观察记录结果。
[0109]
如果电泳图谱中含有160bp的dna条带，则待检测样品含有金钱白花蛇药 材、金钱白花蛇标准汤剂或金钱白花蛇中药配方颗粒；若图谱中含有207bp的 dna条带，则待检测样品含有赤链蛇药材、赤链蛇标准汤剂或赤链蛇中药配方 颗粒；若图谱中含有191bp的dna条带，则待检测样品含有金环蛇药材、金环 蛇标准汤剂或金环蛇中药配方颗粒。
[0110]
实施例3鉴定方法验证
[0111]
取金钱白花蛇、赤链蛇、金环蛇的各类样品(具体如表1所示)。
[0112]
采用实施例2建立的鉴别方法对样品进行鉴定。其中，pcr体系中，dna 模板量为50ng。
[0113]
表1样品表
[0114][0115][0116]
鉴定结果如图1所示，从图中可以看出，金钱白花蛇药材、金钱白花蛇标 准汤剂(冻干粉)、金钱白花蛇中药配方颗粒以及含有金钱白花蛇药材的混合品、 含有金钱白花蛇标准汤剂的混合品均存在160bp的条带；而其他蛇类样品均未 得到该条带。从图中可以看
出，赤链蛇药材、赤链蛇标准汤剂(冻干粉)以及 含有赤链蛇药材的混合品、含有赤链蛇标准汤剂的混合品均存在207bp的条带； 而其他蛇类样品均未得到该条带。从图中可以看出，金环蛇药材、金环蛇标准 汤剂(冻干粉)以及含有金环蛇药材的混合品、含有金环蛇标准汤剂的混合品 均存在191bp的条带；而其他蛇类样品均未得到该条带。该结果表明，本发明 中的鉴别方法准确率达到100％。
[0117]
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些 改进和润饰也视为本发明的保护范围。
[0118]
[0119]