1.本公开涉及将外源核苷酸序列整合到宿主细胞基因组中的方法，具体地，涉及通过使用多转座子系统将外源核苷酸序列整合到哺乳动物宿主细胞中的方法。
背景技术：
：：2.转座子(transposon)是指可改变其在基因组内的位置的dna序列。转座子可产生或逆转突变并改变细胞基因组的大小。dna转座子在表达的转座酶(transpotase)作用下，可以以简单的剪切-粘贴的方式从一个dna位点易位到另一个位点。转座是一个精确的过程，其中将限定的dna片段，通常是转座子两端的直接重复序列(directrepeat，简称dr)和与它们相连的反向重复序列(invertrepeat，简称ir)以及中间的插入序列(insertsequence，简称is)，从一个dna分子中切出并移动到相同或不同dna分子或基因组中的另一个位点。3.目前已有利用转座子系统将目的基因插入宿主细胞基因组的方法被公开。然而，大多数转座子系统在插入靶基因时都具有插入拷贝数的上限。尤其是当涉及多个靶基因的插入时，已有的方法无法以较高的拷贝数插入多个靶基因，并且也无法有效地调节插入的多个靶基因拷贝数的比率。4.发明概述5.在一个方面，本公开提供一种用于将一种或多种外源核苷酸序列整合到哺乳动物宿主细胞基因组中的方法，所述方法包括通过使用至少两种转座子系统将所述一种或多种外源核苷酸序列整合到所述哺乳动物宿主细胞基因组中。6.在一个实施方案中，在本公开的用于将一种或多种外源核苷酸序列整合到哺乳动物宿主细胞基因组中的方法中，所述至少两种转座子系统包括：tol1转座子系统、tol2转座子系统、frogprince转座子系统、minos转座子系统、hsmar1转座子系统、helraiser转座子系统、zb转座子系统、intruder转座子系统、spinon转座子系统、tcbuster转座子系统、passport转座子系统、yabusame-1转座子系统、uribo2转座子系统、piggybac(pb)转座子系统、sleepingbeauty(sb)转座子系统，以及上述转座子系统的各种变体或衍生物。7.在另一个实施方案中，在本公开的用于将一种或多种外源核苷酸序列整合到哺乳动物宿主细胞基因组中的方法中，所述至少两种转座子系统包括：tol1转座子系统、tol2转座子系统、zb转座子系统、intruder转座子系统、tcbuster转座子系统、yabusame-1转座子系统、uribo2转座子系统、pb转座子系统和sb转座子系统，以及上述转座子系统的各种变体或衍生物。8.在另一个实施方案中，通过同时或相继使用所述至少两种转座子系统将所述一种或多种外源核苷酸序列整合到所述哺乳动物宿主细胞基因组中。9.在另一个方面，本公开提供通过如上所述的本公开的方法获得的包含整合在其基因组中的一种或多种外源核苷酸序列的哺乳动物细胞。10.在另一个方面，本公开提供一种哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含整合在所述哺乳动物细胞的基因组中的至少两种转座子。11.在一个实施方案中，在所述哺乳动物细胞的基因组中，所述至少两种转座子的序列彼此不重叠。12.在一个实施方案中，在本公开的哺乳动物细胞中，所述至少两种转座子包括：tol1转座子、tol2转座子、frogprince转座子、minos转座子、hsmar1转座子、helraiser转座子、zb转座子、intruder转座子、spinon转座子、tcbuster转座子、passport转座子、yabusame-1转座子、uribo2转座子、piggybac(pb)转座子、sleepingbeauty(sb)转座子，以及上述转座子的各种变体或衍生物。13.在另一个实施方案中，在本公开的哺乳动物细胞中，所述至少两种转座子包括：tol1转座子、tol2转座子、zb转座子、intruder转座子、tcbuster转座子、yabusame-1转座子、uribo2转座子、pb转座子和sb转座子，以及上述转座子的各种变体或衍生物。14.在另一个方面，本公开提供一种用于构建慢病毒生产细胞系的方法，所述方法包括通过使用至少两种转座子系统将慢病毒的gag、pol和rev基因的序列、病毒包膜蛋白的编码序列、以及携带目的核酸片段的病毒基因组转录盒序列整合到宿主细胞基因组中。15.在一个实施方案中，在本公开的用于构建慢病毒生产细胞系的方法中，所述至少两种转座子系统包括：tol1转座子系统、tol2转座子系统、frogprince转座子系统、minos转座子系统、hsmar1转座子系统、helraiser转座子系统、zb转座子系统、intruder转座子系统、spinon转座子系统、tcbuster转座子系统、passport转座子系统、yabusame-1转座子系统、uribo2转座子系统、piggybac(pb)转座子系统、sleepingbeauty(sb)转座子系统，以及上述转座子系统的各种变体或衍生物。16.在另一个实施方案中，在本公开的用于构建慢病毒生产细胞系的方法中，所述至少两种转座子系统包括：tol1转座子系统、tol2转座子系统、zb转座子系统、intruder转座子系统、tcbuster转座子系统、yabusame-1转座子系统、uribo2转座子系统、pb转座子系统和sb转座子系统，以及上述转座子系统的各种变体或衍生物。17.在另一个方面，本公开提供一种慢病毒生产细胞系，其特征在于，所述慢病毒生产细胞系包含整合在其基因组中的至少两种转座子。18.在一个实施方案中，在本公开的慢病毒生产细胞系中，所述至少两种转座子包括：tol1转座子、tol2转座子、frogprince转座子、minos转座子、hsmar1转座子、helraiser转座子、zb转座子、intruder转座子、spinon转座子、tcbuster转座子、passport转座子、yabusame-1转座子、uribo2转座子、piggybac(pb)转座子、sleepingbeauty(sb)转座子，以及上述转座子的各种变体或衍生物。19.在另一个实施方案中，在本公开的慢病毒生产细胞系中，所述至少两种转座子包括：tol1转座子、tol2转座子、zb转座子、intruder转座子、tcbuster转座子、yabusame-1转座子、uribo2转座子、pb转座子和sb转座子，以及上述转座子的各种变体或衍生物。20.发明详述21.当在本文中使用时，“通过同时或相继使用至少两种转座子系统将一种或多种外源核苷酸序列整合到宿主细胞基因组中”包括，例如，使用两种以上的本公开的转座子系统同时或相继向宿主细胞基因组中整合同一种外源核苷酸序列，并且也包括使用两种以上的本公开的转座子系统同时或相继向宿主细胞基因组中整合两种以上的外源核苷酸序列。transposaseforgenetransferandgenediscoveryapplications.inmobdna7,p.6(其内容通过引用结合于此)，以及kawakamik,shimaa.(1999):identificationofthetol2transposaseofthemedakafishoryziaslatipesthatcatalyzesexcisionofanonautonomoustol2elementinzebrafishdaniorerio.ingene.1999nov15；240(1):239-44(其内容通过引用结合于此)。关于tir序列的优化可参见，例如，urasaki,a.等(2006):functionaldissectionofthetol2transposableelementidentifiedtheminimalcis-sequenceandahighlyrepetitivesequenceinthesubterminalregionessentialfortransposition.ingenetics174(2),pp.639–649(其内容通过引用结合于此)。最小tir序列为t2al200r150g(genbankaccessionnumberab262452)。在本文中，术语“tol2转座子系统”可以包括含有相应转座酶及其不同变体以及相应转座子及其不同变体的tol2转座子系统。29.frogprince(fp)转座子系统30.frogprince(青蛙王子)转座子系统的介绍可参见，例如，国际申请wo2003100070(其内容通过引用结合于此)以及miskeyc.等thefrogprince:areconstructedtransposonfromranapipienswithhightranspositionalactivityinvertebratecells.nucleicacidsres.2003；31(23):6873-6881(其内容通过引用结合于此)。在本文中，术语“frogprince转座子系统”可以包括含有相应转座酶及其不同变体以及相应转座子及其不同变体的frogprince转座子系统。31.minos转座子系统32.minos转座子系统的介绍可参见，例如，metaxakis,athanasios等(2005):minosasageneticandgenomictoolindrosophilamelanogaster.ingenetics171(2),pp.571–581(其内容通过引用结合于此)以及franz,g.等(1991):minos,anewtransposableelementfromdrosophilahydei,isamemberofthetc1-likefamilyoftransposons.innucleicacidsresearch19(23),p.6646(其内容通过引用结合于此)。在本文中，术语“minos转座子系统”可以包括含有相应转座酶及其不同变体以及相应转座子及其不同变体的minos转座子系统。33.hsmar1转座子系统34.hsmar1转座子系统的介绍可参见，例如，国际申请wo2006108525(其内容通过引用结合于此)，以及miskey,csaba等(2007):theancientmarinersailsagain:transpositionofthehumanhsmar1elementbyareconstructedtransposaseandactivitiesofthesetmarproteinontransposonends.inmolecularandcellularbiology27(12),pp.4589–4600(其内容通过引用结合于此)。在本文中，术语“hsmar1转座子系统”可以包括含有相应转座酶及其不同变体以及相应转座子及其不同变体的hsmar1转座子系统。35.helraiser转座子系统36.helraiser是一种利用生物信息学方法重建的活性helitron转座子，helraiser转座子系统的介绍可参见，例如，grabundzija,ivana等(2016):ahelitrontransposonreconstructedfrombatsrevealsanovelmechanismofgenomeshufflingineukaryotes.innaturecommunications7,p.10716(其内容通过引用结合于此)，grabundzija,ivana等(2018):helraiserintermediatesprovideinsightintothemechanismofeukaryoticreplicativetransposition.innaturecommunications9(1),p.1278(其内容通过引用结合于此)，以及专利申请us20190323037(其内容通过引用结合于此)。在本文中，术语“helraiser转座子系统”可以包括含有相应转座酶及其不同变体以及相应转座子及其不同变体的helraiser转座子系统。37.zb转座子系统38.zb转座子系统的介绍可参见，例如，shen,dan等(2021):anative,highlyactivetc1/marinertransposonfromzebrafish(zb)offersanefficientgeneticmanipulationtoolforvertebrates.innucleicacidsresearch49(4),pp.2126–2140(其内容通过引用结合于此)，以及cn105018523b(其内容通过引用结合于此)。在本文中，术语“zb转座子系统”可以包括含有相应转座酶及其不同变体以及相应转座子及其不同变体的zb转座子系统。39.intruder(it)转座子系统40.intruder转座子系统的介绍可参见，例如，gao,bo等(2020):intruder(dd38e),arecentlyevolvedsiblingfamilyofdd34e/tc1transposonsinanimals.inmobiledna11(1),p.32(其内容通过引用结合于此)。在本文中，术语“intruder转座子系统”可以包括含有相应转座酶及其不同变体以及相应转座子及其不同变体的intruder转座子系统。41.spinon转座子系统42.spinon转座子系统的介绍可参见，例如，gilbert,c.等(2012):rampanthorizontaltransferofspintransposonsinsquamatereptiles.inmolecularbiologyandevolution29(2),pp.503–515(其内容通过引用结合于此)，以及li,xianghong等(2013):aresurrectedmammalianhattransposableelementandacloselyrelatedinsectelementarehighlyactiveinhumancellculture.inproceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica110(6),e478-87(其内容通过引用结合于此)。在本文中，术语“spinon转座子系统”可以包括含有相应转座酶及其不同变体以及相应转座子及其不同变体的spinon转座子系统。43.tcbuster转座子系统44.tcbuster转座子系统的介绍可参见，例如，woodard,laurene.等(2012):comparativeanalysisoftherecentlydiscoveredhattransposontcbusterinhumancells.inplosone7(11),e42666(其内容通过引用结合于此)，li,xianghong等(2013):aresurrectedmammalianhattransposableelementandacloselyrelatedinsectelementarehighlyactiveinhumancellculture.inproceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica110(6),e478-87(其内容通过引用结合于此)，以及us20180216087(其内容通过引用结合于此)和cn108728477a(其内容通过引用结合于此)。tcbusterco(原始tcbuster)转座酶的序列可参见上述li,xianghong等(2013)。具有增强活性的多种tcbuster转座酶变种的序列描述于us20180216087。us20180216087和cn108728477a分别描述了tcbuster转座子系统的多种5’tir和3’tir序列变体。上述不同的5’tir和3’tir可组合使用。在本文中，术语“tcbuster转tol2inhek293:prosandconsforgenediscoveryandgenetherapy.inbmcbiotechnology11,p.28；troyanovsky,boris等(2016):thefunctionalityofminimalpiggybactransposonsinmammaliancells.inmoleculartherapy.nucleicacids5(10),e369；wen,wen等(2020):anefficientscreeningsysteminyeasttoselectahyperactivepiggybactransposaseformammalianapplications.ininternationaljournalofmolecularsciences21(9)(上述文献通过引用结合与此)以及genbank登录号abc67521。在本文中，术语“piggybac(pb)转座子系统”可以包括含有相应转座酶及其不同变体以及相应转座子及其不同变体的pb转座子系统。51.sleepingbeauty转座子系统52.sleepingbeauty(睡美人，sb)转座子系统由sb转座酶和转座子组成，其能够将特定的dna插入序列插入脊椎动物的基因组中。sb转座酶可将转座子插入受体dna序列中的ta二核苷酸碱基对中。插入位点可位于同一个dna分子(或染色体)的其他位置或者位于另一个dna分子(或染色体)中。sb转座子由目的插入序列及位于其两端的用于被sb转座酶识别的ir/dr序列(本身含有短的直接重复(directrepeat，dr)的反向重复(invertedrepeat，ir))组成。转座酶可在转座子内进行编码，或者转座酶可由另一个来源提供。sb转座子系统中的转座酶、ir/dr序列和转座子的野生型和不同变体在本领域中是已知的。关于sb转座酶及其各种变种(例如，sb1至sb10，sb11，sb17，sb100x，sb130x)的描述及序列信息可参见例如，ivics,zoltán等(1997):molecularreconstructionofsleepingbeauty,atc1-liketransposonfromfish,anditstranspositioninhumancells.incell91(4),pp.501–510；baus,james等(2005):hyperactivetransposasemutantsofthesleepingbeautytransposon.inmoleculartherapy:thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy12(6),pp.1148–1156；mátés,lajos等(2009):molecularevolutionofanovelhyperactivesleepingbeautytransposaseenablesrobuststablegenetransferinvertebrates.innaturegenetics41(6),pp.753–761；voigt,franka等(2016):sleepingbeautytransposasestructureallowsrationaldesignofhyperactivevariantsforgeneticengineering.innaturecommunications7,p.11126；kesselring,lisa等(2020):asingleaminoacidswitchconvertsthesleepingbeautytransposaseintoanefficientunidirectionalexcisionasewithutilityinstemcellreprogramming.innucleicacidsresearch48(1),pp.316–331；querques,irma等(2019):ahighlysolublesleepingbeautytransposaseimprovescontrolofgeneinsertion.innaturebiotechnology37(12),pp.1502–1512；wo9840510a1；wo2003089618a2；wo2009003671a2；wo2017046259a1；wo2017158029a1(上述文献的内容通过引用结合与此)。关于sb转座子的tir以及转座子载体(例如，pt1，pt2，pt3，pt4)的描述及相关序列信息可进一步参见例如，yant,stephenr.等(2004):mutationalanalysisofthen-terminaldna-bindingdomainofsleepingbeautytransposase:criticalresiduesfordnabindingandhyperactivityinmammaliancells.inmolecularandcellularbiology24(20),pp.9239–9247；cui,zongbin等(2002):structure–functionanalysisoftheinvertedterminalrepeatsofthesleepingbeautytransposon.injournalofmolecularbiology318(5),pp.1221–1235；izsvák,ltd进行。下表3列举了本公开使用的质粒编号、名称、插入物的核酸序号、插入酶切位点和插入的质粒载体的编号。以下实施例中所涉及的各质粒中采用的功能元件的序列信息和证明本公开效用的实施例仅是作为实施本公开的示例，而不应当被视为限制本发明的保护范围，本领域技术人员可以预期可以通过用具有相似生物学功能的其他序列代替以下实施例中使用的质粒上的功能元件的序列来实现本公开的技术效果，上述序列包括但不限于骨架序列(如复制起点，抗性基因等)，限制性内切酶位点，转座子重复序列，诱导表达系统的响应元件序列，绝缘子序列，启动子序列，内含子序列，polya序列，不同密码子优化的基因序列，以上功能元件序列和基因序列的突变体，以及以上功能元件序列和基因序列的克隆位置，克隆序列和克隆方向。具体的质粒构建方法如下所述：58.1.转座酶质粒的构建：将合成的序列seqidno:1，seqidno:6，seqidno:11，seqidno:15，seqidno:19，seqidno:23，seqidno:28，seqidno:32，seqidno:36，seqidno:41，seqidno:49，seqidno:54，seqidno:55，seqidno:60，seqidno:61，seqidno:69，seqidno:72和seqidno:71分别用限制性酶clai和xhoi消化，并且连接至质粒06.01.1812(seqidno:90)的限制性位点clai和xhoi，从而分别构建质粒06.01.1494，06.01.1504，06.01.1527，06.01.1535，06.01.1538，06.01.1579，06.01.1573，06.01.1582，06.01.1596，06.01.1614，06.01.1679，06.01.1687，06.01.1740，06.01.1770，06.01.1790，06.01.1581，06.01.1892和06.01.1903。分别将合成的序列seqidno:70和seqidno:78用bamhi和xhoi消化，并且连接至质粒06.01.1812(seqidno:90)的限制性位点bamhi和xhoi，从而分别构建质粒06.01.1757和06.01.1807。59.2.转座酶突变体质粒的构建60.tcbuster转座酶突变体质粒的构建：通过利用融合pcr(fusionpcr)将使用质粒06.01.1614作为模板，s3f和tcbmke573-r，tcbmke573-f和s_ires-r作为引物进行pcr扩增的两个dna片段连接，构建tcbuster#2编码序列。通过利用融合pcr将使用质粒06.01.1614作为模板，s3f和tcbma358-r，tcbma358-f和s_ires-r作为引物进行pcr扩增的两个dna片段连接，构建tcbuster#3编码序列。通过利用融合pcr将使用质粒06.01.1614作为模板，s3f和tcbmi452-r，tcbmi452-f和s_ires-r作为引物进行pcr扩增的两个dna片段连接，构建tcbuster#4编码序列。通过利用融合pcr将使用质粒06.01.1614作为模板，s3f和tcbmn85-r，tcbmn85-f和s_ires-r作为引物进行pcr扩增的两个dna片段连接，构建tcbuster#5编码序列。将以上片段(tcbuster#2、tcbuster#3、tcbuster#4、tcbuster#5编码序列)分别用clai和xhoi酶消化，并且连接至质粒06.01.1812(seqidno:90)的限制性位点clai和xhoi，从而分别构建质粒06.01.1681，06.01.1696，06.01.1703和06.01.1705。61.家蚕yabusame-1转座酶突变体质粒的构建：通过利用融合pcr将使用质粒06.01.1687作为模板，s3f和c_yabf321d-r，c_yabf321d-f和c_yabsk-r，c_yabsk-f和s_ires-r作为引物进行pcr扩增的三个dna片段连接，构建yabusame-1#3编码序列。使用质粒06.01.1687作为模板，c_optihbm-f和s_ires-r作为引物，对yabusame-1#4编码序列进行pcr扩增。使用质粒06.01.1740作为模板，c_optihbm#2-f和s_ires-r作为引物，对yabusame-1#5编码序列pcr扩增。将以上片段(yabusame-1#3、yabusame-1#4、yabusame-1#5编码序列)分别用clai和xhoi酶消化，并且连接至质粒06.01.1812(seqidno:90)的限制性位点clai和xhoi，从而分别构建质粒06.01.1517，06.01.1778和06.01.1795。62.热带爪蟾uribo2转座酶突变体质粒的构建：通过利用融合pcr将使用质粒06.01.1770作为模板，s3f和c_xtup148t-r，c_xtup148t-f和c_xtud359n-r，c_xtud359n-f和c_xtua462h-r，c_xtua462h-f和c_xtuf576r-r作为引物进行pcr扩增的四个dna片段连接，构建uribo2#3编码序列。通过利用融合pcr将使用质粒06.01.1770作为模板，s3f和c_xtus193k-r，c_xtus193k-f和c_xtud359n-r，c_xtud359n-f和c_xtua462h-r，c_xtua462h-f和s_ires-r作为引物进行pcr扩增的四个dna片段连接，构建uribo2#4编码序列。使用质粒06.01.1770作为模板，c_xtu#1-f和s_ires-r作为引物，对uribo2#5编码序列进行pcr扩增。使用质粒06.01.1790作为模板，c_xtu#2-f和s_ires-r作为引物，对uribo2#6编码序列进行pcr扩增。将以上片段(uribo2#3、uribo2#4、uribo2#5、uribo2#6编码序列)分别用clai和xhoi酶消化，并且连接至质粒06.01.1812(seqidno:90)的限制性位点clai和xhoi，从而分别构建质粒06.01.1850，06.01.1862，06.01.1872和06.01.1884。63.sb转座酶突变体质粒的构建：通过利用融合pcr将使用质粒06.01.1807作为模板，s3f和c_sb100#2-r，c_sb100#2-f和s_ires-r作为引物进行pcr扩增的两个dna片段连接，构建sb100#2编码序列。将以上片段用clai和xhoi酶消化，并且连接至质粒06.01.1812(seqidno:90)的限制性位点clai和xhoi，从而构建质粒06.01.1941。64.3.转座子质粒的构建：分别用noti和asisi酶消化合成的序列seqidno:5，seqidno:10，seqidno:14，seqidno:18，seqidno:22，seqidno:31，seqidno:35，seqidno:40，seqidno:45，seqidno:48，seqidno:53，seqidno:59，seqidno:65，seqidno:68，seqidno:77，seqidno:76，seqidno:88和seqidno:89，并连接至质粒06.01.1955(seqidno:91)限制性位点noti和asisi，从而分别构建质粒06.01.1939，06.01.1946，06.01.1952，06.01.1957，06.01.1958，06.01.1982，06.01.1985，06.01.2014，06.01.2016，06.01.2018，06.01.2029，06.01.2037，06.01.2052，06.01.2056，06.01.1917，06.01.2072，06.01.1367和06.01.2099。用bbsi和asisi消化合成的序列seqidno:27，并连接至质粒06.01.1955(seqidno:91)的限制性位点noti和asisi，从而构建质粒06.01.1967。65.4.具有puromycin(puro)抗性基因和hpgk-luciferase-ires-egfp序列的转座子质粒的构建：分别用sbfi/paci和paci/asci消化合成的序列seqidno:93和seqidno:92，并分别连接至质粒06.01.1939，06.01.1946，06.01.1952，06.01.1957，06.01.1958，06.01.1967，06.01.1982，06.01.1985，06.01.2014，06.01.2016，06.01.2018，06.01.2029，06.01.2037，06.01.2052，06.01.2056，06.01.1917，06.01.2072，06.01.1367和06.01.2099的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.2141，06.01.2143，06.01.2148，06.01.2170，06.01.2206，06.01.2218，06.01.2229，06.01.2250，06.01.2259，06.01.2263，06.01.2273，06.01.2277，06.01.2286，06.01.2289，06.01.2305，06.01.2331，06.01.2336，06.01.2343和06.01.2327。66.5.具有hygromycin(hygro)抗性基因和hpgk-luciferase-ires-egfp序列的转座子质粒的构建：分别用sbfi/paci和paci/asci消化合成的序列seqidno:94和seqidno:92，并分别连接至质粒06.01.1939，06.01.1946，06.01.1952，06.01.1957，06.01.1958，06.01.1967，06.01.1982，06.01.1985，06.01.2014，06.01.2016，06.01.2018，06.01.2029，06.01.2037，06.01.2052，06.01.2056，06.01.1917，06.01.2072，06.01.1367和06.01.2099的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.3233，06.01.2347，06.01.3321，06.01.3331，06.01.3372，06.01.2358，06.01.3428，06.01.3455，06.01.3457，06.01.2360，06.01.2362，06.01.2879，06.01.2370，06.01.2379，06.01.2420，06.01.2429，06.01.3105，06.01.2433和06.01.2430。67.6.具有blasticidin抗性基因和hpgk-luciferase-ires-egfp序列的转座子质粒的构建：分别用sbfi/paci和paci/asci消化合成的序列seqidno:95和seqidno:92，并连接至质粒06.01.1367的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.3335。68.用于慢病毒稳定生产细胞系的转座子质粒的构建：分别用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:96，seqidno:97，seqidno:98和seqidno:99，并连接至质粒06.01.1939的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4301，06.01.4302，06.01.4303和06.01.4304。分别用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:96，seqidno:97，seqidno:98和seqidno:99，并连接至质粒06.01.1946的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4305，06.01.4306，06.01.4307和06.01.4308。分别用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:96，seqidno:97，seqidno:98和seqidno:99，并连接至质粒06.01.1952的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4309，06.01.4310，06.01.4311和06.01.4312。分别用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:96，seqidno:97，seqidno:98和seqidno:99，并连接至质粒06.01.1957的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4313，06.01.4314，06.01.4315和06.01.4316。分别用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:96，seqidno:97，seqidno:98和seqidno:99，并连接至质粒06.01.1958的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4317，06.01.4318，06.01.4319和06.01.4320。分别用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:96，seqidno:97，seqidno:98和seqidno:99，并连接至质粒06.01.1967的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4321，06.01.4322，06.01.4323和06.01.4324。分别用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:96，seqidno:97，seqidno:98和seqidno:99，并连接至质粒06.01.1982的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4325，06.01.4326，06.01.4327和06.01.4328。分别用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:96，seqidno:97，seqidno:98和seqidno:99，并连接至质粒06.01.1985的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4329，06.01.4330，06.01.4331和06.01.4332。分别用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:96，seqidno:97，seqidno:98和seqidno:99，并连接至质粒06.01.2014的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4333，06.01.4334，06.01.4335和06.01.4336。分别用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:96，seqidno:97，seqidno:98和seqidno:99，并连接至质粒06.01.2016的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4337，06.01.4338，06.01.4339和06.01.4340。分别用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:96，seqidno:97，seqidno:98和seqidno:99，并连接至质粒06.01.2029的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4341，06.01.4342，06.01.4343和06.01.4344。分别用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:96，seqidno:97，seqidno:98和seqidno:99，并连接至质粒06.01.2037的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4345，06.01.4346，06.01.4347和06.01.4348。分别用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:96，seqidno:97，seqidno:98和seqidno:99，并连接至质粒06.01.2052的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4349，06.01.4350，06.01.4351和06.01.4352。分别用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:96，seqidno:97，seqidno:98和seqidno:99，并连接至质粒06.01.1917的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4353，06.01.4354，06.01.4355和06.01.4356。分别用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:96，seqidno:97，seqidno:98和seqidno:99，并连接至质粒06.01.1367的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4357，06.01.4358，06.01.4359和06.01.4360。用sbfi/asci消化合成的序列seqidno:100，并连接至质粒06.01.1939，06.01.1946，06.01.1952，06.01.1957，06.01.1958，06.01.1967，06.01.1982，06.01.1985，06.01.2014，06.01.2016，06.01.2029，06.01.2037，06.01.2052，06.01.1917和06.01.1367的限制性位点sbfi和asci，从而构建质粒06.01.4361，06.01.4362，06.01.4363，06.01.4364，06.01.4365，06.01.4366，06.01.4367，06.01.4368，06.01.4369，06.01.4370，06.01.4371，06.01.4372，06.01.4373，06.01.4374和06.01.4375。69.表1：根据本公开的序列的概述70.71.[0072][0073]表2：用于质粒构建的引物[0074][0075]表3：质粒名称及构建信息[0076][0077][0078][0079][0080][0081]实施例2:使用多转座子系统测试基因插入效率及靶基因活性[0082]对于大多数生物制品的生产，例如哺乳动物细胞表达的重组蛋白生产，单位体积培养物的表达水平与目的核苷酸片段在工程细胞基因组中的插入拷贝数成正相关。增加目的核苷酸片段的插入拷贝数是提高生产细胞系表达水平最有效的策略之一。然而，大多数转座子系统在插入一段或多段目的核苷酸片段时具有插入拷贝数的上限。本发明的发明人证明，使用本公开中公开的多转座子系统能够有效增加目的核苷酸片段(goi)在细胞内插入拷贝数的上限，并显著提高目的蛋白的表达量。[0083]hpgk-luciferase-ires-egfp-wpre做为目的核苷酸片段被用于检测多转座子系统在插入目的基因中的有效性：hpgk-luciferase-ires-egfp-wpre在被转染到哺乳动物细胞中后，将表达荧光素酶(luciferase)和egfp蛋白。细胞中荧光素酶的活性和其蛋白表达量高度正相关，并且可以通过荧光素酶测定来测量。另外此目的核苷酸片段还含有wpre序列，其被用作通过qpcr量化宿主细胞基因组中插入拷贝数的标签。将此目的核苷酸片段分别连接三种抗性基因puror(嘌呤霉素抗性基因)、hygror(潮霉素抗性基因)和bsd(杀稻瘟菌素抗性基因)，以用于在转染后快速筛选在基因组中稳定插入目的核苷酸片段的阳性细胞群。将上述三种携带不同抗性基因的目的核苷酸片段puror(r)-hpgk-luciferase-ires-egfp-wpre、hygror(r)-hpgk-luciferase-ires-egfp-wpre和bsd(r)-hpgk-luciferase-ires-egfp-wpre分别克隆到含有转座酶识别序列末端反向重复(tir)的不同转座子质粒中并用于后续测试多转座子系统在插入目的核苷酸片段的有效性。[0084]首先用包含puror(r)-hpgk-luciferase-ires-egfp-wpre目的核苷酸片段的第一转座子质粒和相应的转座酶表达质粒共转染293t细胞(atcc，crl3216)，并且筛选嘌呤霉素抗性群体。然后用包含hygror(r)-hpgk-luciferase-ires-egfp-wpre目的核苷酸片段的不同于第一转座子的第二转座子质粒和相应的转座酶表达质粒共转染上述嘌呤霉素抗性细胞，并且筛选嘌呤霉素和潮霉素双抗性细胞群。之后通过检测双抗性细胞群的荧光素酶活性对比荧光素酶表达量并且通过qpcr检测双抗性细胞群的平均wpre拷贝数。第一和第二转座子质粒以及对应的转座酶质粒编号，测量的荧光素酶活性以及通过qpcr测得的wpre拷贝数如表4所示。具体实验步骤简述于下。[0085]通过转座子系统在293t细胞基因组中稳定插入目的核苷酸片段实验流程简述如下。在37℃和5％co2条件下培养293t细胞(atcc，crl3216)，培养基为补充有10％fbs(excell，11h116)的dmem完全培养基(dmem(sigam，d6429)。以8e+05细胞/孔将293t细胞接种在6孔板(corning，3516)中。在培养24小时后，根据如“molecμlarcloning:alaboratorymanual(fourthedition)chapter15,michaelr.green,coldspringharborlaboratorypress,2012”中所述的磷酸钙转染方法制备转染试剂，并将200μl含0.12mol/l氯化钙，1xhepes缓冲液和5.5μg总质粒的转染试剂添加到各孔中。利用磷酸钙以5:1的摩尔比共转染转座子质粒和转座酶质粒，转座子和转座酶的质粒编号如表4所示。在转染24小时后，将培养基换成含有2.5μg/ml嘌呤霉素(aladdinp113126)的新鲜dmem完全培养基。在抗生素压力下进行连续至少3代筛选直至细胞稳定生长。之后，根据相同的实验方法，将以上构建的细胞用第二转座子质粒及其相应的转座酶质粒共转染，并且在含有200μg/ml潮霉素(shenggonga600230-0001)的dmem完全培养基中至少培养三代。[0086]通过荧光素酶检测试剂盒检测各细胞系的荧光素酶活性实验流程简述如下。以1e+04细胞/孔将各细胞系接种到96孔板(corning3916)中，每种细胞接种复孔。培养48小时后，使用荧光素酶测定系统(promega，e2610)试剂盒并根据使用说明(promega，fb037)检测各孔的相对荧光素酶单位(rlu)，检测仪器为荧光微孔板读数计(perkinelmervictorⅴ)。[0087]通过qpcr测量各细胞系wpre拷贝数的实验流程简述如下。收集以上各细胞系每种1.0e+06个细胞，并根据基因组dna纯化试剂盒(tiangen，dp304-03)的使用说明提取基因组gdna。使用试剂盒中的洗脱缓冲液将纯化后的gdna调节至50ng/μl。将质粒06.01.2141用去离子水稀释至47.9ng/μl(对应5.0e+09拷贝数/μl)作为wpre的标准品，并将此标准品进一步稀释至8.0e+06拷贝数/μl。再将此8e+06拷贝数/μl标准品以两倍连续梯度稀释至1.5625e+04拷贝数/μl，并将此9个连续稀释的样品用作wpre序列的标准曲线样品。将1μl各细胞系的gdna样品和qpcr标准曲线样品添加至taqmanprobeqpcr试剂混合物中，并用水补足至20μl，其中所述qpcr试剂包含10μlnovostartprobeqpcrsupermix和0.4μlroxi染料(novoproteinscientificinc.,e091-01a)，以及0.4μl浓度为10um的wpre-taqman-f正向引物和wpre-taqman-r反向引物和0.4μl浓度为10μm的wpre-probetaqman探针(由generalbiosystems(anhui)co.,ltd.合成)，引物和探针的具体信息如以上表2所示，其中正向和反向引物以及wpre的探针分别为seqidno:130，seqidno:131和seqidno:132。在abi7900实时pcr检测仪上以aq程序和如下步骤进行pcr反应：95℃5分钟，95℃30秒-60℃30秒-72℃30秒40个循环，60℃30秒。基于标准曲线和样品的ct值计算各样品中wpre片段的拷贝数浓度(拷贝数/μl)，然后按照每个细胞含有6pg基因组dna计算每细胞含有wpre片段的拷贝数(拷贝数/细胞)。[0088]表4总结了通过不同转座子组合构建的双抗性细胞系的荧光素酶活性rlu和wpre的插入拷贝数。仅通过单一转座子构建的细胞系的平均荧光素酶活性和wpre插入拷贝数分别为2.67e+05rlu和3.12拷贝数(wpre)/细胞。能获得的最佳细胞的荧光素酶活性和wpre插入拷贝数分别为5.11e+05rlu和5.14拷贝数(wpre)/细胞。使用本公开描述的双转座子方法构建细胞系的平均荧光素酶活性和wpre插入拷贝数分别增加至4.45e+05rlu和5.83拷贝(wpre)/细胞，提高了66.62％和87.10％。能获得的最佳细胞的荧光素酶活性和wpre插入拷贝数分别为8.12e+05rlu和12.04拷贝数(wpre)/细胞。而使用同种转座子系统通过两次瞬时转染及抗性筛选所构建的细胞系的荧光素酶活性和wpre插入拷贝数都略差于同种转座子系统瞬转一次构建的细胞系，其荧光素酶活性和wpre插入拷贝数分别为2.36e+05rlu和2.80拷贝数(wpre)/细胞。使用双专座子系统构建的细胞系比使用其中任意一个单转座子系统构建的细胞系在荧光素酶活性和wpre插入拷贝数上都有显著提高。另外，tol1、tol2、zb转座子、intruder转座子、tcbuster、yabusame-1、uribo2、sleepingbeauty和piggybac转座子系统有较高的活性。使用以上转座子系统组合构建的细胞系(共36条细胞)的平均荧光素酶活性和wpre插入拷贝数分别为5.47e+05rlu和7.53拷贝数(wpre)/细胞，比单独使用这9种转座子系统构建细胞系的平均荧光酶活性(3.19e+05rlu)和平均wpre插入拷贝数(3.92拷贝/细胞)分别提高了71.36％和92.08％。[0089]选择上述实验中第二转座子系统使用piggybac转座子系统(06.01.1757和06.01.2429)的13种细胞系并使用sleepingbeauty转座子系统(06.01.1807和06.01.3335)做为第三种转座子系统将bsd(r)-hpgk-luciferase-ires-egfp-wpre目的核苷酸片段插入到上述细胞的基因组中(如表5所示)。细胞培养，质粒转染，抗生素选择，荧光素酶测定和wpre拷贝数的qpcr量化的实验操作如上所述。使用3ug/ml杀稻瘟菌素s(shanghaimaokangbiotechnology，cat.no.#ms0007)筛选bsd阳性细胞。荧光酶素活性和wpre基因组插入拷贝数的结果如表5所述。通过三转座子系统构建的细胞系的平均荧光素酶活性和wpre插入拷贝数分别为7.22e+05rlu和9.46拷贝(wpre)/细胞。最优细胞系的荧光素酶活性和wpre插入拷贝数分别为9.52e+05和12.76拷贝(wpre)/细胞，比通过sb和pb双转座子系统构建的细胞系的平均荧光素酶活性和wpre插入拷贝数(6.04e+05和7.89拷贝(wpre)/细胞)分别高57.72％和61.75％。[0090]表4：使用双转座子系统的基因插入拷贝数和靶基因活性测试[0091][0092][0093][0094][0095]表5：使用三转座子系统的基因插入拷贝数和靶基因活性测试[0096][0097][0098]实施例3：使用多转座子系统构建慢病毒稳定生产细胞系[0099]复杂细胞系的构建通常需要对宿主细胞进行多个修饰和筛选步骤，包括插入多个目的核苷酸片段，调节插入的多个目的核苷酸片段的插入比率，对之前修饰过的细胞进行后续修饰。本发明的发明人证明，本公开中所述的方法能够有效地以明显更高的拷贝数在宿主细胞基因组中插入多个目的核苷酸片段，并且能够有效地调节插入的多个目的核苷酸片段的插入比例。病毒载体稳定生产细胞系的构建通常需要分两步插入多段核苷酸片段：首先将编码病毒包装蛋白的核苷酸片段插入宿主细胞；然后将具有包装信号序列的且含有目的序列的核苷酸片段插入上一步中构建的包装细胞系从而构建生产细胞系。以下实施例以病毒载体稳定生产细胞系的构建为例进一步证明多转座子系统在宿主细胞系基因组中插入多目的核苷酸片段的有效性。本公开中所述的方法能够显著提高构建的慢病毒稳定生产细胞系的产毒产量。本领域技术人员可以理解，本公开中公开的方法同样可以适用于构建其他涉及插入多个目的核苷酸片段的复杂细胞系。[0100]在本实施例中，首先通过第一转座子系统将用于慢病毒包装的rev(seqidno:97)，vsv-g(seqidno:98)，gag/pol(seqidno:96)的表达盒以及用于调控其表达的激活物rtta和阻遏物cymr蛋白的编码序列(seqidno:99)稳定整合到293t细胞的基因组中以构建慢病毒(lv)包装细胞系。然后，通过不同于第一转座子系统的第二转座子系统将携带目的核酸片段的慢病毒基因组转录盒(seqidno:100，具有hpgk-luciferase-ires-egfp序列，其仅是作为目的核酸片段的一个实例，本领域技术人员可以预期使用类似方法可以构建任何其他目的核酸序列)整合到以上构建的lv包装细胞系的基因组中从而构建慢病毒生产细胞系。seqidno:99上的潮霉素抗性基因用于lv包装细胞系的筛选，seqidno:100上的嘌呤霉素抗性基因用于lv生产细胞系的筛选。在抗生素筛选后，将获得的lv生产细胞系培养并用dox(1μg/ml，盐酸多西环素，sangonbiotech(shanghai)，a600889)和cumate(200μg/ml，aladdin，i107765)诱导以用于慢病毒生产。将上述使用不同转座子系统组合构建的生产细胞系诱导后生产的慢病毒转导ht1080细胞，之后通过荧光素酶活性测量来自不同生产细胞系的转导滴度。本实施例描述了通过首先使用第一转座子系统整合rev，vsvg，gag，pol，然后通过第二转座子系统整合携带目的核酸片段的慢病毒基因组转录盒来构建lv生产细胞系的方法，本领域技术人员可以预期其他组合，即，可以通过第一转座子系统整合rev，vsvg，gag，pol和携带目的核酸片段的慢病毒基因组转录盒中的任意一个或多个，然后通过第二转座子系统整合剩余项。本领域技术人员还可以预期通过三种，四种，五种或甚至超过五种转座子系统来整合上述rev，vsvg，gag，pol及携带目的核酸片段的慢病毒基因组转录盒。[0101]具体实验过程简述如下。以1.5e+06细胞/培养皿将293t细胞接种到60mm培养皿中并在37℃和5％co2条件下用3mldmem完全培养基培养24小时。根据pei法转染细胞：在转染期间将500μl转染试剂添加至各60mm培养皿，转染试剂包含5.6μg总质粒。在5.6μg质粒中，携带gag/pol，rev，vsvg和rtta/cymr的转座子质粒分别为3.5μg，0.4μg，0.5μg和0.7μg；携带第一转座酶基因的质粒为0.5μg。以4:1的质量比将peimax(polysciences，24765-1)与质粒混合，并且在将所有混合物孵育15分钟后将混合物添加至细胞。24小时后，培养基替换为补充有200μg/ml潮霉素的dmem完全培养基。在该条件下将细胞连续培养至少3代直至细胞系稳定。之后，通过第二转座子系统将含有goi的慢病毒基因组转录盒整合到各包装细胞系中。再次根据pei法转染细胞，在转染期间将500μl转染试剂添加至各60mm培养皿，转染试剂包含4.3μg总质粒，其中具有4.0μg转座子质粒和0.3μg转座酶质粒。以4:1的质量比将peimax(polysciences，24765-1)与质粒混合，并且在将所有混合物孵育15分钟后将混合物添加至细胞。24小时后，培养基替换为补充有2.5μg/ml嘌呤霉素的dmem完全培养基。在该条件下将细胞连续培养至少3代直至细胞系稳定。表6概述了本实施例中所使用的质粒的组合。使用单个转座子系统的lv生产细胞系构建被用作对照。使用单个转座子质粒但没加转座酶质粒的细胞做为阴性对照。如前所述，以1.5e6细胞/培养皿将293t细胞接种到60mm培养皿中并在37℃和5％co2在3mldmem完全培养基中培养24小时。根据pei法转染细胞：在转染期间将500μl转染试剂添加至各60mm培养皿，转染试剂包含9.9μg质粒。在9.9μg质粒中，携带gag/pol，rev，vsvg，rtta/cymr和包含goi的病毒转录盒的转座子质粒分别为3.5μg，0.4μg，0.5μg，0.7μg和4.0μg；携带转座酶基因的质粒为0.8μg(阴性对照使用06.01.1812质粒代替携带转座酶基因的质粒)。以4:1的质量比将peimax(polysciences，24765-1)与质粒混合，并且在将所有混合物孵育15分钟后将混合物添加至细胞。24小时后，培养基替换为补充有2.5μg/ml嘌呤霉素的dmem完全培养基。在该条件下将细胞连续培养至少3代直至细胞系稳定。[0102]通过ht1080细胞转导后的荧光素酶测定检测稳定慢病毒生产细胞系的产毒能力。简言之，以8e+05细胞/孔将表6和表7中的各细胞系分别接种到6孔板(corning3516)中并在37℃和5％co2条件下在dmem完全培养基中培养。在培养24小时后，将培养基替换为含诱导剂1μg/mldox(盐酸多西环素，sangonbiotech(shanghai)，a600889)，200μg/mlcumate(aladdin，i107765)和5mmol/l丁酸钠(sigma，303410)的dmem完全培养基，以诱导产毒。48小时后，收集含慢病毒的培养基并以14000rpm离心10分钟以收集病毒上清。在收获病毒样品前24小时，以1e+04细胞/孔在96孔板(corning3916)中接种ht1080细胞并在dmem完全培养基中培养24小时。在ht1080细胞中添加病毒样品前1小时，将ht1080细胞的培养基替换为含8μg/mlpolybrene(sigam，h9268)的dmem完全培养基。之后，将50μl病毒样品添加至上述96孔板的各孔中。继续培养48小时后，使用荧光素酶测定系统(promega，e2610)试剂盒并根据使用说明(promega，fb037)检测各孔的相对荧光素酶单位(rlu)，检测仪器为荧光微孔板读数计(perkinelmervictorⅴ)。通过荧光素酶测定测量的不同慢病毒生产细胞系的病毒滴度结果概述在表6和表7中。[0103]由表6和表7可见，通过双转座子系统构建的生产细胞系的病毒滴度(平均滴度为7.94+05tu(rlu)/ml)显著高于通过单个转座子系统构建的细胞系的病毒滴度(平均滴度为1.94e+04tu(rlu)/ml)。阴性对照细胞系产毒滴度平均值为6.25e+02接近荧光素酶检测背景值。此外，由下表6和7可见，使用tol1、tol2、zb转座子、intruder转座子、tcbuster、yabusame-1、uribo2、sleepingbeauty和piggybac转座子系统的组合构建的慢病毒生产细胞系的产毒能力显著高于其他组合，由以上转座子系统组合构建的生产细胞系的产毒滴度平均值为1.87e+06tu(rlu)/ml。[0104]表6：使用双转座子系统构建慢病毒稳定生产细胞系[0105][0106][0107][0108][0109][0110]表7：使用单转座子系统构建慢病毒稳定生产细胞系[0111][0112][0113]本公开的上述实施例仅是为了清楚说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术用户来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12