1.本发明属于生物传感材料技术领域，具体涉及一种生物传感膜及其制备方法和用途。
背景技术：
2.电化学传感器通过目标分子筛选、特异性识别、信号转导和读出的多功能组合，能够准确快速地检测大量分析物，近年来已被广泛应用到医疗保健、环境监测和生物安全等领域。其中酶作为生物催化剂，对底物的选择性专一，催化效率高，能够实现对复杂样品中分析物的高灵敏检测。
3.生物酶在极端条件下容易变性失活，现有技术中多采用将酶固定在电极上从而提高酶在实际生物分析监测中信号传输效率和灵敏度。例如，cn108918625a公开了一种生物传感膜的制备方法、生物传感膜及监测装置。所述生物传感膜的制备方法通过对氧化还原酶进行电化学活化修饰后，使用化学交联剂交联处理，涂覆在电极表面，即形成生物传感膜。所述生物传感膜稳定耐用，可以多次检测，尤其适用于作为活体监测装置的生物传感膜。
4.然而，基于酶的电化学传感器仍然面临着不断的挑战：首先，常用的电化学传感器主要由二维平面电极组成，电极的二维平面和非开孔结构导致比表面积小、活性位点少，影响了酶的固定化和催化效率，同时难以实现分析物和干扰物的原位分离。相比于二维平面电极，三维多孔电极有利于电解液的浸润，增加了分析物与电极之间的接触面积，另外其更大的比表面积有利于改善固定化酶的稳定性。而膜作为一种三维多孔基质，除了具有上述优势外，还能够保护酶分子免受外界环境的影响。并且对流传质作用可以加快酶与底物的反应以提高灵敏度。此外，膜的多孔结构也有利于增强催化作用并放大检测信号。
5.由于导电膜和以普鲁士蓝为代表的电催化剂表面缺乏活性官能团，传统的酶固定化方法是将导电膜浸泡在高浓度的酶溶液中，干燥后再用戊二醛交联(“capillary-driven blood separation and in-situ electrochemical detection based on3d conductive gradient hollow fiber membrane”，wu h等，biosens.bioelectron.，2021，171:112722)。然而，这难以实现生物酶在膜上的稳定负载，造成酶高泄露或活性低，进而影响传感膜的灵敏度、稳定性、重现性和使用寿命。现有技术中公开了一种生物传感膜，所述生物传感膜基于梯度中空纤维膜独特的结构，通过温和可控的过滤包埋法将尺寸可调的载酶纳米颗粒组装在三维梯度导电膜孔限域空间内，从而获得较高的载酶量和检测灵敏度(“modular assembly of enzyme loaded nanoparticles in 3d hollow fiber electrode for electrochemical sensing”，wu h等，chem.eng.j.，2021，421:129721)。尽管物理包埋法改善了固定化酶的稳定性，但载酶纳米颗粒与导电膜之间缺乏更加牢固的化学相互作用，仍面临着酶脱落的问题。
6.因此，开发一种载酶量高、灵敏度高且稳定性好的生物传感膜，是本领域亟待解决的技术问题。
技术实现要素：
7.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种生物传感膜及其制备方法和用途。通过采用特定的固定层对基膜改性，实现了普鲁士蓝在膜表面的靶向均匀沉积，同时，所述固定层中含酚基化合物上的酚基可被氧化成醌基，通过共价键将酶固定到生物传感膜上，而丰富的醌基共价固定化酶增强了传感膜的稳定性和重现性，避免传统吸附、交联法所需要大量的酶；同时普鲁士蓝和酶在传感界面呈均匀分布，显著提升了所述生物传感膜的电子传递效率，从而具有更好的传感性能。
8.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供一种生物传感膜，所述生物传感膜包括依次设置的改性碳纳米管层、基膜、固定层以及固定于所述固定层上的普鲁士蓝和酶；所述固定层包括含酚基化合物和三氯化铁的组合。
10.本发明中，所述改性碳纳米管层，使得所述生物传感膜具有优异的导电性能；而所述固定层采用含酚基化合物和三氯化铁的组合，为后续普鲁士蓝和酶的稳定固定提供了条件，能够实现普鲁士蓝纳米颗粒在基膜表面靶向均匀沉积，避免其发生团聚，这不仅能够增加普鲁士蓝与分析物的接触面积，而且还能够降低了电子转移阻力；同时普鲁士蓝和酶在传感界面呈均匀分布且不重叠不团聚，显著提升了所述生物传感膜的电子传递效率，从而具有更好的传感性能。
11.作为本发明优选的技术方案，所述改性碳纳米管层为聚乙烯醇改性碳纳米管层。
12.优选地，所述改性碳纳米管层中聚乙烯醇与碳纳米管的质量比为1：(4.5～5.5)，例如可以为1：4.5、1：5、1：5.5等。
13.本发明中，采用聚乙烯醇和戊二醛在酸性条件下对碳纳米管进行改性，提高了碳纳米管在膜表面的稳定性，不会造成脱落；如果不对碳纳米管进行改性，会在后续改性过程中不断脱落，影响后续酶活性及灵敏度的测定。
14.优选地，所述基膜包括无机多孔支撑膜和/或高分子多孔支撑膜。
15.优选地，所述无机多孔支撑膜包括氧化铝陶瓷膜、氧化硅陶瓷膜或氧化钛陶瓷膜中的任意一种或至少两种的组合。
16.优选地，所述高分子多孔支撑膜的材料包括聚丙烯腈、尼龙、聚偏氟乙烯、聚醚砜或芳香聚酰胺中的任意一种或至少两种的组合。
17.优选地，所述含酚基化合物包括单宁酸和/或聚多巴胺。
18.优选地，所述固定层中还包括3-氨丙基三乙氧基硅烷和/或聚乙烯亚胺。
19.优选地，所述固定层包括单宁酸、3-氨丙基三乙氧基硅烷和三氯化铁的组合。
20.本发明中，所述单宁酸是一种具有良好亲水性的植物多酚，由于其富含邻苯二酚基团，使得单宁酸可通过多种相互作用黏附在基膜表面，同时，由于单宁酸与3-氨丙基三乙氧基硅烷可通过迈克尔加成反应或者席夫碱反应形成一种具有球状结构的涂层，从而进一步提高了单宁酸的黏附性；而通过三氯化铁与单宁酸的邻苯二酚基团和3-氨丙基三乙氧基硅烷的氨基发生配位作用，从而提高固定层的酸碱稳定性，并为后续普鲁士蓝的靶向均匀沉积提供了条件，同时，由于单宁酸上的酚基可被氧化形成醌基，可用于后续固定酶。
21.优选地，所述固定层中单宁酸、3-氨丙基三乙氧基硅烷和三氯化铁的质量比为(0.005～4.5)：(0.02～4.5)：1，例如可以为0.005：0.02：1、0.5：1：1、0.8：0.5：1、1：0.8：1、
2：1.5：1、3：1：1、4：2：1、0.8：0.6：1、0.83：0.83：1、0.67：0.33：1、0.88：0.55：1、4：4：1等，优选为(0.8～1)：(0.5～0.6)：1。
22.本发明中，所述单宁酸、3-氨丙基三乙氧基硅烷和三氯化铁在特定的比例内，所述生物传感膜的灵敏度及载酶量效果最好，单宁酸或3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量过高或过低都会造成生物传感膜的灵敏度和载酶量下降。
23.优选地，所述普鲁士蓝为铁氰化钾与固定层中的三氯化铁反应形成的普鲁士蓝纳米颗粒。
24.优选地，所述铁氰化钾与三氯化铁的质量比为(0.8～6.5)：1，例如可以为0.8：1、1：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、4：1、5：1、6：1等，进一步优选为(0.8～3)：1。
25.本发明中，所述铁氰化钾与三氯化铁的质量比偏低或偏高，所述生物传感膜的灵敏度下降。
26.优选地，所述酶为催化产生过氧化氢的酶。
27.优选地，所述酶包括葡萄糖氧化酶、乙醇氧化酶、半乳糖氧化酶、乳酸氧化酶、核苷氧化酶、甘油氧化酶、胆固醇氧化酶或超氧化物歧化酶中的任意一种或至少两种的组合。
28.优选地，所述酶包括葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶。
29.本发明中，所述酶可催化分析物生成过氧化氢，生成的过氧化氢可以在电催化剂普鲁士蓝的作用下进一步分解产生响应电流，从而实现分析物的定量检测。
30.第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的生物传感膜的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
31.(1)在基膜的两个表面分别设置改性碳纳米管层和固定层；所述固定层与铁氰化钾反应，得到固定普鲁士蓝的传感膜；
32.(2)将步骤(1)得到的传感膜与酶混合，反应，得到所述生物传感膜。
33.作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述改性碳纳米管层的设置方法包括：将碳纳米管分散液过滤沉积于基膜的一个表面上，得到碳纳米管层；然后加入聚乙烯醇反应液后进行反应，得到所述改性碳纳米管层。
34.本发明中，所述碳纳米管分散液稀释为浓度为0.1～1g/l的水溶液使用，所述浓度例如可以为0.2g/l、0.3g/l、0.4g/l、0.5g/l、0.6g/l、0.7g/l、0.8g/l、0.9g/l等。
35.优选地，所述过滤沉积的压力为0.5～1bar，例如可以为0.55bar、0.6bar、0.65bar、0.7bar、0.75bar、0.8bar、0.85bar、0.9bar、0.95bar等。
36.优选地，所述聚乙烯醇反应液中还包括戊二醛。
37.优选地，所述聚乙烯醇反应液的ph值为1～5，例如可以为1、2、3、4、5等。
38.本发明中，所述聚乙烯醇反应液中聚乙烯醇选用不同质量分数的聚乙烯醇，所述聚乙烯醇的质量分数为0.1～1％，例如可以为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％等。
39.本发明中，所述戊二醛为质量分数为0.1～1％的戊二醛，例如可以为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％等。
40.本发明中，所述聚乙烯醇反应液的ph值由盐酸提供，所述盐酸的质量分数为25～35％，例如可以为26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％等。
41.优选地，所述反应的温度为20～100℃，例如可以为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、
80℃、90℃等。
42.优选地，所述反应的时间为5～60min，例如可以为10min，15min，20min，25min，30min，35min，40min，45min，50min，55min等。
43.本发明中，在酸性环境下，采用聚乙烯醇和戊二醛对碳纳米管进行改性，所述碳纳米管上的羧基与聚乙烯上的羟基和戊二醛上的醛基反应，从而得到所述改性碳纳米管层。
44.优选地，步骤(1)所述固定层的设置方法包括：采用含酚基化合物反应液处理基膜远离改性碳纳米管层的一侧，反应，得到第一固定层；所述第一固定层与三氯化铁反应，得到所述固定层。
45.优选地，所述含酚基化合物反应液还包括3-氨丙基三乙氧基硅烷和/或聚乙烯亚胺。
46.优选地，所述得到第一固定层的反应时间为2～24h，例如可以为4h、6h、8h、10h、15h、18h、20h、22h等。
47.优选地，所述得到第一固定层的反应ph值为7.5～9.5，例如可以为7.5、8、8.5、9、9.5等。
48.优选地，所述得到第一固定层的反应温度为25～30℃，例如可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等。
49.优选地，所述第一固定层与三氯化铁反应的时间为1～10h，例如可以为2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h等。
50.优选地，所述第一固定层与三氯化铁反应的温度为25～30℃，例如可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等。
51.本发明中，所述含酚基化合物溶解于tris-hcl缓冲溶液中，配制成浓度为0.5～10g/l的含酚基化合物tris-hcl缓冲溶液使用；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷溶解于乙醇中，配制成浓度为2～10g/l的3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液使用；所述聚乙烯亚胺溶解于水中，配制成浓度为2～10g/l的聚乙烯亚胺水溶液使用；所述三氯化铁溶解于水中，配制成浓度为2～10g/l的三氯化铁水溶液使用。
52.优选地，所述铁氰化钾的浓度为5～40mm，例如可以为5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm等，进一步优选为5～20mm。
53.本发明中，所述铁氰化钾的浓度过高或过低都会导致所述生物传感膜的灵敏度下降。
54.优选地，步骤(1)所述反应的时间为1～10h，例如可以为2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h等。
55.优选地，步骤(1)所述反应的温度为20～60℃，例如可以为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃等。
56.优选地，步骤(1)所述反应的ph值为1～3，例如可以为1.2,、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8等。
57.优选地，步骤(2)所述反应的时间为2～60h，例如可以为4h、8h、12h、20h、25h、30h、35h、40h、45h、50h、55h等。
58.优选地，步骤(2)所述反应的温度为4～30℃，例如5℃、10℃、15℃、20℃、25℃等。
59.优选地，步骤(2)所述反应的ph值为3～6，例如可以为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5等。
60.作为本发明优选的技术方案，所述制备方法包括以下步骤：
61.(1)将碳纳米管分散液在压力为0.5～1bar下过滤沉积于基膜的一个表面上，得到碳纳米管层；然后加入ph值为1～5的聚乙烯醇和戊二醛反应液，在温度为20～100℃的条件下反应5～60min，得到所述改性碳纳米管层；随后，采用含酚基化合物反应液处理基膜远离改性碳纳米管层的一侧，在ph值为7.5～9.5、25～30℃的条件下反应2～24h，得到第一固定层后；加入三氯化铁溶液，所述第一固定层与三氯化铁溶液在20～30℃的条件下反应1～10h，得到所述固定层；所述固定层与铁氰化钾在ph值为1～3、20～60℃的条件下反应1～10h，得到固定有普鲁士蓝的传感膜；
62.(2)将步骤(1)得到的传感膜与酶混合，在ph值为3～6、温度为4～30℃的条件下反应2～60h，得到所述生物传感膜。
63.本发明中，所述制备方法需要采用特定顺序的步骤来实现。本发明中如果采用三氯化铁和铁氰化钾的混合溶液处理所述基膜，虽然可以提供酶固定化位点，但三氯化铁和铁氰化钾在溶液中直接反应形成普鲁士蓝，并且合成的普鲁士蓝在反应溶液中大量团聚，导致用于酶固定化的醌基位点被掩盖，进而导致对葡萄糖的响应能力较低。
64.第三方面，本发明提供一种生物传感材料，所述生物传感材料包括如第一方面所述的生物传感膜。
65.本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
66.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
67.本发明提供的生物传感膜，通过使用改性碳纳米管层，具有良好的导电性能，通过选用特定的固定层，避免了普鲁士蓝的团聚，同时可以稳定地固定化酶并优化普鲁士蓝和酶的空间分布，提升了传感性能；作为本发明优选的技术方案，所述生物传感膜的灵敏度＞8，载酶量≥365μg，能够实现对样品中分析物的高灵敏检测。
具体实施方式
68.为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
69.以下实施例和对比例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
70.实施例1
71.本实施例提供一种生物传感膜，所述生物传感膜包括依次设置的改性碳纳米管层、基膜(尼龙膜，孔径0.22μm)、固定层以及固定于所述固定层上的普鲁士蓝和葡萄糖氧化酶；所述固定层包括质量比为0.889：0.555：1的单宁酸、3-氨丙基三乙氧基硅烷和三氯化铁。
72.本实施例提供一种所述生物传感膜的制备方法，具体步骤如下：
73.(1)将基膜置于过滤器中，在0.65bar的压力下过滤沉积25ml，1g/l的碳纳米管分散液，然后加入1ml聚乙烯醇(质量分数为0.5％)、0.5ml戊二醛(质量分数为0.5％)和0.5ml
盐酸(质量分数为31.5％)的混合溶液，在60℃下反应5min，得到设置有改性碳纳米管层的基膜；
74.(2)将单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷分别溶解于10mm的tris-hcl缓冲液(ph为8.5)和乙醇中配制得到浓度为2g/l的单宁酸tris-hcl缓冲溶液和浓度为10g/l的3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液，然后将单宁酸tris-hcl缓冲液与3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液按体积比为8：1混合，得到混合溶液；采用所述混合溶液处理步骤(1)所述基膜远离改性碳纳米管层的一侧，在室温，转速为150rpm下反应18h，得到第一固定层；向其中加入浓度为2g/l的三氯化铁水溶液与所述第一固定层在转速为150rpm、室温下反应1h，用去离子水在150rpm下洗涤1h，得到两个表面分别设置改性碳纳米管层和固定层的基膜；
75.(3)将步骤(2)得到的基膜与浓度为7.4mm，20ml的酸性铁氰化钾水溶液(ph为1.5)混合，所述固定层与铁氰化钾在150rpm、35℃下反应1h，得到固定有普鲁士蓝的传感膜；随后，加入浓度为0.25g/l、20ml的葡萄糖氧化酶醋酸缓冲溶液(ph＝5.0 10mm醋酸缓冲溶液)，所述固定层与葡萄糖氧化酶在4℃下反应48h，用去离子水冲洗1h，得到所述生物传感膜。
76.实施例2
77.本实施例提供一种生物传感膜，其与实施例1的区别仅在于所述生物传感膜的制备方法中步骤(3)中所述酸性铁氰化钾水溶液的浓度为5mm，其它原料、步骤及参数均与实施例1相同。
78.实施例3
79.本实施例提供一种生物传感膜，其与实施例1的区别仅在于所述生物传感膜的制备方法中步骤(3)中所述酸性铁氰化钾水溶液的浓度为20mm，其它原料、步骤及参数均与实施例1相同。
80.实施例4
81.本实施例提供一种生物传感膜，其与实施例1的区别仅在于所述生物传感膜中葡萄糖氧化酶用等质量的乳酸氧化酶替换，其它组分、用量及结构均与实施例1相同。
82.本实施例提供一种所述生物传感膜的制备方法，具体步骤与实施例1相同。
83.实施例5
84.本实施例提供一种生物传感膜，其与实施例1的区别仅在于所述生物传感膜的制备方法中步骤(2)中将3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液用等浓度、等体积的聚乙烯亚胺水溶液替换，其它原料、步骤及参数均与实施例1相同。
85.实施例6
86.本实施例提供一种生物传感膜，其与实施例1的区别仅在于所述生物传感膜的制备方法中步骤(2)所述单宁酸tris-hcl缓冲溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液的体积比为5：1，其它原料、步骤及参数均与实施例1相同。
87.实施例7
88.本实施例提供一种生物传感膜，其与实施例1的区别仅在于所述生物传感膜的制备方法中步骤(2)所述单宁酸tris-hcl缓冲溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液的体积比为2：1，其它原料、步骤及参数均与实施例1相同。
89.实施例8
90.本实施例提供一种生物传感膜，其与实施例1的区别仅在于将所述固定层中将单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷替换为等质量的聚多巴胺，其它组分、用量及结构均与实施例1相同。
91.本实施例提供一种所述生物传感膜的制备方法，具体步骤与实施例1相同。
92.实施例9
93.本实施例提供一种生物传感膜，其与实施例1的区别仅在于所述生物传感膜的制备方法中步骤(2)中用单宁酸tris-hcl缓冲溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液处理基膜后，加入等质量的三氯化铁和等质量的酸性铁氰化钾的混合溶液处理基膜，其它原料、步骤及参数均与实施例1相同。
94.对比例1
95.本对比例提供一种生物传感膜，其与实施例1的区别仅在于所述生物传感膜的制备方法中步骤(2)没有用单宁酸tris-hcl缓冲溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液处理基膜，其它原料、步骤及参数均与实施例1相同。
96.对比例2
97.本对比例提供一种生物传感膜，其与实施例1的区别仅在于所述生物传感膜的制备方法中步骤(2)用单宁酸tris-hcl缓冲溶液与3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液处理基膜后，先加入等质量的酸性铁氰化钾处理基膜，随后加入等质量的三氯化铁溶液处理基膜，其它原料、步骤及参数均与实施例1相同。
98.对比例3
99.本对比例提供一种生物传感膜，其与实施例1的区别仅在于所述生物传感膜的制备方法中步骤(3)没有用酸性铁氰化钾水溶液处理基膜，其它原料、步骤及参数均与实施例1相同，即最终得到的生物传感膜不含有普鲁士蓝。
100.对比例4
101.本对比例提供一种生物传感膜，其与实施例1的区别仅在于所述生物传感膜的制备方法中步骤(3)没有用葡萄糖氧化酶醋酸缓冲溶液处理基膜，其它原料、步骤及参数均与实施例1相同，即最终得到的生物传感膜不含酶。
102.对比例5
103.本对比例提供一种生物传感膜，其与实施例1的区别仅在于所述生物传感膜的制备方法中步骤(1)没有在基膜上过滤沉积碳纳米管分散液，并且没有加入聚乙烯醇、戊二醛及盐酸的混合溶液进行反应，其它步骤及参数均与实施例1相同，即最终得到不含有改性碳纳米管层的生物传感膜。
104.性能测试
105.(1)酶的活性：以葡萄糖氧化酶为例，将苯酚、4-氨基安替比林、辣根过氧化物酶和葡萄糖溶解在醋酸缓冲液(10mm，ph＝5.0)中以制备底物溶液，其中它们的浓度分别为40mm、4mm、40mm、100mm；然后在磁力搅拌器的作用下将葡萄糖氧化酶加入到20ml上述底物溶液中，记录溶液在505nm处的吸光值的变化。一个单位的催化活性(u)定义为在测定条件(25℃，ph为5.0)下每分钟消耗1μmol h2o2的酶量；
106.乳酸氧化酶：将苯酚、4-氨基安替比林、辣根过氧化物酶和乳酸溶解在醋酸缓冲液(10mm，ph＝5.0)中以制备底物溶液，其中它们的浓度分别为40mm、4mm、40mm、100mm；然后在
磁力搅拌器的作用下将乳酸氧化酶加入到20ml上述底物溶液中，记录溶液在505nm处的吸光值的变化。一个单位的催化活性(u)定义为在测定条件(25℃，ph为5.0)下每分钟消耗1μmol h2o2的酶量；
107.(2)载酶量：按照方法(1)计算原始酶液、剩余酶液以及洗脱酶液的酶活性，根据活性平衡计算生物传感膜表面固定的酶的量(测量前将所有酶溶液稀释至类似浓度，以消除酶浓度对活性测定的影响)；
108.载酶量(μg)＝(as-ar-aw)/as*ms；
109.其中，as、ar和aw分别是原始酶液、剩余酶液和洗脱酶液的催化活性(u)，ms是原酶液中的酶量；
110.(3)传感性能：将分析物如葡萄糖或乳酸溶解在磷酸缓冲溶液(50mm，ph 6.5，含0.1m kcl)中，采用电流分析法每隔100～300s向三电极反应体系中加入分析物，工作电压设置为-0.5v。最终得到响应电流与分析物浓度的关系，斜率即为所述生物传感膜的灵敏度。
111.具体测试结果如表1所示：
112.表1
113.[0114][0115]
由上表可知，本发明提供的生物传感膜，通过选用特定的固定层，有助于普鲁士蓝的靶向均匀沉积以及酶的高效稳定固定，同时优化了两者的空间分布，更有利于电子传递。通过改性碳纳米管层、基膜、固定层以及固定在固定层上的普鲁士蓝和酶的协同作用，所述生物传感膜能够实现样品中分析物的高灵敏检测。
[0116]
由实施例1与实施例2和3对比可知，不同浓度的铁氰化钾会影响形成的普鲁士蓝的催化传感效果，本发明优选的铁氰化钾浓度为7.4mm，此时，本发明的生物传感膜的载酶量和灵敏度最好。由实施例1与实施例4和5比较可知，选用乳酸氧化酶或者采用单宁酸与聚乙烯亚胺的组合，所述生物传感膜也有优异的灵敏度和载酶量；由实施例1与实施例6和7比较可知，单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量比会影响普鲁士蓝的分布以及后续酶固定化的醌基位点数量，本发明优选单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量比为1.6:1，此时，本发明的生物传感膜的载酶量最高，灵敏度最好。由实施例1与实施例8～9比较可知，所述固定层中没有采用特定的组合或者制备方法中没有按照特定的步骤进行时，所述生物传感膜的性能下降。
[0117]
通过实施例1与对比例1比较可知，所述生物传感膜几乎对葡萄糖没有响应，这表明缺乏用于酶固定化的位点。通过实施例1与对比例2比较可知，先加入酸性铁氰化钾溶液再加入三氯化铁溶液，所述生物传感膜的灵敏度和载酶量为0，这是因为先加入酸性铁氰化钾溶液导致单宁酸和3-氨丙基三乙氧基硅烷发生质子化分解脱落，进而影响后续酶固定化和传感性能。由实施例1与对比例3～5比较可知，当所述生物传感膜中缺少某一组分时，所述生物传感膜灵敏度下降。
[0118]
综上所述，本发明所述的生物传感膜，通过改性碳纳米管层、基膜、固定层以及固定在所述基膜上的普鲁士蓝和酶的协同作用，并且通过特定步骤的制备方法，所述生物传感膜灵敏度高，载酶量高，性能优异。
[0119]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。