细胞培养系统
1.相关专利申请的交叉引用
2.本技术要求2019年6月30日提交的美国临时专利申请号62/869021的优先权权益，其全文据此以引用方式并入本文。
技术领域
3.本公开整体涉及一种细胞培养装置和细胞培养方法。


背景技术：

4.体外细胞培养是复杂的过程，细胞通过该过程在受控条件下生长，通常在自然环境之外但尽可能接近体内条件。在实践中，细胞培养是指来自多细胞真核生物的细胞，尤其是动物细胞的培养。然而，也可培养植物、真菌、昆虫以及微生物(包括病毒、细菌和原生生物)。
5.体外细胞培养可为药理学、生理学和毒理学的研究和应用提供材料。细胞培养也是生物加工和细胞疗法的必要方面。
6.在适当的温度和气体混合物下，细胞可以在细胞孵育箱中生长和维持。通常，哺乳动物细胞在37℃孵育，ph值保持在7.2和7.4之间。可以使用在培养基中的碳酸氢盐缓冲系统结合大约5-7体积％二氧化碳的孵育箱气氛来控制ph值。二氧化碳与水反应生成碳酸，碳酸又与培养基中的碳酸氢根离子相互作用形成缓冲系统，该缓冲系统可以维持ph值接近生理学水平。对于许多期望的细胞类型来说，氧气是细胞代谢和生长必不可少的。每种细胞类型的培养条件可能不同，并且特定细胞类型的条件变化可导致不同表型的表达。例如，基于碳酸氢盐的缓冲液可以用磷酸一钠和二钠或三钠缓冲液、氯化物和氨缓冲液、乳酸盐或有机缓冲液(诸如hepes等)代替。
7.单核细胞是最大的白血球(白细胞)，并且是包括所有哺乳动物在内的脊椎动物的先天免疫系统的重要部分。单核细胞是巨噬细胞和树突状细胞的循环前体，其跨血管内皮从血流迁移，以便进行免疫监测和炎症反应。单核细胞通常在细胞培养物中生长。
8.t细胞在免疫应答中扮演重要角色。t细胞在胸腺中发育，并存在于人类的各种人群中。过继性t细胞疗法是一个快速发展的领域，因此需要使t细胞在培养物中生长的方法。
9.可商购的袋状细胞培养装置是用于细胞培养的常规形式。细胞培养袋是一次性用品，这个优点可减少准备和清理时间。此外，细胞培养袋可预消毒、便宜、易于使用，并且需要极小的存储和使用空间。一次性用品还有助于降低细胞培养物和环境污染的风险。
10.然而，常规含氟聚合物细胞培养袋的一个问题是，进料培养基和细胞在培养室内混合，且因此加入的培养基的量受限于容器的体积。常规含氟聚合物细胞培养袋的另一个问题是，细胞培养期间对于营养物(例如，葡萄糖)含量减少和废物含量(例如，乳酸)增加的培养基的移除，其可能不利地移除细胞。此外，通常需要人工操控培养物以补充培养基。
11.灌注是个连续过程，其中不断向生物反应器中的贴壁或悬浮细胞培养物提供新鲜培养基，同时不断移除废培养基。将细胞从废培养基中连续过滤并返回至生物反应器，以保
持恒定的培养物体积。该连续过程允许高达10-15m/ml的可持续的细胞密度。然而，该过程通常限于需要大体积培养基的复杂的灌注式生物反应器。此外，从废培养基中过滤和返回的细胞可能不利地干扰细胞培养。
12.因此，需要一种简化的灌注装置，其允许移除和补充进料培养基，而不明显干扰细胞和/或减少细胞计数。


技术实现要素：

13.本公开的一个方面为一种袋，其包括一个或多个聚合物膜(例如，第一聚合物膜和第二聚合物膜)，具有粘结在一起以围绕袋的未分隔的内部隔室形成边缘的边缘；第一孔口，形成于袋的外部表面；第一液体可渗透的管，延伸进入袋的内部隔室并与袋的内部隔室成流体连通，第一管可操作地联接至第一孔口；第二孔口，形成于袋的外部表面；第二液体可渗透的管，延伸进入袋的内部隔室并与袋的内部隔室成流体连通，第二管可操作地联接至第二孔口；以及任选地第三孔口，形成于袋的外部表面，第三孔口与袋的内部隔室成流体连通；其中第一管包括第一内支撑结构，限定管的中心腔；以及第一外过滤层，围绕第一内支撑结构。
14.本公开的另一方面为一种袋，其包括一个或多个聚合物膜(例如，第一聚合物膜和第二聚合物膜)，具有粘结在一起以围绕袋的未分隔的内部隔室形成边缘的边缘；第一孔口，形成于袋的外部表面；第一液体可渗透的管，延伸进入袋的内部隔室并与袋的内部隔室成流体连通，第一管可操作地联接至第一孔口；第二孔口，形成于袋的外部表面；第二液体可渗透的管，延伸进入袋的内部隔室并与袋的内部隔室成流体连通，第二管可操作地联接至第二孔口；以及任选地第三孔口，形成于袋的外部表面，第三孔口与袋的内部隔室成流体连通；其中第一管具有不超过50微米的平均孔径，例如，不超过20微米，或甚至不超过10微米。
15.本公开的另一方面为一种细胞培养系统，其包括袋(例如，根据本文所描述的任一项实施例)，其面向支撑物，使得第一可渗透的管和第二液体可渗透的管相对于袋的第一聚合物膜的大部分升高。
16.本公开的另一方面为一种细胞培养系统，其包括袋(例如，根据本文所描述的一个实施例)，其面向支撑物，使得第一液体可渗透的管相对于第二液体可渗透的管升高。
17.本公开的另一方面为培养细胞的方法，其包括提供袋(例如，根据本文所描述的一个实施例)，其包括在内部隔室中的培养基和细胞；以及通过经第二孔口并经第二液体可渗透的管添加培养基，且经第一液体可渗透的管并经第一孔口移除培养基，使培养基流过内部隔室。
附图说明
18.图1为根据本公开的一个实施例的袋的示意性俯视图(顶部)和剖视图(底部)。
19.图2为根据本公开的一个实施例的液体可渗透的管的示意性剖面图。
20.图3为根据本公开的一个实施例的液体可渗透的管的示意性剖面图。
21.图4为根据本公开的一个实施例的细胞培养系统的示意性剖视图。
22.图5为根据本公开的一个实施例的细胞培养系统的示意性剖视图。
具体实施方式
23.本公开涉及一种具有内部隔室的袋，该袋包含第一孔口，其联接至第一液体可渗透的管，第一液体可渗透的管延伸进入内部隔室并与袋的内部隔室成流体连通；第二孔口，其联接至第二液体可渗透的管，第二液体可渗透的管延伸进入内部隔室并与袋的内部隔室成流体连通；以及任选地第三孔口，其与内部隔室成流体连通。至少第一管包括第一内支撑结构以及围绕第一内支撑结构的第一外过滤层。本公开表明，有利地，可以通过使培养基从第二管流过内部体积并流出第一管，经袋的内部隔室灌注进料培养基，而不明显干扰细胞和/或减少细胞计数。第一管的第一过滤层可防止细胞从内部隔室的内部体积逸出。本公开进一步表明，细胞因此可以在内部隔室中生长和聚集，而不受进料培养基供应限制和/或废物移除限制。当存在第三孔口时，其可用于培养基取样和从内部隔室引入以及移除细胞。
24.因此，本公开的一个方面为一种袋，其包括一个或多个聚合物膜(例如，第一聚合物膜和第二聚合物膜)，具有粘结在一起以围绕袋的未分隔的内部隔室形成边缘的边缘。该袋包括第一孔口，形成于袋的外部表面；以及第一液体可渗透的管，延伸进入该袋的内部隔室并与袋的内部隔室成流体连通，第一管可操作地联接至第一孔口。该袋包括第二孔口，形成于袋的外部表面；以及第二液体可渗透的管，延伸进入该袋的内部隔室并与袋的内部隔室成流体连通，第二管可操作地联接至第二孔口。该袋任选地包括第三孔口，形成于袋的外部表面，该第三孔口与该袋的内部隔室成流体连通。第一管和第二管都沿袋的内部隔室的第一轴线(例如，主轴线)的方向延伸；并且第一管包括第一内支撑结构，限定管的中心腔；以及第一外过滤层，围绕第一内支撑结构。
25.在某些实施例中，一个或多个聚合物膜包括第一聚合物膜和第二聚合物膜，具有粘结在一起以围绕袋的未分隔的内部隔室形成边缘的边缘。然而，在另一些实施例中，可以将单个膜折叠并与粘结至其自身以形成袋，或者可以将管状膜焊接在两个边缘上以形成袋。
26.值得注意的是，内部隔室不需要分开。在如本文另外描述的袋的某些期望的实施例中，没有膜状物或其它多孔结构将内部隔室分开，使得第一管和第二管位于第一子隔室中；以及第三孔口连接到由通过膜状物或其它多孔结构将第一子隔室分开的第二子隔室。即，在某些期望的实施例中，在第一流体可渗透的管和第二流体可渗透的管与第三孔口之间没有可操作地设置膜状物或其它多孔结构(即，使得流体需要在此类膜状物或其它多孔结构之间流动，以在第一流体可渗透的管或第二流体可渗透的管与第三孔口之间流动)。这可以有利地允许在孵育细胞和灌注培养基之间进行良好的流体转移。
27.图1示出此类袋的某一个实施例的示意性俯视图(左部)和剖视图(右部)。图1的袋100包括第一聚合物膜110和第二聚合物膜120，在其边缘处粘结在一起以形成围绕具有主轴线132的未分隔的内部隔室130的边缘。袋100进一步包括可操作地联接至第一液体可渗透的管170的第一孔口140和可操作地联接至第二液体可渗透的管180的第二孔口150。在图1的实施例中，袋100进一步包括与内部隔室130成流体连通的第三孔口160；然而，本领域普通技术人员将理解，第三孔口不需要存在于本文设想的所有实施例中。
28.在如本文所述的各种实施例中，第一聚合物膜和第二聚合物膜的厚度可根据应用和所需容器体积和渗透性而变化。例如，聚合物膜110和120的厚度可以在1密耳(即，1密耳＝0.001英寸，或25.4微米)至30密耳范围内。在某些实施例中，聚合物膜的厚度在5密耳至
10密耳范围内。
29.本文所描述的袋可提供为各种体积。例如，尽管没有特别限制，但内部隔室的体积可以在5ml至3500ml范围内，例如，从10ml至500ml，或从10ml至100ml，或从100ml至3000ml，或从500ml至2500ml，或从500ml至2000ml。但是如本领域普通技术人员将理解的，可以设想不同体积的袋。
30.该袋期望地配置为允许培养基灌注经由第二液体可渗透的管流到第一液体可渗透的管以通过内部体积的大部分。在某些期望的实施例中，第一管设置于邻近袋的第一侧向边缘，并且第二管设置于邻近袋的第二相对侧向边缘；在某些实施例中，每个都在袋的侧向边缘的2cm内。例如，在图1的实施例中，第一管170设置于邻近第一侧向边缘134，并且第二管180设置于邻近第二侧向边缘136，其位于袋的与第一侧向边缘134相对的一侧。例如，这些管可以基本上彼此平行，例如，彼此相差20度以内或甚至10度以内。在某些期望的实施例中，第一管和第二管沿袋的主轴线方向延伸。例如，在图1的实施例中，第一管170和第二管180沿袋的主轴线132方向延伸。当然，在另一些实施例中，管可以以任何合适的方式布置。例如，在某些实施例中，第一管和第二管是弯曲的，并且沿着圆形袋的侧向边缘延伸。
31.第一孔口、第二孔口和(如果存在)第三孔口可位于沿着袋的各个位置。例如，在某些实施例中，第一孔口和第二孔口形成于袋的边缘处，例如，与管延伸进入袋的方向正交地延伸的边缘。可以在如图1所示的相同边缘中，也可以在相对边缘中。这允许第一孔口和第二孔口的相对位置促进第一液体可渗透的管和第二液体可渗透的管沿着共同的方向(例如，沿着袋的主轴线)延伸。第三孔口可以例如沿着与第一孔口和第二孔口中的一者或两者的边缘相同的边缘形成；在图1的实施例中，孔口140、150和160沿着共同的边缘。但是第三孔口可替代地沿着与形成第一孔口和第二孔口的边缘呈正交的边缘，或者替代地沿着袋的另一表面(例如沿着底部表面)，以允许细胞的经重力辅助的移除。孔口的位置没有特别限制，只要第一孔口和第二孔口(以及与其连接的第一管和第二管)的相对位置促进通过袋的相当大体积的灌注即可。基于本公开，本领域普通技术人员将布置第一管和第二管，例如，以最大限度减少袋内灌注流的死角，并/或确保灌注流不干扰细胞生长。当存在第三孔口时，可将其定位，例如以促进将细胞引入袋的内部体积和/或从袋的内部体积收集细胞，或提供袋中流体取样或监测的所需位置。
32.限定袋的内部隔室的一个或多个聚合物膜可具有一种或多种期望的特性，例如，包括气体渗透性(且特别是氧气渗透性)或在另一些实施例中气体不可渗透性(且特别是氧气不可渗透性)、柔韧性、确保防水性的热封性、允许微观评估细胞生长的良好透明度、不含可能对细胞有害的增塑剂(诸如邻苯二甲酸二辛酯和邻苯二甲酸二异癸酯)、湿气渗透性、能够被改变以进行细胞间所需的相细胞互作用、光学清晰度以及物理强度。在某些期望的实施例中，聚合物膜中的一个或多个(例如，限定内部隔室的聚合物膜中的每一个)是气体可渗透的并且可以允许氧气扩散(细胞生长所必需的)和二氧化碳扩散(废物；缓冲液ph值所必需的)进出内部隔室。例如，在某些实施例中，限定袋的聚合物膜中的一个或多个是氧气可渗透的多层膜，诸如美国专利号9926524(其全文据此以引用方式并入本文)中描述的含氟聚合物/有机硅膜。在某些实施例中，限定袋的聚合物膜中的一个或多个是含氟聚合物膜，诸如氟化乙烯-丙烯(fep)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、四氟乙烯-全氟(丙基乙烯基醚)(pfa)、聚偏二氟乙烯(pvf)、聚三氟氯乙烯(pctfe)、四氟乙烯/六氟丙烯/
乙烯共聚物(hte)、三氟氯乙烯/偏二氟乙烯共聚物、三氟氯乙烯/六氟丙烯、乙烯/三氟氯乙烯共聚物(ectfe)、乙烯/三氟乙烯共聚物、乙烯/四氟乙烯共聚物(etfe)、四氟乙烯/丙烯共聚物(tfe/p)、四氟乙烯/六氟丙烯共聚物(fep/hfp)或六氟丙烯/四氟乙烯/亚乙烯基共聚物(thv)。在某些实施例中，限定袋的一个或多个聚合物膜是氟化乙烯丙烯(fep)的膜。并且在另一些实施例中，限定袋的一个或多个(例如，每个)聚合物膜是氧气不可渗透的膜。在此类实施例中，可以使用灌注培养基管理进出袋的氧气交换。
33.聚合物膜中的一个或多个的表面(例如，限定内部隔室的一个或多个表面)可以通过例如c处理、电晕放电、等离子体处理、蚀刻或其组合进行处理。也可以对表面进行化学处理，例如，用添加剂或底漆(例如，单独或与其他处理方法结合使用)。
34.为了形成袋，一个或多个聚合物膜的边缘可以通过任何期望的方法粘结，诸如rf焊接、热脉冲焊接、超声波焊接、热棒焊接、化学粘结、粘合剂粘结、热熔粘结、溶剂焊接、激光焊接、电晕放电、辐射、表面处理、极热、带式或熔融层压、蚀刻、等离子体处理、挤出、润湿、粘合剂或其组合。在某些期望的实施例中，一个或多个膜通过热焊、激光焊或热棒焊粘结。
35.第一管和第二管可以通过套环密封工艺附接至形成于袋的一个或多个边缘的相应的第一孔口和第二孔口(例如，通过rf焊接、超声波焊接、热脉冲焊接、热棒焊接、化学粘结、粘合剂粘结、热熔粘结、溶剂焊接、激光焊接、电晕放电、辐射、极热或熔融层压、蚀刻、等离子体处理、润湿、粘合剂、或其组合)。这可以在形成袋时完成。可密封(例如，通过套环密封)第一管，使得其外过滤层可防止细胞从内部隔室通过管传输并流出第一孔口。因此，第一管和/或第二管可以从袋的外部延伸进入袋的内部(其多孔部分期望地基本上仅在袋中延伸)。当然，在另一些实施例中，第一管和/或第二管可以终止于袋处，并通过其他管材连通到流体系统；此类其他管材可以由与本文所描述的第一流体可渗透的管和第二流体可渗透的管相同的材料制成。
36.如上所述，在某些实施例中，第一管(例如，图1的管170)包括第一内支撑结构，限定管的中心腔；以及第一外过滤层，围绕第一内支撑结构。如本文中详细描述的，第一内支撑结构可采用各种形式，例如，经穿孔的或其它多孔管、框架或螺旋缠绕的丝状物。支撑结构的横截面可以是圆形的，如本文附图中所示，或者可以具有其它横截面形状，例如，多边形。在如本文中另外描述的某些期望的实施例中，支撑结构和外过滤层的材料是亲水性、自润湿的和/或具有足够的孔隙率，使得可以以最小压力启动或维持液体流通过管。
37.图2示出此种流体可渗透的管的一个实施例的剖面图。图2的管200包括螺旋缠绕的丝状物272和围绕丝状物的外过滤层274。外过滤层274至少在孔口处(例如，图1的孔口140)附接至螺旋缠绕的丝状物272，但可以在沿着丝状物的一个或多个附加点处附接至螺旋缠绕的丝状物272。外过滤层可以相对松散地围绕螺旋缠绕的丝状物(例如，作为覆盖丝状物272的松散袋)，或者可以更紧密地抵靠螺旋缠绕的丝状物设置(例如，作为覆盖丝状物272的贴身套筒)。
38.因此，在如本文另外描述的某些实施例中，第一内支撑结构包括螺旋缠绕的丝状物。丝状物可以是相对刚性的或相对柔性的，并且可以相对紧密地或相对松散地缠绕，当然，前提是丝状物限定管的中心腔并且可以支撑第一外过滤层。在如本文另外描述的某些期望的实施例中，丝状物包括(例如，是)具有水中总有机碳小于0.1mg/cm2的聚合物。在如
本文另外描述的某些实施例中，丝状物包括(例如，形成于)含氟聚合物、聚甲基戊烯或其组合(例如，具有水中总有机碳小于0.1mg/cm2)。
39.在如本文中另外描述的某些实施例中，螺旋缠绕的丝状物的间距(即，沿着中心腔的轴线)大约等于或甚至大于大多数细胞的尺寸。例如，在本文另外描述的某些实施例中，螺旋缠绕的丝状物的间距为至少100μm，或在100μm至10mm，或500μm至7.5mm，或1mm至5mm范围内。本发明人已经确定，具有大于100μm的间距的管可以有利地促进培养基以期望的流速灌注，而不明显干扰和/或减少培养细胞的计数。
40.在如本文中另外描述的其他实施例中，支撑结构可提供为框架，例如，由丝状物形状的材料形成，但不同于螺旋状地布置。丝状物和丝状物的间距可以如上文针对螺旋缠绕的丝状物所描述的。
41.在本文另外提供的其他实施例中，支撑结构可以是多孔管的形式。图3示出一个此种实施例(例如，用于图1的管170)的剖面图。图3的管370包含多孔管372和围绕多孔管的外过滤层374。外过滤层至少在孔口(例如，图1的孔口140)处附接至多孔管，但可以在沿管的一个或多个附加点处附接至多孔管。外过滤层可以相对松散地围绕多孔管(例如，作为覆盖多孔管372的袋)，或者可以更紧密地抵靠多孔管设置(例如，作为覆盖多孔管372的套筒)。
42.因此，在如本文另外描述的某些实施例中，第一内支撑结构包括第一多孔管。管可以是相对柔性的或相对刚性的，当然前提是管可以支撑第一外过滤层。在如本文另外描述的某些期望的实施例中，多孔管包括(例如，形成于)具有水中总有机碳小于0.1mg/cm2的聚合物。在如本文另外描述的某些实施例中，多孔管包括(例如，形成于)弹性体、含氟聚合物、聚甲基戊烯或其组合(例如，具有水中总有机碳小于0.1mg/cm2)。在如本文另外描述的某些期望的实施例中，多孔管包括(例如，形成于)有机硅或聚氯乙烯(例如，具有水中总有机碳小于0.1mg/cm2)。例如，在某些此类实施例中，多孔管组分包括有机硅弹性体。在另一个实例中，在某些此类实施例中，多孔管包括氟化乙烯丙烯。但是可以另外使用各种氟化和非氟化聚合物，也可以使用其它合适的材料。
43.在如本文另外描述的某些实施例中，多孔管具有在1μm至5000μm范围内的平均孔径。例如，在本文另外描述的某些实施例中，多孔管的平均孔径在1μm至2000μm，或1μm至1500μm，或1μm至1250μm，或1μm至1000μm，或1μm至750μm，或1μm至500μm，或5μm至1250μm，或5μm至1000μm，或5μm至750μm，或10μm至5000μm，或25μm至5000，或50μm至5000μm，或50μm至2000μm，或50μm至1500μm，或50μm至1250μm，或50μm至1000μm范围内。在如本文另外描述的某些实施例中，多孔管的平均孔径在100μm至5000μm范围内，例如，100μm至2000μm，或100μm至1500μm，或100μm至1250μm，或100μm至1000μm，或250μm至5000μm，或250μm至2000μm，或250μm至1500μm，或250μm至1250μm，或250μm至1000μm。在如本文另外描述的某些实施例中，多孔管的功能孔径在500μm至5000μm范围内，例如，500μm至2000μm，或500μm至1500μm，或500μm至1250μm，或500μm至1000μm，或1000μm至5000μm，或1000μm至2000μm，或1000μm至1500μm。如本文所用，在孔隙太小无法进行方便的光学测量的情况下，通过毛细管流动法测量平均孔径。本领域普通技术人员将认识到，1μm至5000μm范围内的孔径可以约等于或大于大多数细胞的尺寸。然而，本发明人已经确定，多孔管可以有利地促进以期望流速灌注培养基而不明显干扰和/或减少培养细胞的计数，尤其是当与外过滤层一起使用的时候。
44.多孔管可以具有广泛范围内的孔隙率，本领域普通技术人员将选择提供机械稳定
性和流速的所需组合的孔隙率。在如本文另外描述的某些实施例中，多孔管具有在10％至90％.范围内的孔隙率。本领域普通技术人员将理解，孔隙率，是制品中孔隙的体积相对于材料的总体积的测量，可以通过多种已知的孔隙率测定法来测量；如本文所用，在孔隙太小无法进行方便的光学测量的情况下，使用水蒸发测量管的孔隙率。在如本文另外描述的某些实施例中，多孔管的孔隙率在20％至90％，或30％至90％，或40％至90％，或50％至90％，或10％至80％，或10％至70％，或10％至60％，或10％至50％，或20％至80％，或30％至70％，或40％至60％范围内。
45.可以通过各种本领域公认的方法中的任一种提供多孔管的孔隙率，例如，模制、热穿孔、激光钻孔、电子束钻孔、电火花加工、机械钻孔、冲压或切割。
46.在如本文另外描述的某些期望实施例中，第一多孔管的孔隙率的大部分位于与第二液体可渗透的管相对的表面(例如，半圆柱表面)上。有利地，本发明人已经确定，远离第二液体可渗透的管的管孔隙率的方向可以进一步最小化受从第二液体可渗透的管灌注到第一液体可渗透的管的培养基影响的培养细胞的干扰和/或减少。因此，在如本文另外描述的某些实施例中，第一多孔管的至少65％，或至少75％，或至少85％，或至少90％的孔隙率位于与第二液体可渗透的管相对的表面(例如，半圆柱表面)上。
47.在如本文另外描述的某些期望的实施例中，第一多孔管的孔隙率沿着液体可渗透的管的中心腔的轴线相对均匀地分布，即，以促进沿着袋的主轴线均匀灌注。
48.如上所述，第一管可包含围绕第一内支撑结构布置的第一外过滤层。第一外过滤层由多孔材料形成，其具有经选择的平均孔径，用来帮助防止细胞在灌注期间从袋中逸出。在某些实施例中，选择小于袋中待生长的细胞的平均尺寸的平均孔径。然而，在另一些实施例中，平均孔径可大于袋中待生长细胞的平均尺寸；本发明人已经确定，即使布置为如本文所述的更大孔隙的材料也可以提供阻力，以使细胞流过第一外过滤层并流出第一管，例如，通过提供流动动力，防止细胞强烈地推动第一外过滤层。在如本文另外描述的某些实施例中，第一外过滤层具有小于50μm的平均孔径，例如，小于20μm。在如本文另外描述的某些实施例中，第一外过滤层具有小于10μm的平均孔径。例如，在如本文另外描述的某些实施例中，第一外过滤层的平均孔径小于5μm，或小于3μm，或小于2μm。本领域普通技术人员将认识到，10μm或更小的孔径可以约等于或小于大多数细胞(取决于细胞)——令人惊讶的是，本发明人已经确定，外过滤层(例如，相对于培养细胞具有较小的功能孔径)和内支撑结构(例如，相对于培养细胞具有较大的功能孔径或间距)的组合，可以促进培养基以期望的流速灌注而不明显干扰和/或减少培养细胞的计数。但即使当过滤孔径略大于细胞尺寸时，过滤也能有效防止灌注期间细胞从内部体积中显著流失。
49.在某些期望的实施例中，第一外过滤层具有小于约100％的平均孔径和/或d99孔径，例如，小于约75％，或小于约50％，或小于约40％，或小于约30％，或小于约25％的袋内培养细胞类型的平均直径。例如，本发明人已经确定，小于10μm的第一外过滤层的平均孔径，例如，5μm，小于3μm，或甚至小于2μm，可以在灌注期间有利地帮助保留间充质干细胞(例如，具有约10μm至13μm的平均直径)。在另一个实例中，本发明人已经确定，小于1μm，小于600nm，或甚至小于500nm的第一外过滤层的平均孔径可以在灌注期间有利地帮助保留红细胞(例如，具有约2μm至3μm的平均直径)。但是，如上所述，即使在过滤孔径略大于细胞尺寸的情况下，过滤也可以有效防止灌注期间细胞从内部体积大量流失，尤其是取决于第一孔
口和第二孔口和管在内部体积内的位置。
50.本领域普通技术人员将理解，过滤层的“功能”孔径取决于层内孔隙的平均尺寸和最大尺寸两者。因此，在如本文另外描述的某些期望的实施例中，过滤层的d99孔径(即，在尺寸上处于第99个百分位的孔隙的尺寸)与过滤层的平均孔径相差至多100％，例如，至多50％，至多30％，或至多10％。在如本文另外描述的某些期望的实施例中，过滤层的d99孔径小于50μm，例如小于20μm。在如本文另外描述的某些实施例中，第一外过滤层具有小于10μm的d99孔径。例如，在如本文另外描述的某些实施例中，第一外过滤层的d99孔径小于5μm，或小于3μm，或小于2μm。
51.然而，如本领域普通技术人员将理解的，第一外过滤层的较小的平均孔径会减慢流过袋。因此，本领域普通技术人员可以选择足够小的孔径以便为所需的细胞类型提供过滤，但又足够大的孔径以便提供通过袋所需的流速。例如，在如本文另外描述的某些实施例中，第一外过滤层的平均孔径为至少200nm，例如，至少400nm，至少750nm，或甚至至少1000nm。例如，在某些实施例中，第一外过滤层的平均孔径在1至10μm范围内，例如1至7μm，或2至10μm，或2至7μm。
52.并且如上所述，即使当平均孔径大于细胞尺寸时，本文所述的布置可以帮助防止细胞流过第一管。使用更大的平均孔径也可帮助改善通过系统的流速。因此，在某些实施例中，第一外过滤层的平均孔径在5微米至50微米范围内，例如，在5微米至20微米，或10微米至50微米，或10微米至30微米范围内。
53.在如本文另外描述的某些期望的实施例中，第一外过滤层包括(例如，形成于)具有水中总有机碳小于0.1mg/cm2的聚合物。在如本文另外描述的某些实施例中，第一外过滤层包括聚酯或聚醚砜。其他合适的材料包含pvdf、尼龙和亲水性ptfe。
54.然而，在如本文另外描述的袋的其他实施例中，第一管不包含从支撑结构分离出来的过滤层，而是具有如本文针对第一外过滤层所描述的平均孔径的管。例如，这可以通过将多孔膜材料制作成管(例如，通过焊接)，或通过提供具有所需孔径的刚性管状材料来制成。在如本文另外描述的某些实施例中，第一管具有小于50μm的平均孔径，例如，小于20μm。例如，在如本文另外描述的某些实施例中，第一管的平均孔径小于10μm，例如，小于5μm，或小于3μm，或小于2μm。在某些期望的实施例中，第一管具有小于约100％的平均孔径和/或d99孔径，例如，小于约75％，或小于约50％，或小于约40％，或小于约30％，或小于约25％的袋内培养细胞类型的平均直径，例如，如上文关于第一外过滤层所描述的。在如本文另外描述的某些期望的实施例中，第一管的d99孔径(即，在尺寸上处于第99个百分位的孔径的尺寸)与第一管的平均孔径相差至多50％，例如，至多30％，或至多10％。在如本文另外描述的某些期望的实施例中，第一管的d99孔径小于50μm，例如，小于20μm。在如本文另外描述的某些实施例中，第一管具有小于10μm的d99孔径。例如，在如本文另外描述的某些实施例中，第一管的d99孔径小于5μm，或小于3μm，或小于2μm。在如本文另外描述的某些实施例中，第一管的平均孔径为至少200nm，例如，至少400nm，至少750nm，或甚至至少1000nm。在如本文另外描述的某些实施例中，第一管的平均孔径在5微米至50微米范围内，例如，在5微米至20微米，或10微米至50微米，或10微米至30微米范围内。在某些期望的实施例中，第一管是刚性的，即，足够刚性的以保持其横截面形状而没有流体流过其中的压力。
55.由于第二液体可渗透的管(例如，图1的管180)通常用于将培养基输入到袋的内部
隔室中，因此在许多实施例中其不需要具有过滤层。因此，在某些实施例中，第二液体可渗透的管可以如上文针对第一液体可渗透的管的多孔管支撑结构所描述的那样，不具有外过滤层。第二液体可渗透的管可以采用各种其它管状结构。
56.然而，在如本文另外描述的其他实施例中，第二液体可渗透的管包括第二内支撑结构，限定管的中心腔；以及第二外过滤层，围绕第二内支撑结构。并且在另一些实施例中，第二液体可渗透的管是具有不超过50微米的平均孔径的管。在此类实施例中，第二液体可渗透的管可以如本文任何实施例中针对第一液体可渗透的管所描述的那样。有利地，此种袋允许如上所述的培养基流动——从第二管，通过内部体积，并流出第一管——以及反向。本发明人已经确定，在此类实施例中，通过逆转灌注方向，可以从第一外过滤层移除细胞，但将其保留在内部隔室中。当然，这此种“双向”袋也可以促进用户进行更方便的设置和操作。在某些期望的实施例中，第二液体可渗透的管的内支撑结构和外过滤层如本文关于第一液体可渗透的管的任一项实施例所描述的那样。如图2和图3所示的结构，在某些实施例中，可用作第二液体可渗透的管。
57.例如，在如本文另外描述的某些实施例中，第二内支撑结构包括螺旋缠绕的丝状物(例如，上述的螺旋缠绕的丝状物)。在某些此类实施例中，第一液体可渗透的管的第一内支撑结构还包括螺旋缠绕的丝状物。类似地，在如本文另外描述的某些其他实施例中，第二内支撑结构包括框架结构。在某些此类实施例中，第一液体可渗透的管的第一内支撑结构还包括框架结构
58.在另一个示例中，在如本文另外描述的某些实施例中，第二内支撑结构包括多孔管(例如，如上所述的多孔管)。例如，在如本文另外描述的某些实施例中，第一内支撑结构包括第一多孔管，并且第二内支撑结构包括第二多孔管。在某些此类实施例中，第二多孔管(例如，和第一多孔管)具有在1μm至5000μm范围内的功能孔径，例如，1μm至1000μm，或100μm至5000μm，或500μm μm至5000μm。在某些此类实施例中，第二多孔管(例如，和第一多孔管)具有在10％至90％、或20％至80％、或30％至70％范围内的孔隙率。在某些此类实施例中，第二多孔管的至少60％，或至少75％，或至少90％的孔隙率位于与第一液体可渗透的管相对的表面(例如，半圆柱表面)上。并且第一多孔管的至少60％，或至少75％，或至少90％的孔隙率位于与第二液体可渗透的管相对的表面(例如，半圆柱表面)上。在某些实施例中，第二多孔管(例如，和第一多孔管)包括有机硅弹性体。在某些实施例中，第二外过滤层(例如，和第一外过滤层)具有小于10μm的平均孔径，例如小于5μm，或小于3μm，或小于2μm。在如本文另外描述的某些实施例中，第二外过滤层的平均孔径为至少200nm，例如，至少400nm，至少750nm，或甚至至少1000nm。在某些实施例中，第二外过滤层(例如，和第一外过滤层)包括聚酯或聚醚砜。
59.并且在另一些实施例中，第二液体可渗透的管是不包含第二支撑结构和第二外过滤层的管，而是呈具有如本文针对第二外过滤层所描述的孔径的管的形式。例如，这可以通过将多孔膜材料制作成管(例如，通过焊接)，或通过提供具有所需孔径的刚性管状材料来制成。在如本文另外描述的某些实施例中，第二管具有小于50μm的平均孔径，例如，小于20μm。例如，在如本文另外描述的某些实施例中，第二管的平均孔径小于10μm，例如，小于5μm，或小于3μm，或小于2μm。在某些期望的实施例中，第二管具有小于约100％的平均孔径和/或d99孔径，例如，小于约75％，或小于约50％，或小于约40％，或小于约30％，或小于约25％的
袋内培养细胞类型的平均直径，例如，如上文关于第一外过滤层所描述的。在如本文另外描述的某些期望的实施例中，第二管的d99孔径(即，在尺寸上处于第99个百分位的孔径的尺寸)与第二管的平均孔径相差至多50％，例如，至多30％，或至多10％。在如本文另外描述的某些实施例中，第二管的平均孔径为至少200nm，例如，至少400nm，至少750nm，或甚至至少1000nm。在某些期望的实施例中，第二管是刚性的，即，足够刚性的以保持其横截面形状而没有流体流过其中的压力。
60.在第二液体可渗透的管被第二过滤层覆盖或具有如上所述的较小的孔径的情况下，可能需要存在第三孔口以简化将细胞引入袋的内部体积和/或从袋的内部体积移除细胞。
61.如本文所用，总有机碳(toc)是有机化合物中结合的碳的含量，并且通常用于药物制造设备除此之外的非特异性指标。总有机碳被用于生物技术行业的流程控制属性，以监测采用净化和分配系统的单元操作的性能。
62.总有机碳是通过从容器的内置表面面积或另一个物品的表面面积中提取来测量的(以mg/cm2为单位提供结果，每平方厘米表面面积的总可提取有机碳)。通过在70℃下与给定体积的纯化水接触24小时来提取材料。
63.氟化乙烯丙烯容器(即，使用fep膜)的总有机碳值的一个实例为＜0.01mg/cm2。针对有机硅管材，提取比例可以为14.6cm2/ml(例如，biosil)或可以为15.9cm2/ml(例如，sr139)，并且有机硅biosil管的总有机碳值的一个实例为0.021mg/cm2，有机硅sr139管材的总有机碳值的一个实例为0.008mg/cm2。针对至少某些有机硅管材，由于提取的体积和浓度导致该值高于机器的最大检测值，因此样品可能会被稀释。稀释和不同的提取比例需要将这些样品与袋样品进行对比，以提供重量/面积值。
64.热塑性弹性体(tpe)的总有机碳值的一个实例为0.002mg/cm2。氟化乙烯丙烯的总有机碳值的一个实例为0.00005mg/cm2。有机硅总有机碳值的一个实例为0.021mg/cm2。pmp膜的总有机碳值的一个实例为0.00001mg/cm2。历史上使用过的细胞培养袋的总有机碳值的一个实例为物品内部湿润表面的0.002mg/cm2(物品的0.032mg/g)。
65.如本文所量化，根据美国药典(usp)643使用利用紫外线促进化学氧化的高温湿氧化反应的设备测量总有机碳(超洁净技术手册：第1卷：ultra-pure water，ohmi，tadahiro；crc出版社，1993年，第497至517页)。以3cm2制品表面面积与1ml水的比例，将纯化水在70℃下置于聚合物中接触24小时。移除与聚合物接触的水并在toc分析仪中进行测试。合适的设备为tekmar dohrmann型号phoenix 8000 toc分析仪。
66.在如本文另外描述的某些实施例中，构成袋的每一个聚合物膜(例如，图1的膜110和膜120)是气体可渗透的并且包括具有水中总有机碳小于0.1mg/cm2的聚合物。
67.例如，在如本文另外描述的某些实施例中，构成袋的每一个聚合物膜包括(或形成于)具有水中总有机碳小于1mg/cm2，或0.9mg/cm2，或0.8mg/cm2，或0.7mg/cm2，或0.6mg/cm2，或0.5mg/cm2，或0.4mg/cm2，或0.3mg/cm2，或0.2mg/cm2，或0.1mg/cm2，或0.09mg/cm2，或0.08mg/cm2，或0.07mg/cm2，或0.06mg/cm2，或0.05mg/cm2，或0.04mg/cm2，或0.03mg/cm2，或0.02mg/cm2，或0.01mg/cm2，或0.009mg/cm2，或0.008mg/cm2，或0.007mg/cm2，或0.006mg/cm2，或0.005mg/cm2，或0.004mg/cm2，或0.003mg/cm2，或0.002mg/cm2，或0.001mg/cm2的聚合物。
68.例如，在如本文另外描述的某些实施例中，构成袋的每一个聚合物膜包括(或形成于)具有水中总有机碳在0.001mg/cm2至0.1mg/cm2，或0.001mg/cm2至0.095mg/cm2，或0.001mg/cm2至0.075mg/cm2，或0.001mg/cm2至0.05mg/cm2，或0.001mg/cm2至0.01mg/cm2，或0.001mg/cm2至0.005mg/cm2，或0.001mg/cm2至0.025mg/cm2范围内的聚合物。在如本文另外描述的某些实施例中，构成袋的每一个聚合物膜包括(或形成于)具有水中总有机碳在0.01mg/cm2至0.1mg/cm2，或0.01mg/cm2至0.075mg/cm2，或0.01mg/cm2至0.05mg/cm2，或0.01mg/cm2至0.025mg/cm2范围内的聚合物。在某些实施例中，构成袋的每一个聚合物膜包括(或形成于)具有水中总有机碳在0.05mg/cm2至0.1mg/cm2，或0.05mg/cm2至0.09mg/cm2，或0.05mg/cm2至0.075mg/cm2，或0.05mg/cm2至0.06mg/cm2范围内的聚合物。在某些实施例中，第一聚合物膜和第二聚合物膜中的每一个都包括具有水中总有机碳在0.005mg/cm2至0.1mg/cm2，0.005mg/cm2至0.095mg/cm2，0.005mg/cm2至0.075mg/cm2，0.005mg/cm2至0.05mg/cm2，0.005mg/cm2至0.025mg/cm2，或0.005mg/cm2至0.01mg/cm2范围内的聚合物。
69.在如本文另外描述的某些实施例中，构成袋的每一个聚合物膜(例如，图1的膜110和膜120)包括(或形成于)弹性体、含氟聚合物、聚甲基戊烯，或其任何组合。例如，在如本文另外描述的某些实施例中，第一聚合物膜和第二聚合物膜中的每一个都包括(例如，是)天然聚异戊二烯橡胶(nr)、合成聚异戊二烯橡胶(ir)、聚丁二烯橡胶(br)、氯丁二烯橡胶(cr)、丁基橡胶(iir)、卤化丁基橡胶(ciir、biir)、苯乙烯-丁二烯橡胶(sbr)、丁腈橡胶(nbr)和氢化腈橡胶(hnbr)、乙烯丙烯橡胶(epm)、乙烯丙烯二烯烃橡胶(epdm)、环氧氯丙烷橡胶(eco)、聚丙烯酸橡胶(acm、abr)、有机硅橡胶(si、q、vmq)、氟硅酮橡胶(fsr、fvmq)、含氟弹性体(fkm、fepm)、全氟弹性体(ffkm)、聚醚嵌段酰胺(peba)、氯磺化聚乙烯(csm)、乙烯-乙烯基醋酸酯(eva)、环烯烃共聚物、聚烯烃弹性体、弹性体pet，或其混合物。
70.本领域普通技术人员将理解，弹性体是具有粘弹性、低结晶度和高非晶态含量的聚合物，与其他材料相比，通常具有低杨氏模量和高断裂伸长率。术语弹性体可与术语橡胶互换使用，但在涉及硫化产品时优选橡胶。弹性体是由碳、氢、氧和/或有机硅单体构成的非晶态聚合物。
71.热塑性聚氨酯(tpu)是本领域已知的。通常，通过使多元醇与异氰酸酯反应形成热塑性聚氨酯。聚氨酯的总体特性将取决于多元醇和异氰酸酯的类型、聚氨酯中的结晶度、聚氨酯的分子量和聚氨酯主链的化学结构。
72.本领域普通技术人员将理解，聚氨酯可以是热塑性的或热固性的，这取决于存在的交联度。取决于反应物的功能，热塑性氨基甲酸酯(tpu)不具有第一交联，而热固性聚氨酯具有不同的交联度。
73.热塑性聚氨酯通常基于亚甲基二异氰酸脂(mdi)或甲苯二异氰酸酯(tdi)，并且包括聚酯级多元醇和聚醚级多元醇两者。热塑性聚氨酯可通过异氰酸酯和多元醇之间的“一次性”反应或通过“预聚物”系统形成，其中将固化剂添加至部分反应的多元醇异氰酸酯络合物中以完成聚氨酯反应。基于“预聚物”的一些常见的热塑性聚氨酯弹性体的实例为：“texin”，拜耳材料科学公司的商品名；“estane”，路博润公司的商品名；“pellethane”，陶氏化学公司的商品名；以及“elastollan”，巴斯夫公司的商品名。
74.热塑性有机硅包含，但不限于140 silicone tpe、200 silicone tpe elastomer(90％聚二甲基硅氧烷和异氰酸酯)、
60 silicone tpe、80 silicone tpe和145 tpe，其中所有都包括90％聚二甲基硅氧烷和异氰酸酯。
75.当然，热塑性塑料的其它结构(弹性体和非弹性体)和含氟聚合物结构也可用于控制复合材料的气体渗透性，同时包含低toc流体接触层。气体渗透性的控制可以是为了产生高或低气体可渗透的复合材料的目的。热塑性弹性体(tpe)的实例包含苯乙烯嵌段共聚物(tpe-s)、烯烃(tpe-o)、合金(tpe-v或tpv)、聚氨酯(tpu)、共聚酯和聚酰胺。非弹性体热塑性塑料的实例包含丙烯酸、丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)、尼龙、聚乳酸(pla)、聚苯并咪唑(pbi)、聚碳酸酯(pc)、聚醚砜(pes)、聚醚醚酮(peek)、聚醚酰亚胺(pei)、聚乙烯(pe)、聚苯醚(ppo)、聚苯硫醚(pps)、聚丙烯(pp)、聚苯乙烯(ps)和聚氯乙烯(pvc)、乙烯乙烯醇(evoh)，以及任何传统的单体结构已被改性以降低结晶度并增加韧性的刚性聚合物。
76.在如本文另外描述的某些实施例中，第一聚合物膜和第二聚合物膜中的每一个都包括(例如，是)含氟聚合物。例如，在某些此类实施例中，第一聚合物膜和第二聚合物膜中的每一个都包括(例如，是)fep(氟化乙烯丙烯)、tfe(四氟乙烯)、pfa(全氟烷氧基烷烃)、pvf(聚氟乙烯)、pvdf(聚乙烯氟化物)、ptfe(聚四氟乙烯)、3m
tm dyneon
tm tfm
tm
改性ptfe、pctfe(聚三氟氯乙烯)、hte(四氟乙烯/六氟丙烯/乙烯共聚物)、etfe(聚四氟乙烯)、ectfe(聚四氟氯乙烯)、ffpm/ffkm(全氟弹性体)、fpm/fkm(三氟氯乙烯/亚乙烯基氟化物共聚物)、pfpe(全氟聚醚)、mfa(四氟乙烯和香料甲基乙烯基醚共聚物)、ctfe/vdf(三氟氯乙烯-亚乙烯基氟化物共聚物)、tfe/hfp(四氟乙烯-六氟丙烯共聚物)、三氟氯乙烯/六氟丙烯、thv(六氟丙烯/四氟乙烯/亚乙烯基共聚物)、具有官能化聚合物端基的全氟(1-丁烯基乙烯基醚)均聚环聚合物，或其混合物。
77.在某些实施例中，第一聚合物膜和第二聚合物膜包括pmp(聚甲基戊烯)，甲基戊烯单体单元的热塑性聚合物。其已用于气体可渗透的包装、抗高温高压灭菌的医疗和实验室设备、用微波炉加热的部件和炊具。其可以作为tpx
tm
从纽约州莱伊布鲁克的美国三井化学公司(mitsui chemicals america，inc，rye brook，ny)商购获得。
78.在某些实施例中，如本文另外描述的袋的第一聚合物膜和第二聚合物膜包括单层弹性体，诸如热塑性有机硅(例如瓦克化学公司(wacker chemie ag)的一种聚二甲基硅氧烷/脲共聚物)或具有如本文所描述的toc和渗透性特性的含氟聚合物。
79.在另一些实施例中，构成袋的每一个聚合物膜包括(或形成于)包含本文中所描述的材料的层压材料。例如，在如本文另外描述的某些实施例中，构成袋的每一个聚合物膜(例如，图1的膜110和膜120)包括(或形成于)包括包含含氟聚合物的内层(例如，氟化乙烯丙烯)和包含有机硅弹性体的外层，形成袋的内部隔室(例如，内部隔室130)的每一个膜的内层和形成袋的外部表面的每一个膜的外层。例如，美国专利号9926524(其全文以引用方式并入本文)中描述的此类材料。
80.在如本文另外描述的某些实施例中，构成袋的聚合物膜中的至少一个(例如，每一个)具有至少100cc/m2/day，最好是至少500cc/m2/day，或最好是至少1000cc/m2/day，或至少1500cc/m2/day，或至少2000cc/m2/day，或甚至至少2200cc/m2/day的气体渗透性(例如，氧气渗透性)。例如，在如本文另外描述的某些实施例中，构成袋的每一个聚合物膜包括(或形成于)弹性体含氟聚合物复合材料并且具有至少100cc/m2/day，或至少500cc/m2/day，或
至少1000cc/m2/day，或至少1500cc/m2/day，或至少2000cc/m2/day，或甚至至少2200cc/m2/day的气体渗透性(例如，氧气渗透性)。在某些实施例中，构成袋的聚合物膜中的至少一个(例如，每一个)具有在1000至25000cc/m2/day范围内的气体渗透性。根据astm d3985，在25℃下使用mocon ox-tran 2/21h氧气分析仪测量氧气渗透性。在膜渗透性的另一方面，标准化单位(cc-mm/m
2-day)可用于显示任何厚度的膜。例如，针对5mm膜的转换范围将在25℃的温度下，从约12.7cc-mm/m
2-day至至少约279cc-mm/m
2-day。由于结构/复合材料的渗透性将包括两层，因此可以用cc/m2表达方式表示。
81.类似地，第一流体可渗透的管和第二流体可渗透的管中的每一个都可以由低toc材料制成。在如本文另外描述的某些实施例中，第一管和第二管中的每一个都由具有总有机物含量小于0.1mg/cm2的聚合物形成，例如，小于0.09mg/cm2，或0.08mg/cm2，或0.07mg/cm2，或0.06mg/cm2，或0.05mg/cm2，或0.04mg/cm2，或0.03mg/cm2，或0.02mg/cm2，或0.01mg/cm2，或0.009mg/cm2，或0.008mg/cm2，或0.007mg/cm2，或0.006mg/cm2，或0.005mg/cm2，或0.004mg/cm2，或0.003mg/cm2，或0.002mg/cm2，或0.001mg/cm2。
82.本文所述的袋在细胞培养系统中特别有用。因此，本公开的另一方面是包括如本文所描述的袋的细胞培养系统。图4示出此种系统的一个实施例的剖视图。由第一聚合物膜402和第二聚合物膜404形成的袋400面向支撑物410，使得第一液体可渗透的管406和第二液体可渗透的管408相对于第一聚合物膜402的大部分升高。图5示出此种系统的另一个实施例的剖视图。由第一聚合物膜502和第二聚合物膜504形成的袋500面向支撑物510，使得第一液体可渗透的管506相对于第二液体可渗透的管508升高。这允许细胞聚集于袋的相对低的表面上(如图所示朝向)，在管的区域中具有来自流体流动的相对低的干扰程度。
83.如上所述，本发明人已确定，本文所描述的袋和系统可用于通过细胞培养灌注培养基。因此，本公开的另一方面是培养细胞的方法，其包含提供如本文另外描述的袋或系统(例如，图1的袋100)，其包含在内部隔室(例如，内部隔室130)中的培养基和细胞，以及通过经第二孔口(例如，孔口150)并经第二液体可渗透的管(例如，管180)添加培养基，且经第一液体可渗透的管(例如，管170)并经第一孔口(例如，孔口140)移除培养基，使培养基流过内部隔室。在某些此类实施方案中，可以通过经形成于袋的外部表面并与袋的内部隔室成流体连通的第三孔口(例如，图1的袋100的孔口160)向袋中添加培养基和细胞来提供在内部隔室中包含培养基和细胞的袋或系统。可以使用各种流速，例如，在0.5至20ml/min范围内；流速期望地足够低以允许细胞通过重力沉降保持于袋的底部处。当然，在正常操作的过程中，流速可能会发生变化，甚至可能是不连续的(例如，偶然地，或基于细胞活动)。因此，在另一个实例中，流速可以在每天0.2至2袋体积更换物范围内。在灌注期间，袋可以保持在所需要的孵育温度，并且可以摇动或以其它方式搅动。
84.当包含第三孔口时，可以通过第三孔口从内部隔室中移除经培养的细胞。可以用其它方式移除经培养的细胞，例如，通过第二孔口。
85.在某些实施例中，该方法进一步包含在通过经第二孔口并经第二液体可渗透的管添加培养基，且经第一液体可渗透的管并经第一孔口移除培养基，使培养基流过内部隔室之后，通过经第一孔口并经第一液体可渗透的管添加培养基，且经第二液体可渗透的管并经第二孔口移除培养基，使培养基流过内部隔室，来逆转流动方向。这有助于从第一外过滤层冲洗细胞或任何其他颗粒。当袋包括上述的第二外过滤层或小孔隙的多孔的第二管时，
此类实施例可能是特别有利的。然而，即使在其他结构中，短暂的反向流动也可以冲洗第一外过滤层，而不会显著地将细胞拉过第二管。
86.在一个实例中，使用由5-mil fep膜形成的三孔口160ml vuelife细胞培养袋构造灌注袋。具有0.25英寸的外径、0.1875英寸的内径、8英寸的长度的经穿孔的(约3mm洞孔)fep管，与具有6μm的功能孔径的聚酯过滤器配合，插入到袋的第一孔口和第三孔口，并且这些孔口围绕管进行套环式密封。管材连接至第二孔口以及第一管和第二管，源料袋连接至第二管，并且废物袋连接至第一管。
87.在基本流量评估的初始构造中，充满源料袋，相对于测试袋升高，并略微倾斜。将测试袋置于网状盒中以限制其厚度，然后从已启动的源料袋中流动红染水。在重力作用下，不需要人工协助，培养基充满测试袋并开始移入废物袋，没有由过滤物造成的明显延迟。然后将介于测试袋和废物袋之间的管材放置在watson-marlow泵中。该系统在从2至10rpm转速的测试范围内运转良好(针对使用的管材，根据制造商的性能建议，这相当于额定的0.9至4.7ml/min的流速)。允许系统以6rpm(2.8ml/min)运行大约一个小时，显然达到了稳定的匀速状态。用蓝染水的源料袋取代红染水的源料袋，而不排空测试袋。以6rpm运转灌注。虽然蓝染水的行进前方未沿着袋完全地变均匀，但其确实没有死角的取代了所有的红染水。蓝染水的行进似乎受到袋膜中的波纹(在高压灭菌袋中很常见)和袋中存有大量空气的影响；这些，而不是流体可渗透的管的使用，似乎是主导因素。因此，如本文所述的液体可渗透的管的使用可以提供有效的袋的内部隔室的灌注。
88.在vuelife 290-c袋中补充有重组il-2的texmacs
tm
培养基中扩增10天后，收获人类t细胞。t细胞以0.5
×
106个/ml的密度接种到测试袋中的160ml texmacs
tm
培养基中，并在37℃、5％co2、环境氧气中采用灌注方法培养24小时。在24小时培养期后，经由第三孔口从aln 2袋中采集细胞培养样品并分析细胞计数和活力。如下表所示，细胞活力保持在90.9％的高水平，并且细胞数量保持稳定。此外，揉按袋子以确保细胞均匀分布，以及能够采集附着到用于细胞计数的测试样品中的过滤器的细胞。分析了三个样品，并示出相同数量的细胞计数和活力测量值。
[0089] 开始培养24h后(灌注)72h后(无灌注)活力88.0％90.9％85.80％活细胞[
×
106]5077.9255.8总细胞[
×
106]5085.665.12
[0090]
袋中细胞分布的成像显示细胞均匀地分散在整个袋中，并且还在两个过滤器附近/上发现了细胞。在上游培养基袋或下游废物袋中均未发现细胞，表明过滤器如预期的可有效地将细胞群保留在测试袋的内部体积内。样品的显微镜检查表明细胞在整个袋中具有良好的形态。然后将测试袋放回培养系统(静态培养；无灌注)达另外的48小时。之后，再次分析细胞的细胞计数、活力和形态。细胞活力为85.8％，并且发现55.8
×
106个活细胞保持于测试袋中。延长培养期后，细胞形态保持不变，这表明过滤材料不会立即产生细胞毒性或影响该系统中的t细胞命运。
[0091]
下文列出的枚举实施例中涉及了本公开的各种实施例，这些方面能以任意数量或以技术上或逻辑上不矛盾的任意方式来组合。
[0092]
实施例1.一个袋，其包括
[0093]
一个或多个聚合物膜，具有粘结在一起以围绕袋的未分隔的内部隔室形成边缘的边缘；
[0094]
第一孔口，形成于袋的外部表面；
[0095]
第一液体可渗透的管，延伸进入该袋的内部隔室并与袋的内部隔室成流体连通，第一管可操作地联接至第一孔口；
[0096]
第二孔口，形成于袋的外部表面；
[0097]
第二液体可渗透的管，延伸进入该袋的内部隔室并与袋的内部隔室成流体连通，第二管可操作地联接至第二孔口；以及
[0098]
任选地第三孔口，形成于袋的外部表面，该第三孔口与该袋的内部隔室成流体连通；
[0099]
其中第一管包括第一内支撑结构，限定管的中心腔；以及第一外过滤层，围绕第一内支撑结构。
[0100]
实施例2.根据实施例1所述的袋，其中一个或多个聚合物膜包括第一聚合物膜和第二聚合物膜，具有粘结在一起以围绕袋的未分隔的内部隔室形成边缘的边缘。
[0101]
实施例3.根据实施例1或实施例2所述的袋，其中第一内支撑结构包括螺旋缠绕的丝状物。
[0102]
实施例4.根据实施例1或实施例2的所述袋，其中第一内支撑结构包括第一多孔管。
[0103]
实施例5.根据实施例4所述的袋，其中第一多孔管具有在1μm至5000μm(例如，25μm至1000μm，或50μm至5000μm)范围内的平均孔径。
[0104]
实施例6.根据实施例4所述的袋，其中第一多孔管具有在100μm至5000μm(例如，500μm至5000μm，或1,000μm至5000μm)范围内的平均孔径。
[0105]
实施例7.根据实施例4至实施例6中任一项所述的袋，其中第一多孔管具有在10％至90％(例如，30％至70％)范围内的孔隙率。
[0106]
实施例8.根据实施例4至实施例7中任一项所述的袋，其中第一多孔管的至少60％(例如，至少75％，或至少90％)的孔隙率位于与第二液体可渗透的管相对的表面(例如，半圆柱)上。
[0107]
实施例9.根据实施例1至实施例8中任一项所述的袋，其中第一多孔管由聚合物形成。
[0108]
实施例10.根据实施例1至实施例8中任一项所述的袋，其中第一多孔管包括含氟聚合物。
[0109]
实施例11.根据实施例1至实施例10中任一项所述的袋，其中第一外过滤层具有小于50μm的平均孔径，例如，小于20μm。
[0110]
实施例12.根据实施例1至实施例10中任一项所述的袋，其中第一外过滤层具有小于10μm(例如，小于5μm，或小于3μm，或小于2μm)的平均孔径。
[0111]
实施例13.根据实施例1至实施例12中任一项所述的袋，其中第一外过滤层具有至少200nm的平均孔径，例如，至少400nm，至少750nm，或至少1000nm。
[0112]
实施例14.根据实施例1至实施例13中任一项所述的袋，其中第一外过滤层的d99孔径与第一外过滤层的平均孔径相差至多50％，例如，至多30％，或至多10％。
[0113]
实施例15.根据实施例1至实施例14中任一项所述的袋，其中第一外过滤层具有小于50μm的d99孔径，例如，小于20μm。
[0114]
实施例16.根据实施例1至实施例14中任一项所述的袋，其中第一外过滤层具有小于10μm的d99孔径(例如，小于5μm，或小于3μm，或小于2μm)。
[0115]
实施例17.根据实施例1至实施例16中任一项所述的袋，其中第一外过滤层具有至少200nm的平均孔径，例如，至少400nm，至少750nm，或至少1000nm)。
[0116]
实施例18.根据实施例1至实施例10和实施例14中任一项所述的袋，其中第一外过滤层的平均孔径在5微米至50微米范围内，例如，在5微米至20微米，或10微米至50微米，或10微米至30微米范围内。
[0117]
实施例19.根据实施例1至实施例10和实施例14中任一项所述的袋，其中第一外过滤层具有小于约100％的平均孔径和/或d99孔径，例如，小于约75％，或小于约50％，或小于约40％，或小于约30％，或小于约25％的袋内培养细胞类型的平均直径。
[0118]
实施例20.根据实施例1至实施例19中任一项所述的袋，其中第一外过滤层包括聚酯或聚醚砜。
[0119]
实施例21.根据实施例1至实施例20中任一项所述的袋，其中第二管包括第二内支撑结构，限定管的中心腔；以及第二外过滤层，围绕第二内支撑结构
[0120]
实施例22.根据实施例21所述的袋，其中第二内支撑结构包括螺旋缠绕的丝状物。
[0121]
实施例23.根据实施例21所述的袋，其中第二内支撑结构包括第二多孔管。
[0122]
实施例24.根据实施例23所述的袋，其中第二多孔管具有在1μm至5000μm(例如，25μm至1000μm，或50μm至5000μm)范围内的平均孔径。
[0123]
实施例25.根据实施例23所述的袋，其中第二多孔管具有在100μm至5000μm(例如，500μm至5000μm，或1,000μm至5000μm)范围内的平均孔径。
[0124]
实施例26.根据实施例24或实施例25所述的袋，其中第二多孔管具有在10％至90％(例如，30％至70％)范围内的孔隙率。
[0125]
实施例27.根据实施例23至实施例26中任一项所述的袋，其中第二多孔管的至少60％(例如，至少75％，或至少90％)的孔隙率位于与第一液体可渗透的管相对的表面(例如，半圆柱)上。
[0126]
实施例28.根据实施例23至实施例27中任一项所述的袋，其中第二多孔管由聚合物形成。
[0127]
实施例29.根据实施例23至实施例27中任一项所述的袋，其中第二多孔管包括含氟聚合物。
[0128]
实施例30.根据实施例21至实施例29中任一项所述的袋，其中第二外过滤层具有小于50μm的平均孔径，例如，小于20μm。
[0129]
实施例31.根据实施例21至实施例29中任一项所述的袋，其中第二外过滤层具有小于10μm(例如，小于5μm，或小于3μm，或小于2μm)的平均孔径。
[0130]
实施例32.根据实施例21至实施例31中任一项所述的袋，其中第二外过滤层具有至少200nm的平均孔径，例如，至少400nm，至少750nm，或至少1000nm。
[0131]
实施例33.根据实施例21至实施例32中任一项所述的袋，其中第二外过滤层的d99孔径与第二外过滤层的平均孔径相差至多50％，例如，至多30％，或至多10％。
[0132]
实施例34.根据实施例21至实施例33中任一项所述的袋，其中第二外过滤层具有小于50μm的d99孔径，例如，小于20μm。
[0133]
实施例35.根据实施例21至实施例33中任一项所述的袋，其中第二外过滤层具有小于10μm的d99孔径(例如，小于5μm，或小于3μm，或小于2μm)。
[0134]
实施例36.根据实施例21至实施例35中任一项所述的袋，其中第二外过滤层具有至少200nm的平均孔径，例如，至少400nm，至少750nm，或甚至至少1000nm。
[0135]
实施例37.根据实施例21至实施例30和实施例35中任一项所述的袋，其中第二外过滤层的平均孔径在5微米至50微米范围内，例如，在5微米至20微米，或10微米至50微米，或10微米至30微米范围内。
[0136]
实施例38.根据实施例21至实施例39和实施例33中任一项所述的袋，其中第二外过滤层具有小于约100％的平均孔径和/或d99孔径，例如，小于约75％，或小于约50％，或小于约40％，或小于约30％，或小于约25％的袋内培养细胞类型的平均直径。
[0137]
实施例39.根据实施例21至实施例38中任一项所述的袋，其中第二外过滤层包括聚酯或聚醚砜。
[0138]
实施例40.根据实施例1至实施例39中任一项所述的袋，其中第一液体可渗透的管和第二液体可渗透的管中的每一个都包括具有水中总有机碳(toc)小于0.1mg/cm2的聚合物。
[0139]
实施例41.根据实施例1至实施例40中任一项所述的袋，其中一个或多个聚合物膜中的每一个都是气体可渗透的并且包括具有水中总有机碳(toc)小于0.1mg/cm2的聚合物。
[0140]
实施例42.根据实施例1至实施例41中任一项所述的袋，其中一个或多个聚合物膜中的每一个都包括弹性体、含氟聚合物、聚甲基戊烯(pmp)，或其任何组合。
[0141]
实施例43.根据实施例1至实施例41中任一项所述的袋，其中一个或多个聚合物膜中的每一个都包括含氟聚合物。
[0142]
实施例44.根据实施例43所述的袋，其中含氟聚合物为聚四氟乙烯(ptfe)、全氟烷氧基烷烃(pfa)、乙烯四氟乙烯(etfe)、聚乙烯氟化物(pvdf)、聚三氟氯乙烯(pctfe)、乙烯三氟氯乙烯(ectfe)、氟化乙烯丙烯(fep)、乙烯氟化乙烯丙烯(efep)、全氟聚醚(pfpe)、改性聚四氟乙烯(tfm)、聚偏二氟乙烯(pvf)，或其任何混合物的组合。
[0143]
实施例45.根据实施例1至实施例41中任一项所述的袋，其中一个或多个聚合物膜中的每一个都包括包含含氟聚合物的内层和包含有机硅弹性体的外层，形成袋的内部隔室的每一个膜的内层和形成袋的外部表面的每一个膜的外层。
[0144]
实施例46.一个袋，其包括
[0145]
一个或多个聚合物膜，具有粘结在一起以围绕袋的未分隔的内部隔室形成边缘的边缘；
[0146]
第一孔口，形成于袋的外部表面；
[0147]
第一液体可渗透的管，延伸进入该袋的内部隔室并与袋的内部隔室成流体连通，第一管可操作地联接至第一孔口；
[0148]
第二孔口，形成于袋的外部表面；
[0149]
第二液体可渗透的管，延伸进入该袋的内部隔室并与袋的内部隔室成流体连通，第二管可操作地联接至第二孔口；以及
[0150]
任选地第三孔口，形成于袋的外部表面，该第三孔口与该袋的内部隔室成流体连通；
[0151]
其中第一管具有不超过50微米的平均孔径。
[0152]
实施例47.根据实施例46所述的袋，其中第一管具有如实施例11至实施例19中任一项中针对第一外过滤层所描述的孔径。
[0153]
实施例48.根据实施例46或实施例47所述的袋，其中第二管具有不超过50微米的平均孔径。
[0154]
实施例49.根据实施例48所述的袋，其中第二管具有如实施例30至实施例38中任一项中针对第二外过滤层所描述的孔径。
[0155]
实施例50.根据实施例46至实施例49中任一项所述的袋，如关于实施例2和实施例40至实施例45中的任一项所进一步描述的。
[0156]
实施例51.一种细胞培养系统，包括根据实施例1至实施例50中任一项所述的袋，面向支撑物，使得第一液体可渗透的管和第二液体可渗透的管相对于袋的第一聚合物膜的大部分升高。
[0157]
实施例52.一种细胞培养系统，包括根据实施例1至实施例50中任一项所述的袋，面向支撑物，使得第一液体可渗透的管相对于第二液体可渗透的管升高。
[0158]
实施例53.一种用于培养细胞的方法，其包括
[0159]
提供根据实施例1至实施例52中任一项所述的袋或实施例55或实施例56中所述的系统，其包含在内部隔室中的培养基和细胞；以及
[0160]
通过经第二孔口并经第二液体可渗透的管添加培养基，且经第一液体可渗透的管并经第一孔口移除培养基，使培养基流过内部隔室。
[0161]
实施例54.根据实施例53所述的方法，该方法进一步包括移除经培养的细胞，例如，当存在第三孔口时通过第三孔口移除。
[0162]
实施例53.根据实施例53或实施例54所述的方法(例如，其中包含第二外过滤层)，并且其中该方法进一步包括在通过经第二孔口并经第二液体可渗透的管添加培养基，且经第一液体可渗透的管并经第一孔口移除培养基，使培养基流过内部隔室之后，通过经第一孔口并经第一液体可渗透的管添加培养基，且经第二液体可渗透的管并经第二孔口移除培养基，使培养基流过内部隔室，来逆转流动方向。
[0163]
本文所述的细节仅以举例方式示出，并且仅用于例示性地讨论本公开的优选实施例，其目的在于提供据信为本公开的各种实施例的原理和概念方面的最有用并且最容易理解的描述。就这一点而言，并未试图以超出对本文所描述的系统和方法的基本理解所必需的程度示出本公开的各种实施例的结构细节，其中结合附图和/或实例进行的描述使得如何在实践中实施本文所描述的系统和方法的多种形式对于本领域的技术人员而言显而易见。因此，在描述本发明所公开的工艺和设备之前，应当理解，本文所述的方面不限于特定的实施例、装置或构造，并因此当然可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定方面的目的，并且除非本文中特别定义，否则并非旨在进行限制。
[0164]
除非本文另外指明或与上下文明显相冲突，否则本文所描述的本系统和方法的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)的术语“一”和“一个”和“所述”及类似的指代物应被理解为涵盖单数和复数两者。本文中数值范围的表述仅仅旨在用作单独提及落入该
范围内的每个单独值的缩略方法。除非本文另外指明，否则将每个单独的值结合到本说明书中，如同在本文中单独列举的那样。还应当理解，每个范围的端点在相对于另一个端点和独立于另一个端点方面都是显著的。
[0165]
除非本文另外指明或以其他方式与上下文明显相冲突，否则本文所述的所有方法均可按任何合适的步骤顺序执行。本文所提供的任何及所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)仅仅旨在是为了更好地示出本文所描述的系统和方法，并且除非另外要求，否则对本文所描述的系统和方法的范围不构成限制。本说明书中的语言不应理解为指示任何非要求保护的元素是实践本文所描述的系统和方法所必不可少的。
[0166]
除非上下文明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，字词“包括”和“包含”等应被理解为具有包含性的含义，而不应被理解为具有排他性或穷举性的含义；也就是说，在“包括但不限于”的意义上使用。使用单数或复数的字词也分别包括复数和单数。此外，在本专利申请中使用的字词“本文”、“上文”、“下文”以及类似意义的字词应当是指整个专利申请，而不是指本专利申请的任何特定部分。
[0167]
如本领域的普通技术人员将理解的，本文所公开的每个实施例可包括其中具体所述的要素、步骤、成分或部件，基本上由所述要素、步骤、成分或部件组成，或由所述要素、步骤、成分或部件组成。如本文所用，过渡术语“包括”或“包含”意指包括但不限于并且允许甚至大量包括未指定的要素、步骤、成分或部件。过渡短语“由......组成”不包括未指定的任何要素、步骤、成分或部件。过渡短语“基本上由......组成”将实施例的范围限制为指定的要素、步骤、成分或部件以及对实施例无实质性影响的那些要素、步骤、成分或部件。
[0168]
除非指明是相反情况，否则说明书和所附权利要求中提出的数值参数是可能根据通过本文所描述的系统和方法寻求获得的所需特性而改变的近似值。至少，而且并非试图将等同原则的适用范围限制在权利要求书的范围内，每个数值参数至少应该根据所报告有效数字的数量，通过应用普通舍入技术来解释。
[0169]
虽然在本公开的系统和方法的广泛范围内所示的数字范围和参数为近似值，但具体实施例中所示的数值会尽可能准确地报告。但是，任何数值固有地含有某些必然产生自它们各自测量值范围内的标准偏差的误差。
[0170]
本文所公开的系统和方法的替代要素或实施例的分组不应理解为限制性的。每个组成员可以单独引用和受权利要求书保护或与组中的其他成员或其中发现的其他要素以任何组合方式引用和受权利要求书保护。预期组的一个或更多个组员可以由于方便和/或专利性的原因包含在组中或从组中删除。当任何此类添加或删除发生时，说明书被视为包含修改的组，从而实现对所附权利要求书中使用的所有markush形式的组的书面说明。
[0171]
本文描述了系统和方法的某些实施例，包含发明人已知的用于实施本公开的系统和方法的最佳模式。当然，这些所述的实施例的变型形式对于本领域的普通技术人员将变得显而易见。本发明人期望技术人员在适当的情况下使用此类变型形式，并且本发明人打算以不同于本文具体描述的方式实践本公开的系统和方法。因此，本公开的实施例包括适用法律允许的随附权利要求书中所述主题的所有修改和等同形式。此外，除非另外指明或以其他方式与上下文明显相冲突，否则本公开涵盖上述元素在其所有可能变型形式中的任意组合。
[0172]
在整个说明书中，对专利和印刷出版物进行了大量引用。每篇引用的参考文献和
印刷出版物全文分别以引用方式并入本文中。
[0173]
此外，应当理解，本文所公开的实施例是对本公开原理的例示性说明。可以采用的其他修改处于本公开范围内。因此，以举例方式但并非限制性地，可根据本文的教导来利用本公开的系统和方法的替代构造。因此，本公开不限于所显示和描述的内容。