糖基转移酶osugt91c1突变体及其应用
技术领域
1.本发明属于酶学领域，具体涉及一种糖基转移酶osugt91c1突变体及其应用。


背景技术：

2.近年来高热量糖的危害逐步得到重视，但由于甜味可刺激产生内源性阿片、多巴胺等奖励性神经递质，使人难于戒除对甜味的依赖。几种量产的人造甜味剂虽可满足热量低的需求，但口感、安全性和心理接受度仍存在争议，难以有效替代传统高热量甜味剂。原产于南美的甜叶菊在当地作为天然甜味来源已有超过百年的历史。2006年世界卫生组织(who)和联合国粮农组织(fao)联合食品添加剂专用委员会(jecfa)通过了甜菊糖健康无害的安全评价。2008年美国fda正式批准允许甜菊糖在食品中使用。2011年甜菊糖取得了欧洲的食品安全局安全性检验证书。随着消费者对低糖、低热量的食品和饮料的需求持续增长，甜菊糖已成为全球使用量增长最快的天然甜味剂之一。
3.甜菊糖是多种甜菊糖苷的总称。所有甜菊糖苷具有相似的化学结构模式，即在通用的甜菊醇(steviol，cas 471-80-7)核心骨架c13-羟基(为了简化，在附图中也用r1代表)和(或)c19-羧基(为了简化，在附图中也用r2代表)存在不同的葡萄糖基修饰(图1中a)。根据c13-羟基和c19-羧基的糖基组成和糖苷键的组合情况，可对甜菊糖苷分子进行命名，但目前市场上的甜菊糖产品以甜菊苷(stevioside，cas 57817-89-7占比57％，用st表示)和甜菊糖苷a(rebaudioside a，cas 58543-16-1，含量可达甜菊糖苷的32％，用reb a表示)为代表，二者存在口感不佳的劣势，影响了甜菊糖苷的市场接受度。研究发现甜菊糖苷d(rebaudioside d，cas 63279-13-0，reb d代表)和m(rebaudioside m，cas 1220616-44-3，reb m代表)甜度是蔗糖的200-300倍，口感非常接近于甜味标准品蔗糖，被认为是甜菊糖苷品质最好的组分，也是甜菊糖苷生产商研发的重点。百事可乐和可口可乐都获得了在饮料中使用甜菊糖苷d和m的专利。
4.然而，甜菊糖苷d和m在天然甜叶菊叶片中的含量低于1％，难于直接从天然种植的甜叶菊提取。由于含量低，从甜叶菊提取过程繁琐，成本高，限制了口感最好的甜菊糖苷d和m的市场化应用。研究表明甜叶菊自身缺少在甜菊糖苷的c19-羧基方向添加2号葡萄糖基的催化能力，不能有效合成reb d和reb m，导致了二者天然含量低的现象；同时reb d和reb m在c19-羧基方向的2号葡萄糖基，使二者同其他甜菊糖苷相比，口感得以显著提升的原因。因此，利用异源酶促转化的方法弥补甜叶菊催化在甜菊糖苷的c19-羧基方向添加2号葡萄糖基的能力不足，是规模化制备甜菊糖苷d和m的解决手段。一种水稻来源的糖基转移酶osugt91c1(也可称为eugt11)，可催化在甜菊糖苷的c13-羟基和c19-羧基方向添加2号葡萄糖基(2号葡萄糖基是与1号葡萄糖基形成β(1-2)糖苷键的葡萄糖基，1号葡萄糖基特指直接与c13-羟基或c19-羧基形成β-糖苷键的葡萄糖基)(图1中b，c，d)。利用糖基转移酶osugt91c1在甜菊糖苷的c13-羟基和c19-羧基两个方向都可添加2号葡萄糖基的能力，弥补甜叶菊自身在甜菊糖苷的c19-羧基方向添加2号葡萄糖基能力的不足，是能否规模化生产甜菊糖苷d和m的决定因素。通过包含糖基转移酶osugt91c1的一系列酶促反应，在生物体内
(不一定是甜叶菊)或生物体外利用前体物质进行甜菊糖苷的全合成转化，或通过酶促反应对甜叶菊天然提取物，特别是在自然含量较为丰富的甜菊苷(st)、甜菊糖苷a(reb a)或其他可利用的甜菊糖苷分子的特定位置添加葡萄糖基，转化生成甜菊糖苷d和m(reb d和reb m)。
5.由于在甜菊糖苷的c19-羧基方向添加2号葡萄糖基是生成reb d和reb m的关键，发明人希望能进一步提高糖基转移酶osugt91c1在甜菊糖苷c19-羧基方向催化添加2号葡萄糖基(与1号葡萄糖基形成β(1-2)糖苷键)的能力，用于更加高效地转化生成甜菊糖苷d和m。同时，发明人发现糖基转移酶osugt91c1在催化甜菊糖苷d、m酶促转化过程中的特异性不好，除了添加2号葡萄糖基外(这是酶促转化生成甜菊糖苷d、m所需的反应，称为正常反应)，还存在明显的副反应，即在c13-羟基方向或c19-羧基方向添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)，二者与1号葡萄糖基形成β(1-6)糖苷键(或β(1-4)糖苷键)(本专利提及的副反应均指添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)的反应)(图1中b，c，d)。副反应将浪费酶催化资源和底物，形成明显的副产物，既影响了甜菊糖苷d和m的生成效率，还带来杂质，给获得高品质甜菊糖苷d、m纯品带来很大困难。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题为：如何提高糖基转移酶osugt91c1在催化甜菊糖苷的c13-羟基或/和c19-羧基方向添加2号葡萄糖基的能力，另一方面，在提高催化能力的前提下消除副反应。
7.基于发明人独立发现的糖基转移酶osugt91c1三维空间结构，理性优化糖基转移酶osugt91c1原有氨基酸序列，发明人将第208位的苯丙氨酸改为甲硫氨酸(phe208met)，得到新酶a。通过大肠杆菌蛋白表达系统，纯化制备新酶a，实施例验证新酶a可增强糖基转移酶osugt91c1在c13-羟基，特别是在c19-羧基位添加2号葡萄糖基的能力。
8.经前期研究发现，通过改变糖基转移酶osugt91c1第379位的苯丙氨酸为丙氨酸(phe379ala)，可完全消除副反应。发明人综合新酶a(phe208met)催化能力得到增强的特点，组合phe208met和phe379ala两个位点的氨基酸改变，成功构建了一个既消除副反应又能增强目标催化能力(添加2号葡萄糖基)的新酶b(phe208met/phe379ala)。验证了新酶b(phe208met/phe379ala)既消除了添加6号葡萄糖基(形成β(1-6)糖苷键)的副反应，又对添加2号葡萄糖基的正常反应有约3-7倍的增强作用，可更高效和更加专一地参与甜菊糖苷的酶促转化。
9.进一步地研究发现，在上述突变的基础上，删除或改变糖基转移酶osugt91c1前端1-14个氨基酸(mdsgysssyaaaag)均不影响突变后的酶性质。说明前端的14个氨基酸具有冗余性，可以完全去除或改变。
10.本发明的技术方案为：糖基转移酶osugt91c1突变体，其氨基酸序列为以下a、b、c、d中的任一种：
11.a、seq id no.1所示；
12.b、seq id no.2所示；
13.c、seq id no.1所示氨基酸序列的基础上任意删除或改变第1-14位氨基酸；
14.d、seq id no.2所示氨基酸序列的基础上任意删除或改变第1-14位氨基酸。
15.seq id no.1所示氨基酸序列是在糖基转移酶osugt91c1氨基酸序列的基础上将第208位氨基酸由phe突变为met；seq id no.2所示氨基酸序列是在糖基转移酶osugt91c1氨基酸序列的基础上将第208位氨基酸由phe突变为met，且第379位氨基酸由phe突变为ala。
16.一种表达基因，编码上述所述的糖基转移酶osugt91c1突变体。
17.一种表达载体，含有上述所述表达基因。
18.携带上述所述表达载体的重组菌或细胞。
19.上述所述的糖基转移酶osugt91c1突变体在甜菊糖苷d或m及其他甜菊糖苷分子的酶促合成或转化过程的用途。
20.进一步地，所述糖基转移酶osugt91c1突变体在甜菊糖苷d或m及其他甜菊糖苷分子的酶促合成或转化过程是指在甜菊糖苷的c13-羟基或/和c19-羧基方向添加2号葡萄糖基，所述2号葡萄糖基是与1号葡萄糖基形成β(1-2)糖苷键的葡萄糖基，1号葡萄糖基特指直接与c13-羟基或c19-羧基形成β-糖苷键的葡萄糖基。
21.催化在c13-羟基或c-19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应的底物不唯一，包括但不限于，rubu(rubusoside，cas 64849-39-4)、s13g(steviol-13-o-monoglucoside，cas 60129-60-4)及reb a(rebaudioside a,cas 58543-16-1)等甜菊糖苷底物，只要在c13-羟基或c-19羧基方向存在1号葡萄糖基，但不存在3号葡萄糖基，就可发生在c13-羟基或c-19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应。
22.除了可在大肠杆菌中表达、纯化、制备天然状态osugt91c1或本发明的两个新酶，还可在其他生物系统、非生物系统、细胞、非细胞(cell-free)等其他表达体系中进行表达和制备；将这些消除了副反应的新酶，通过转基因或其他基因导入手段，引入生物体、非生物体、细胞、非细胞(cell-free)进行甜菊糖苷的酶促转化，以及在酶、酶固定化等体外体系，用于在甜菊糖苷添加2号葡萄糖基的酶促转化，包括制备但不限于甜菊糖苷d和m的酶促转化过程，达到消除副反应的目的。
23.本专利的副反应定义为，在甜菊醇或甜菊糖苷的c13-羟基，c19-羧基两个方向添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)，与1号葡萄糖基形成β(1-6)糖苷键(或β(1-4)糖苷键)的副反应；本专利的正常反应的定义是在甜菊醇或甜菊糖苷的c13-羟基，c19-羧基两个方向添加2号葡萄糖基，与1号葡萄糖基形成β(1-2)糖苷键的反应。
24.利用了液相色谱-质谱联用验证了新酶a(phe208met)增强了催化添加2号葡萄糖基，特别是在c19-羧基位添加2号葡萄糖基的能力。新酶b(phe208met/phe379ala)在增强添加2号葡萄糖基能力的同时，无副反应的出现。通过液相色谱-质谱联用、荧光转化法等方法测定了两个新酶催化反应的米氏动力学参数，验证了新酶b(phe208met/phe379ala)既消除了添加6号葡萄糖基(形成β(1-6)糖苷键)的副反应，又对添加2号葡萄糖基的正常反应有约3-7倍的增强作用，可更高效和更加专一地参与甜菊糖苷的酶促转化。新酶b催化酶促转化，得到的添加了2号葡萄糖基的正常产物不含副产物，可用于合成甜菊糖苷d和m。
25.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
26.本发明解决了水稻来源的糖基转移酶osugt91c1在甜菊糖苷转化中的酶学缺陷，同时显著提升了对目标催化反应的催化能力。新酶b(phe208met/phe379ala)可更为高效和专一地完成对甜菊糖苷添加2号葡萄糖基的正常酶促反应，用于转化获得高品质、高纯度的
健康甜味剂甜菊糖苷d和m。
附图说明
27.图1与本专利相关的部分甜菊糖苷结构，结构的简化表示及osugt91c1酶促转化生成甜菊糖苷d和m过程中正常反应和副反应的示意图
28.a部分甜菊糖苷的结构，包括甜菊醇、甜菊糖苷d和m的结构及结构的简化形式。甜菊醇用完整的化学结构表示，甜菊糖苷d和m用完整的化学结构和简化图两种方法表示，括号内为二者相比于蔗糖的甜度倍数。简化图中c13-羟基(用r1简化表示)，c19-羧基(用r2简化表示)。葡萄糖基用六边形表示，每个葡萄糖的1-羟基用黑点标注，每个葡萄糖中间的数字代表是几号葡萄糖基，同时也表示该葡萄糖基与1号葡萄糖基形成的糖苷键的类型，如2代表β(1-2)糖苷键，3代表β(1-3)糖苷键，4代表β(1-4)糖苷键，6代表β(1-6)糖苷键。
29.b osugt91c1在甜菊糖苷底物c13-羟基(用r1简化表示)或(和)c19-羧基(用r2简化表示)两端催化添加2号葡萄糖基正常反应及添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)副反应的示意图。
30.c osugt91c1在甜菊糖苷底物c13-羟基(用r1简化表示)催化添加2号葡萄糖基正常反应及添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)副反应的示意图。
31.d osugt91c1在甜菊糖苷底物c19-羧基(用r2简化表示)催化添加2号葡萄糖基正常反应及添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)副反应的示意图。
32.图2新酶a(phe208met)、天然状态osugt91c1、新酶b(phe208met/phe379ala)sds-page分析
33.a新酶a(phe208met)的sds-page分析。m,marker；1，诱导后样品；2，菌体裂解液；3，菌体裂解液上清；4，菌体裂解液沉淀；5，ni柱流穿样品；6-12，ni柱洗脱蛋白样品。
34.b天然状态osugt91c1和新酶b(phe208met/phe379ala)的sds-page分析。m,marker；wt，天然状态osugt91c1；2，q柱流穿样品；3-7，q柱洗脱蛋白样品。两个图右侧箭头表示目的蛋白条带的位置。
35.图3天然状态osugt91c1和新酶a(phe208met)催化在底物rubu的c13-羟基(r1)和c19-羧基(r2)两端添加2号葡萄糖基，形成β(1-2)糖苷键正常酶促反应的对比
36.a,b天然状态osugt91c1、新酶a(phe208met)与rubu反应的液相分析。液相图从上至下的反应条件依次为：加0.25mg/ml酶反应0小时作为对照，0.05mg/ml酶反应2小时和18小时，0.25mg/ml酶反应2小时和18小时。显示天然状态的osugt91c1在rubu的c13-羟基(r1)和c19-羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基的产物随时间和酶量的增加而增多，新酶a(phe208met)同样可在底物rubu的c13-羟基、c19-羧基两个方向添加2号葡萄糖基，而且可催化得到更多的在c19-羧基方向添加2号葡萄糖基的产物，具有增强的在c19-羧基方向的目标催化能力，最终得到在c13-羟基和c19-羧基两个方向都加有2号葡萄糖基的产物reb e也多于天然状态的osugt91c1；c,d天然状态osugt91c1和新酶a(phe208met)催化底物rubu的c13-羟基(r1)和c19-羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基，生成reb e的反应示意图，新酶a(phe208met)显示具有在c19-羧基方向增强的目标催化能力。
37.图4天然状态osugt91c1和新酶a(phe208met)催化在底物reb a的c19-羧基(r2)端添加2号葡萄糖基，形成β(1-2)糖苷键正常酶促反应的对比
38.a,b天然状态osugt91c1、新酶a(phe208met)与reb a反应的液相分析。液相图从上至下的反应条件依次为：加0.25mg/ml酶反应0小时作为对照，0.05mg/ml酶反应2小时和18小时，0.25mg/ml酶反应2小时和18小时。显示天然状态的osugt91c1在reb a的c19-羧基(r2)端添加2号葡萄糖基，生成产物reb d随时间和酶量的增加而增多，而新酶a(phe208met)可明显率先将底物reb a完全消耗并生成目标产物reb d，具有增强的在c19-羧基方向的目标催化能力；c,d天然状态osugt91c1和新酶a(phe208met)催化底物reb a的c19-羧基(r2)端添加2号葡萄糖基，生成reb d的反应示意图，新酶a(phe208met)该反应得到增强。
39.图5天然状态osugt91c1和新酶b(phe208met/phe379ala)在底物stb的c13-羟基(r1)端添加6号(或4号)葡萄糖基副反应的情况对比
40.天然状态的osugt91c1(a)、新酶b(phe208met/phe379ala)(b)与底物stb反应的液相分析。液相图从上至下的反应条件依次为：加0.75mg/ml酶反应0小时作为对照，0.15mg/ml酶反应2小时和18小时，0.75mg/ml酶反应2小时和18小时。显示天然状态的osugt91c1副反应产物随时间和酶量的增加而增多，而新酶b(phe208met/phe379ala)无副反应产物的生成。a液相图下方为osugt91c1催化stb反应生成副产物的示意图，b液相图下方为新酶b催化stb反应示意图，无副产物生成，无副反应的发生。
41.图6天然状态osugt91c1和新酶b(phe208met/phe379ala)催化在底物s13g的c13-羟基(r1)端添加2号葡萄糖基，形成β(1-2)糖苷键正常酶促反应，以及随后发生添加6号(或4号)葡萄糖基副反应的情况对比
42.天然状态的osugt91c1(a)、新酶b(phe208met/phe379ala)(b)与底物s13g反应的液相分析。液相图从上至下的反应条件依次为：加0.75mg/ml酶反应0小时作为对照，0.15mg/ml酶反应2小时和18小时，0.75mg/ml酶反应2小时和18小时。显示天然状态的osugt91c1先催化在底物s13g的c13-羟基(r1)端添加2号葡萄糖基的正常酶促反应生成stb，然后在stb发生副反应，添加6号(或4号)葡萄糖基，生成副产物；与之相反，新酶b(phe208met/phe379ala)只催化在底物s13g的c13-羟基(r1)端添加2号葡萄糖基的正常反应生成stb，不催化副反应，无副产物生成；a液相图下方为天然状态osugt91c1催化s13g先催化正常反应生成stb，然后催化副反应产生副产物的示意图，b液相图下方为新酶b(phe208met/phe379ala)只催化s13g正常反应生成stb，不生成副产物的示意图。
43.图7天然状态osugt91c1和新酶b(phe208met/phe379ala)催化在底物rubu的c13-羟基(r1)端和c19-羧基(r2)端添加2号葡萄糖基，形成β(1-2)糖苷键正常酶促反应的对比
44.a,b天然状态osugt91c1、新酶b(phe208met/phe379ala)与rubu反应的液相分析。液相图从上至下的反应条件依次为：加0.25mg/ml酶反应0小时作为对照，0.05mg/ml酶反应2小时和18小时，0.25mg/ml酶反应2小时和18小时。显示天然状态的osugt91c1在rubu的c13-羟基(r1)和c19-羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基的产物随时间和酶量的增加而增多，而新酶b(phe208met/phe379ala)可催化得到更多的在c19-羧基方向添加2号葡萄糖基的产物，具有增强的在c19-羧基方向的目标催化能力，而且最终得到在c13-羟基和c19-羧基两个方向都加有2号葡萄糖基的产物reb e也多于天然状态的osugt91c1；c,d天然状态osugt91c1和新酶b(phe208met/phe379ala)催化底物rubu的c13-羟基(r1)和c19-羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基，生成reb e的反应示意图，新酶b(phe208met/phe379ala)显示具
有更高的目标催化能力。
45.图8天然状态osugt91c1和新酶b(phe208met/phe379ala)催化在底物reb a的c19-羧基(r2)端添加2号葡萄糖基，形成β(1-2)糖苷键，生成reb d的正常酶促反应的对比
46.a,b天然状态osugt91c1、新酶b(phe208met/phe379ala)与reb a反应的液相分析。液相图从上至下的反应条件依次为：加0.25mg/ml酶反应0小时作为对照，0.05mg/ml酶反应2小时和18小时，0.25mg/ml酶反应2小时和18小时。显示天然状态的osugt91c1在reb a的c19-羧基(r2)端添加2号葡萄糖基，生成产物reb d随时间和酶量的增加而增多，而新酶b(phe208met/phe379ala)可明显率先将底物反应完全，具有增强的在c19-羧基方向的目标催化能力；c,d天然状态osugt91c1和新酶b(phe208met/phe379ala)催化底物reb a的c19-羧基(r2)端添加2号葡萄糖基，生成reb d的反应示意图，其中新酶b(phe208met/phe379ala)的该反应得到增强。
47.图9利用新酶b(phe208met/phe379ala)催化获得的甜菊糖苷底物reb e(不产生副产物)，通过糖基转移酶ugt76g1在c13-羟基或(和)c-19羧基方向继续添加3号葡萄糖基，获得甜菊糖苷d和m
48.a,以新酶b(phe208met/phe379ala)催化获得的甜菊糖苷底物reb e(不产生副产物)的基础上，再利用糖基转移酶ugt76g1转化形成reb d和reb m的反应示意图。方框显示两个新酶不发生副反应，只在c13-羟基或(和)c-19羧基方向正常添加2号葡萄糖基，形成甜菊糖苷e(reb e)；然后糖基转移酶ugt76g1接力，继续催化在c13-羟基或(和)c-19羧基方向添加3号葡萄糖基，形成甜菊糖苷d和m(reb d和reb m)的过程。b,利用新酶b(phe208met/phe379ala)催化获得的甜菊糖苷底物reb e(不产生副产物)，进一步利用糖基转移酶ugt76g1催化从reb e到reb d和reb m的转化过程。在液相图从上至下的反应条件依次为：加0.03mg/ml的糖基转移酶ugt76g1反应0小时作为对照，0.03mg/ml糖基转移酶ugt76g1反应2小时和18小时，0.15mg/ml糖基转移酶ugt76g1反应2小时和18小时。
49.图10新酶b(phe208met/phe379ala)去除第1-14位氨基酸后的截短体的sds-page分析；
50.新酶b(phe208met/phe379ala)和新酶b去除第1-14位氨基酸后的截短体的sds-page比较分析。m,marker；1，新酶b；2，新酶b的截短体从q柱流穿的样品；3-8，新酶b的截短体从q柱洗脱的样品
51.图11天然状态osugt91c1、新酶b去除第1-14位氨基酸后的截短体催化在底物rubu的c13-羟基(r1)和(或)c19-羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基，形成β(1-2)糖苷键正常酶促反应的对比；
52.天然状态的osugt91c1(a)、新酶b去除第1-14位氨基酸后的截短体(b)与rubu反应的液相分析比较。液相图从上至下的反应条件依次为：加0.25mg/ml酶反应0小时作为对照，0.05mg/ml酶反应2小时和18小时，0.25mg/ml酶反应2小时和18小时。显示天然状态的osugt91c1在rubu的c13-羟基(r1)和c19-羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基的产物随时间和酶量的增加而增多，而新酶b截短体具有同样的酶促催化反应，且同新酶b一样，具有比天然状态osugt91c1更好的催化能力。c,天然状态osugt91c1和新酶b截短体可进行同样催化在底物rubu的c13-羟基(r1)和c19-羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基的正常目标反应，生成reb e的反应示意图，进一步验证第1-14位氨基酸的冗余性，可以完全去除或改变。
具体实施方式
53.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
54.一、天然状态osugt91c1蛋白表达载体的构建
55.(1)获取osugt91c1的氨基酸序列(ncbi reference sequence:xp_015629141.1)，根据蛋白表达系统的要求对osugt91c1编码密码子进行优化和合成。发明人根据大肠杆菌的表达体系优化后的编码密码子如下。由于密码子的兼并性，密码子优化的选择可有多种。
56.为了防止通过替换osugt91c1的非重要氨基酸序列，达到规避本专利权利要求的目的，本专利认为只要翻译后的蛋白氨基酸序列和osugt91c1的氨基酸序列相同度在50％及以上，则认为属于osugt91c1。
57.不管是在osugt91c1的氨基酸序列还是空间结构上，通过改变同208和379位氨基酸等效的位点或其他位点(由于氨基酸冗余性的原因，通过去除第1-14位的一个或任意个氨基酸，导致第208和379位氨基酸不一定一直是第208和379位的编号)，达到提升osugt91c1添加2号葡萄糖基的正常反应或(和)消除osugt91c1副反应的目的，都属于本专利的权利要求。
58.osugt91c1的氨基酸序列(加粗的氨基酸是本专利进行改动的氨基酸位点，划线部分是人为添加的氨基酸序列，其中le是为了方便连接进入大肠杆菌表达载体pet21b，hhhhhh(6个组氨酸标签)是为了方便后期的纯化)：
[0059][0060]
osugt91c1密码子优化后的核苷酸序列(划线序列为上述人为添加氨基酸序列的编码区)：
[0061]
atggatagcggttatagtagcagttatgccgcagccgccggcatgcatgttgtgatttgcccgtggctggcctttggtcatctgctgccgtgcttagacctggcccagcgtctggccagccgtggtcaccgtgttagctttgtgagcaccccgcgtaatatcagccgtctgccgccggttcgtccggcattagccccgctggtggcatttgtggccttaccgctgccgcgtgttgagggtctgcctgatggcgccgaaagtaccaacgacgtgccgcatgaccgcccggatatggtggagctgcatcgtcgcgcctttgatggtctggcagccccgtttagcgagtttctgggcacagcctgcgccgattgggtgatcgttgacgtgtttcatcactgggcagccgcagccgccctggaacataaagttccgtgcgcaatgatgctgctgggtagcgcccacatgattgccagcattgccgatcgtcgcctggaacgcgcagagaccgaaagcccggcagcagcaggtcaaggtcgtcctgccgcagccccgacctttgaagtggcccgcatgaaactgatccgtaccaaaggtagtagcggcatgagcctggccgaacgctttagcctgaccctgagccgcagtagcctggtggttggtcgcagttgtgtggaattcgagccggaaacagtgccgctgctgagcaccctgcgcggcaaaccgatcacctttctgggcctgatgccgccgtt
acatgaaggccgtcgtgaagatggtgaagatgccacagtgcgttggctggatgcacagccggccaaaagcgttgtgtacgttgccctgggtagcgaagttcctctgggtgtggaaaaggtgcacgaactggcactgggtctggaactggccggtacccgcttcctgtgggccttacgtaaacctaccggtgttagcgatgccgatctgctgccggcaggttttgaggaacgtacccgtggtcgcggtgttgtggcaacacgctgggttccgcagatgagcattctggcccatgccgccgtgggtgcctttctgacccattgtggctggaatagcaccatcgaaggcctgatgttcggccatcctctgatcatgctgcctatcttcggtgatcagggtccgaacgcacgcctgattgaagcaaagaatgccggtctgcaggtggcacgtaacgatggcgacggtagcttcgatcgtgaaggcgttgccgccgcaattcgcgccgttgcagttgaagaagagagcagcaaggtgttccaggccaaagccaaaaaactgcaggagatcgtggccgatatggcatgccatgagcgctacatcgatggcttcatccagcagctgcgcagctataaagatctcgagcaccaccaccaccaccac
[0062]
(2)对合成得到的osugt91c1编码区用表1所列的引物进行扩增，扩增片段的5’和3’端将分别带上nde i和xho i的限制酶位点。
[0063]
表1 pet21b-osugt91c1的引物序列
[0064][0065]
(3)用nde i和xho i对pet21b表达载体和步骤2的osugt91c1编码区扩增片段进行双酶切，将osugt91c1编码区用t4连接酶连接进pet21b载体的nde i和xho i酶切位点之间，组成在大肠杆菌可表达糖基转移酶osugt91c1的表达载体pet21b-osugt91c1。
[0066]
(4)将连接产物全部转入100μle.coli dh5α感受态细胞中，挑取平板上的阳性单克隆菌落接种于10ml的lb培养基中，200rpm 37℃培养12-16小时后提取质粒，测序验证表达质粒的正确性，完成天然状态osugt91c1糖基转移酶表达载体的构建。
[0067]
二、为了增强添加2号葡萄糖基的正常反应，构建新酶a(phe208met)的表达载体；为了既提升酶促添加2号葡萄糖基的目标催化活性，又消除副反应，构建新酶b(phe208met/phe379ala)的表达载体
[0068]
1、新酶a(phe208met)表达载体的构建
[0069]
(1)以天然状态pet21b-osugt91c1为模板，设计新酶a(phe208met)和新酶b(phe208met/phe379ala)所使用的定点突变引物如表2。
[0070]
表2突变体引物序列如下：(下划线部分表示突变位点)
[0071][0072]
(2)用ddh2o溶解表2的引物，稀释引物浓度为10μm。用phe208met的一对突变引物以pet21b-osugt91c1为模板进行pcr扩增，体系同为：dntp 4μl，5
×
ps buffer 10μl，上下游引物各2μl，模板1μl(约10ng)，pcr扩增酶primer star 0.5μl，剩余用ddh2o补齐至50μl。混匀后用pcr扩增，扩增程序：98℃预变性2min，98℃变性30s，69℃退火30s，72℃延伸8min，
扩增20个循环，72℃再延伸10min，最后4℃保存。
[0073]
(3)从上述扩增产物取出10μl进行琼脂糖胶验证pcr的扩增效果，剩余的40μl体系里各加1μldpni酶，37℃孵育1-2小时后取10μl分别转入100μle.coli dh5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激2min，再冰浴3min后加入新鲜lb 300μl，200rpm 37℃摇床孵育1小时后，分别取150μl均匀涂布于amp抗性的固体lb平板上，37℃静置培养过夜。
[0074]
(4)挑取两个平板上的单克隆菌落接种于10ml的lb培养基中，200rpm 37℃培养12-16小时后提取质粒，dna测序验证突变位点phe208met的正确性，编码的氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0075]
2、新酶b(phe208met/phe379ala)表达载体的构建
[0076]
(1)获得上述2.2.2.1第4步经过测序验证的新酶a(phe208met)的表达载体为模板，进行新酶b(phe208met/phe379ala)表达载体的构建；
[0077]
(2)用ddh2o溶解表2的引物，稀释引物浓度为10μm。用phe379ala的一对突变引物以新酶a(phe208met)的表达载体为模板进行pcr扩增，体系同上：dntp 4μl，5
×
ps buffer 10μl，上下游引物各2μl，模板1μl(约10ng)，pcr扩增酶primer star 0.5μl，剩余用ddh2o补齐至50μl。混匀后用pcr扩增，扩增程序：98℃预变性2min，98℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸8min，扩增20个循环，72℃再延伸10min，最后4℃保存。
[0078]
(3)从上述扩增产物取出10μl进行琼脂糖胶验证pcr的扩增效果，剩余的40μl体系里各加1μldpni酶，37℃孵育1-2小时后取10μl分别转入100μle.coli dh5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激2min，再冰浴3min后加入新鲜lb 300μl，200rpm 37℃摇床孵育1小时后，分别取150μl均匀涂布于amp抗性的固体lb平板上，37℃静置培养过夜。
[0079]
(4)挑取两个平板上的单克隆菌落接种于10ml的lb培养基中，200rpm 37℃培养12-16小时后提取质粒，dna测序验证两个突变位点phe208met和phe379ala的正确性，编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。
[0080]
三、天然状态osugt91c1和新酶a，新酶b的诱导表达和纯化
[0081]
(1)将上述三种酶对应的表达质粒转化至e.coli bl21(de3)表达菌株，第二天挑取单克隆接种于10ml新鲜的lb培养基中，200rpm 37℃培养过夜后加入终浓度为8％的甘油保种，该菌种可在-80℃长期保存。
[0082]
(2)挑取上一步保存的e.coli bl21(de3)甘油菌接种于含amp 50μg/ml的100ml新鲜lb培养基中，200rpm 37℃过夜培养。第二天以1％的接种比例接种于含amp 50μg/ml的1l新鲜lb培养基，180rpm 37℃培养至od600＝1.0后，菌液降温至16℃，添加终浓度为0.5mm的iptg，160rpm 16℃
–
20℃诱导表达18小时。
[0083]
(3)完成诱导表达后，4000rpm离心15min弃上清，收集菌体。菌体用重悬缓冲液(20mm tris-hcl buffer ph 7.8,0.5m nacl,30mm imidazole)重悬后，用高压破碎仪在1000bar压力下反复破碎3次。13500rpm 4℃离心60min，离心后的上清上样到nta-ni柱，用上述重悬缓冲液洗去非特异性结合的杂蛋白，带组氨酸标签的目的蛋白可被洗脱缓冲液(20mm tris-hcl buffer ph 7.8,0.5m nacl,250mm imidazole)洗脱下来。洗脱下来的蛋白进一步置换到20mm hepes buffer ph 7.2,50mm nacl里，经液氮速冻后，可长期保存于-80℃。上述步骤可纯化得到天然状态的osugt91c1、新酶a、新酶b，并通过sds-page检测纯度(图2)。
16-1)等甜菊糖苷底物，只要在c13-羟基或c-19羧基方向存在1号葡萄糖基，但不存在3号葡萄糖基，就可发生在c13-羟基或c-19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应。
[0092]
2、酶促产物分析，表明新酶b(phe208met/phe379ala)消除了添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)的副反应，但不影响在c13-羟基和c19-羧基方向添加2号葡萄糖基(与1号葡萄糖基形成β(1-2)糖苷键)的催化能力
[0093]
(1)以osugt91c1的底物stb(steviolbioside，cas 41093-60-1)为实施例，天然状态的osugt91c1可分别在底物stb上催化添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)的副反应(图5中a)，天然状态的osugt91c1副反应产物随时间和酶量的增加而增多，而新酶b(phe208met/phe379ala)无副反应产物的生成，已经消除添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)的副反应(图5中b)。
[0094]
副反应的实施例如下：在20℃-40℃，200μl反应体系包括：1mm udp-glucose,20mm tris-hcl缓冲液ph 7.2，浓度分别为0.15mg/ml(1
×
)和0.75mg/ml(5
×
)的酶样品(天然状态或者新酶b(phe208met/phe379ala))，0.3mm stb。通过加入酶样品启动反应，分别于0，2，18小时取样60μl，与等体积的正丁醇混合涡旋振荡，终止反应并萃取对应的酶促反应产物，室温17000rpm离心10min，室温静置1min，取上层正丁醇的萃取相50μl真空干燥后，用等体积的25％乙腈重悬后，利用hplc检测酶促产物。本实施例所列的反应条件不唯一，只要能使osugt91c1发生酶促反应，都可得到同样的结果。检测手段也不唯一，只要能区分每个酶促产物，可得到相同的检测结果。
[0095]
天然状态的osugt91c1催化副反应的底物不唯一，包括但不限于对以下甜菊糖苷底物发生副反应，stb(steviolbioside，cas 41093-60-1)，reb e(rebaudioside e，cas 63279-14-1)等，只要在c13-羟基或c-19羧基方向存在1号和2号葡萄糖基，但不存在3号葡萄糖基(3号葡萄糖基指与1号葡萄糖基形成β(1-3)糖苷键的葡萄糖基)，就可发生在对应的c13-羟基或c-19羧基方向添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)的副反应。
[0096]
(2)以osugt91c1的底物s13g(steviol-13-o-monoglucoside，cas 60129-60-4)为实施例，天然状态的osugt91c1先催化在底物s13g的c13-羟基(r1)端添加2号葡萄糖基的正常酶促反应生成stb，然后对stb发生副反应，添加6号(或4号)葡萄糖基，生成副产物(图6中a)；与之相反，新酶b(phe208met/phe379ala)只催化在底物s13g的c13-羟基(r1)端添加2号葡萄糖基的正常反应生成stb，不催化副反应，无副产物生成(图6中b)。
[0097]
实施例的反应条件如下：在20℃-40℃，200μl反应体系包括：1mm udp-glucose,20mm tris-hcl缓冲液ph 7.2，浓度分别为0.15mg/ml(1
×
)和0.75mg/ml(5
×
)的酶样品(天然状态或者新酶b(phe208met/phe379ala))，0.3mm底物s13g。通过加入酶样品启动反应，分别于0，2，18小时取样60μl，与等体积的正丁醇混合涡旋振荡，终止反应并萃取对应的酶促反应产物，室温17000rpm离心10min，室温静置1min，取上层正丁醇的萃取相50μl真空干燥后，用等体积的25％乙腈重悬后，利用hplc检测酶促产物。本实施例所列的反应条件不唯一，只要能使osugt91c1发生酶促反应，都可得到同样的结果。检测手段也不唯一，只要能区分每个酶促产物，可得到相同的检测结果。
[0098]
天然状态的osugt91c1和新酶b(phe208met/phe379ala)催化在c13-羟基或c-19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应的底物不唯一，包括但不限于，rubu(rubusoside，cas 64849-39-4)、s13g(steviol-13-o-monoglucoside，cas 60129-60-4)及reb a
(rebaudioside a,cas 58543-16-1)等甜菊糖苷底物，只要在c13-羟基或c-19羧基方向存在1号葡萄糖基，但不存在3号葡萄糖基，就可发生在c13-羟基或c-19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应；天然状态的osugt91c1催化副反应的底物不唯一，包括但不限于对以下甜菊糖苷底物发生副反应，stb(steviolbioside，cas 41093-60-1)，reb e(rebaudioside e，cas 63279-14-1)等，只要在c13-羟基或c-19羧基方向存在1号和2号葡萄糖基，但不存在3号葡萄糖基(3号葡萄糖基指与1号葡萄糖基形成β(1-3)糖苷键的葡萄糖基)，就可发生在对应的c13-羟基或c-19羧基方向添加6号葡萄糖基(或4号葡萄糖基)的副反应。
[0099]
3、酶促产物分析，表明新酶b(phe208met/phe379ala)提升了在c13-羟基，特别是c19-羧基方向添加2号葡萄糖基(与1号葡萄糖基形成β(1-2)糖苷键)的催化能力
[0100]
(1)以osugt91c1的底物rubu(rubusoside,cas 64849-39-4)为实施例，天然状态的osugt91c1可在底物rubu的c13-羟基、c19-羧基两个方向添加2号葡萄糖基(与1号葡萄糖基形成β(1-2)糖苷键)(正常反应)(图7中a)，而新酶b(phe208met/phe379ala)同样可在底物rubu的c13-羟基、c19-羧基两个方向添加2号葡萄糖基，而且可催化得到更多的在c19-羧基方向添加2号葡萄糖基的产物，具有增强的在c19-羧基方向的目标催化能力，最终得到在c13-羟基和c19-羧基两个方向都加有2号葡萄糖基的产物reb e(rebaudioside e,cas 63279-14-1)也明显多于天然状态的osugt91c1(图7中b)。
[0101]
实施例的反应体系如下：在20℃-40℃，200μl反应体系包括：1mm udp-glucose,20mm tris-hcl缓冲液ph 7.2，浓度分别为0.05mg/ml(1
×
)和0.25mg/ml(5
×
)的酶样品(天然状态或者新酶b(phe208met/phe379ala))，0.3mm底物rubu。通过加入酶样品启动反应，分别于0，2，18小时取样60μl，与等体积的正丁醇混合涡旋振荡，终止反应并萃取对应的酶促反应产物，室温17000rpm离心10min，室温静置1min，取上层正丁醇的萃取相50μl真空干燥后，用等体积的25％乙腈重悬后，利用hplc检测酶促产物。本实施例所列的反应条件不唯一，只要能使osugt91c1发生酶促反应，都可得到同样的结果。检测手段也不唯一，只要能区分每个酶促产物，可得到相同的检测结果。
[0102]
天然状态的osugt91c1和新酶b(phe208met/phe379ala)催化在c13-羟基或c-19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应的底物不唯一，包括但不限于，rubu(rubusoside，cas 64849-39-4)、s13g(steviol-13-o-monoglucoside，cas 60129-60-4)及reb a(rebaudioside a,cas 58543-16-1)等甜菊糖苷底物，只要在c13-羟基或c-19羧基方向存在1号葡萄糖基，但不存在3号葡萄糖基，就可发生在c13-羟基或c-19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应。
[0103]
(2)以osugt91c1的底物reb a(rebaudioside a,cas 58543-16-1)为实施例，天然状态的osugt91c1可在底物reb a的c19-羧基方向添加2号葡萄糖基(与1号葡萄糖基形成β(1-2)糖苷键)(正常反应)(图8中a)，而新酶b(phe208met/phe379ala)可明显率先将底物reb a完全消耗并生成目标产物reb d(rebaudioside d,cas 63279-13-0)，具有增强的在c19-羧基方向的目标催化能力，提高在c19-羧基方向添加2号葡萄糖基形成对应产物的能力(图8中b)。
[0104]
实施例的反应体系如下：在20℃-40℃，200μl反应体系包括：1mm udp-glucose,20mm tris-hcl缓冲液ph 7.2，浓度分别为0.05mg/ml(1
×
)和0.25mg/ml(5
×
)的酶样品(天然状态或者新酶b(phe208met/phe379ala))，0.3mm底物reb a。通过加入酶样品启动反应，
分别于0，2，18小时取样60μl，与等体积的正丁醇混合涡旋振荡，终止反应并萃取对应的酶促反应产物，室温17000rpm离心10min，室温静置1min，取上层正丁醇的萃取相50μl真空干燥后，用等体积的25％乙腈重悬后，利用hplc检测酶促产物。本实施例所列的反应条件不唯一，只要能使osugt91c1发生酶促反应，都可得到同样的结果。检测手段也不唯一，只要能区分每个酶促产物，可得到相同的检测结果。
[0105]
天然状态的osugt91c1和新酶b(phe208met/phe379ala)催化在c13-羟基或c-19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应的底物不唯一，包括但不限于，rubu(rubusoside，cas 64849-39-4)、s13g(steviol-13-o-monoglucoside，cas 60129-60-4)及reb a(rebaudioside a,cas 58543-16-1)等甜菊糖苷底物，只要在c13-羟基或c-19羧基方向存在1号葡萄糖基，但不存在3号葡萄糖基，就可发生在c13-羟基或c-19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应。
[0106]
4、通过荧光转化的方法，测定新酶a(phe208met)和新酶b(phe208met/phe379ala)催化在甜菊糖苷底物添加2号葡萄糖基(与1号葡萄糖基形成β(1-2)糖苷键)正常反应的速度。
[0107]
新酶a(phe208met)增强了催化正常所需的在甜菊糖苷底物添加第2号葡萄糖基(与1号葡萄糖基形成β(1-2)糖苷键)的反应速度，是天然状态osugt91c1活性的2倍以上；新酶b(phe208met/phe379ala)消除添加6号(或4号)葡萄糖基副反应的同时，增强了催化正常所需的在甜菊糖苷底物添加第2号葡萄糖基(与1号葡萄糖基形成β(1-2)糖苷键)的反应速度，是天然状态osugt91c1活性的3-7倍(表3)。
[0108]
表3天然状态osugt91c1、新酶a(phe208met)、新酶b(phe208met/phe379ala)催化在底物c13-羟基(r1)和c19-羧基(r2)端分别添加2号葡萄糖基(正常所需的催化反应)的动力学参数
[0109][0110]
(1)该测定直接利用商品化的糖基转移酶活性试剂盒完成，实施例使用promega公司的udp-glo
tm glycosyltransferase assay试剂盒，其他可用于糖基转移酶反应速度检测方法可得到同样结果。
[0111]
promega公司的udp-glo
tm glycosyltransferase assay试剂盒用于检测以udp-glucose为糖基供体的葡萄糖基转移酶反应速度，osugt91c1及本发明涉及的两个突变新酶均适用。
[0112]
在葡萄糖基转移酶的作用下，糖基供体udp-glucose将葡萄糖转移给底物后生成udp。该检测方法将生成udp等物质的量(1:1)转化为atp，atp可使荧光素酶发出定量的荧光，因此通过测定荧光量可检测酶促糖基转移反应生成udp的量。当生成udp在0-25μm浓度
范围内，产生的荧光强度和udp的摩尔浓度成线性关系。根据udp浓度和荧光强度对应关系的标准曲线，计算udp的生成量，可转化为糖基转移酶的催化反应速度。
[0113]
(2)配制udp不同浓度的一系列溶液，根据上述转化的反应，测定对应的荧光强度。天然状态osugt91c1及本发明涉及的两个新酶，以不同底物检测各种催化反应的速度及酶动力学常数等信息，用于评价本发明的新酶a(phe208met)和新酶b(phe208met/phe379ala)在促进添加2号葡萄糖基正常反应上的效果。利用rubu(rubusoside，cas 64849-39-4)、s13g(steviol-13-o-monoglucoside，cas 60129-60-4)及reb a(rebaudioside a,cas 58543-16-1)为底物分别检测新酶a(phe208met)和新酶b(phe208met/phe379ala)在c13-羟基，c19-羧基添加2号葡萄糖基的催化能力，并和天然状态osugt91c1的催化能力进行比较。天然状态的osugt91c1及新酶a(phe208met)、新酶b(phe208met/phe379ala)催化在c13-羟基或c-19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应的底物不唯一，包括但不限于，rubu(rubusoside，cas 64849-39-4)、s13g(steviol-13-o-monoglucoside，cas 60129-60-4)及reb a(rebaudioside a,cas 58543-16-1)等甜菊糖苷底物，只要在c13-羟基或c-19羧基方向存在1号葡萄糖基，但不存在3号葡萄糖基，就可发生在c13-羟基或c-19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应。
[0114]
(3)天然状态osugt91c1与新酶a(phe208met)和新酶b(phe208met/phe379ala)针对不同底物的酶动力学常数表3所示，新酶a(phe208met)增强了催化正常所需的在甜菊糖苷底物添加第2号葡萄糖基(与1号葡萄糖基形成β(1-2)糖苷键)的反应速度，是天然状态osugt91c1活性的2倍以上；新酶b(phe208met/phe379ala)消除添加6号(或4号)葡萄糖基副反应的同时，增强了催化正常所需的在甜菊糖苷底物添加第2号葡萄糖基(与1号葡萄糖基形成β(1-2)糖苷键)的反应速度，是天然状态osugt91c1活性的3-7倍(表3)。
[0115]
五、新酶b(phe208met/phe379ala)既无副反应的发生又提升了目标催化能力，可催化完成在甜菊糖苷底物c13-羟基或(和)c-19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应，生成包括reb e(rebaudioside e，cas 63279-14-1)的一系列甜菊糖苷产物。在此条件下，利用糖基转移酶ugt76g1在c13-羟基或(和)c-19羧基方向继续添加3号葡萄糖基，则可获得甜菊糖苷d和m(rebaudioside d，cas 63279-13-0和rebaudioside m，cas 1220616-44-3)(图9)。
[0116]
六、新酶a(phe208met)、新酶b(phe208met/phe379ala)的氨基酸序列具有冗余性，可以去除或改变第1-14位的任一氨基酸。
[0117]
以新酶b(phe208met/phe379ala)为实施例，对新酶b去除第1-14位的全部氨基酸(mdsgysssyaaaag)得到新酶b截短体，该截短体仍能正常表达、纯化，并显示出在甜菊糖苷底物c13-羟基或c-19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应的活性。
[0118]
1、为了验证第1-14位氨基酸(mdsgysssyaaaag)的冗余性，在新酶b(phe208met/phe379ala)的表达载体上构建去除第1-14位的全部氨基酸(mdsgysssyaaaag)(新酶b截短体)的表达载体
[0119]
(1)以新酶b(phe208met/phe379ala)的表达质粒为模板，设计去除第1-14位的全部氨基酸的截短体的引物如表4。
[0120]
表4突变体引物序列如下：
[0121][0122]
(2)用ddh2o溶解表4的引物，稀释引物浓度为10μm。用去除1-14-f和去除1-14-r的一对引物分别以新酶b(phe208met/phe379ala)的表达质粒为模板进行pcr扩增，体系同为：dntp 4μl，5
×
ps buffer 10μl，上下游引物各2μl，模板1μl(约10ng)，pcr扩增酶primer star 0.5μl，剩余用ddh2o补齐至50μl。混匀后用pcr扩增，扩增程序：98℃预变性2min，98℃变性30s，69℃退火30s，72℃延伸8min，扩增20个循环，72℃再延伸10min，最后4℃保存。
[0123]
(3)从上述扩增产物各取出10μl进行琼脂糖胶验证pcr的扩增效果，剩余的40μl体系里各加1μl dpni酶，37℃孵育1-2小时后取10μl分别转入100μl e.coli dh5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激2min，再冰浴3min后加入新鲜lb 300μl，200rpm37℃摇床孵育1小时后，分别取150μl均匀涂布于amp抗性的固体lb平板上，37℃静置培养过夜。
[0124]
(4)挑取两个平板上的单克隆菌落接种于10ml的lb培养基中，200rpm 37℃培养12-16小时后提取质粒，dna测序验证新酶b截短体的表达质粒，成功去除了第1-14位的全部氨基酸，除了第1-14位氨基酸被去除，其余位点氨基酸序列同seq id no.2维持一致。
[0125]
2、新酶b(phe208met/phe379ala)去除第1-14位的全部氨基酸后截短体的诱导表达和纯化
[0126]
(1)将对应的表达质粒转化至e.coli bl21(de3)表达菌株，第二天挑取单克隆接种于10ml新鲜的lb培养基中，200rpm 37℃培养过夜后加入终浓度为8％的甘油保种，该菌种可在-80℃长期保存。
[0127]
(2)挑取上一步保存的e.coli bl21(de3)甘油菌接种于含amp 50μg/ml的100ml新鲜lb培养基中，200rpm 37℃过夜培养。第二天以1％的接种比例接种于含amp 50μg/ml的1l新鲜lb培养基，180rpm 37℃培养至od600＝1.0后，菌液降温至16℃，添加终浓度为0.5mm的iptg，160rpm 16℃
–
20℃诱导表达18小时。
[0128]
(3)完成诱导表达后，4000rpm离心15min弃上清，收集菌体。菌体用重悬缓冲液(20mm tris-hcl buffer ph 7.8,0.5m nacl,30mm imidazole)重悬后，用高压破碎仪在1000bar压力下反复破碎3次。13500rpm 4℃离心60min，离心后的上清上样到nta-ni柱，用上述重悬缓冲液洗去非特异性结合的杂蛋白，带组氨酸标签的目的蛋白可被洗脱缓冲液(20mm tris-hcl buffer ph 7.8,0.5m nacl,250mm imidazole)洗脱下来。洗脱下来的蛋白进一步置换到20mm hepes buffer ph 7.2,50mm nacl里，经液氮速冻后，可长期保存于-80℃。上述步骤可纯化得到新酶b的截短体，并通过sds-page检测纯度(图10)。由图10可见，当新酶b去除第1-14位氨基酸的截短体可以进行正常的表达和纯化。由于新酶a和新酶b具有同样的第1-14位氨基酸，对新酶b完全去除第1-14位氨基酸的实施例，显示第1-14位氨基酸具有冗余性。同理，新酶a的第1-14位氨基酸也具有冗余性。
[0129]
3、新酶b的截短体不影响在甜菊糖苷底物的c13-羟基和c-19羧基两个方向添加第2号葡萄糖基的正常反应，其活性和新酶b一样，比天然转态糖基转移酶osugt91c1的催化活性更高，进一步显示第1-14位氨基酸在新酶a和新酶b中的冗余性。
[0130]
(1)以甜菊糖苷底物rubu(rubusoside,cas 64849-39-4)为实施例，天然状态的
osugt91c1可在底物rubu的c13-羟基、c19-羧基两个方向添加2号葡萄糖基(与1号葡萄糖基形成β(1-2)糖苷键)(正常反应)(图11中a)，新酶b的截短体同样可在底物rubu的c13-羟基、c19-羧基两个方向添加2号葡萄糖基(图11中b)。
[0131]
(2)实施例的反应体系如下：在20℃-40℃，200μl反应体系包括：1mm udp-glucose,20mm tris-hcl缓冲液ph 7.2，浓度分别为0.05mg/ml(1
×
)和0.25mg/ml(5
×
)的酶样品(天然状态或者新酶b截短体)，0.3mm底物rubu。通过加入酶样品启动反应，分别于0，2，18小时取样60μl，与等体积的正丁醇混合涡旋振荡，终止反应并萃取对应的酶促反应产物，室温17000rpm离心10min，室温静置1min，取上层正丁醇的萃取相50μl真空干燥后，用等体积的25％乙腈重悬后，利用hplc检测酶促产物。本实施例所列的反应条件不唯一，只要能使osugt91c1发生酶促反应，都可得到同样的结果。检测手段也不唯一，只要能区分每个酶促产物，可得到相同的检测结果。
[0132]
(3)天然状态的osugt91c1和新酶b截短体催化在c13-羟基或c-19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应的底物不唯一，包括但不限于，rubu(rubusoside，cas 64849-39-4)、s13g(steviol-13-o-monoglucoside，cas 60129-60-4)及reb a(rebaudioside a,cas 58543-16-1)等甜菊糖苷底物，只要在c13-羟基或c-19羧基方向存在1号葡萄糖基，但不存在3号葡萄糖基，就可发生在c13-羟基或c-19羧基方向添加2号葡萄糖基的正常反应。